用于细胞培养的泊洛沙姆的制作方法

用于细胞培养的泊洛沙姆
1.本发明涉及泊洛沙姆作为细胞培养基添加剂的用途。所述泊洛沙姆适用于泡沫减少以及剪切保护。
2.发明背景
3.泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188，用于许多工业应用、化妆品和药物。它们还用于细胞培养基过程。添加泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188至细胞培养基显著改进细胞成活力。高细胞成活力对于最佳蛋白质生产是重要的。尚未充分理解泊洛沙姆改进细胞成活力的原因。据信泊洛沙姆减少剪切应力，并且以此方式保护细胞免于损伤。泊洛沙姆，作为一种非离子表面活性剂，可能在气泡/培养基界面处浓缩，以及能够阻止细胞附着至气泡，并且当气泡破裂时以此方式阻止细胞免于损伤。当气泡破裂时，它还可减少震动。一些出版物声称泊洛沙姆改进氧气从气体转移到液相中的速率，但其它出版物与这些发现相矛盾。还表明，泊洛沙姆可“修复”细胞膜中的小缺陷。
4.遗憾的是，泊洛沙姆188显著促进在鼓泡生物反应器中产生的泡沫的稳定。因此，泊洛沙姆188的非发泡或低发泡替代方案将是合乎需要的。
5.具有高环氧丙烷/环氧乙烷比率并因此高疏水性的泊洛沙姆已知是良好的去泡剂，如schmolka i.r.(schmolka,journal of the american oil chemists'society(1977),54(3),110-16)所述。泊洛沙姆101、181、182或184是这样的去泡泊洛沙姆的实例。但泊洛沙姆181由murhammer(d.w.murhammer,c.f.gochee,biotechnol.prog.1990,6,142-146)描述为对昆虫细胞有毒。泊洛沙姆105由murhammer(见上)描述为产生少于泊洛沙姆188的泡沫，并且不抑制昆虫细胞的细胞生长。murhammer假设在减少的泡沫形成和减少的聚合物长度之间的相关性。但也需要考虑到毒性问题。很多平均分子量大约2000的泊洛沙姆，例如泊洛沙姆105，对细胞有毒。
6.现在已经发现，某些泊洛沙姆满足关于毒性、泡沫形成和剪切应力保护的所有要求，与它们的分子量无关。对于细胞培养的理想合适性的要求是一定的ppo(聚环氧丙烷)嵌段长度与明确百分比的peo(聚环氧乙烷)部分的组合。已发现，ppo嵌段的分子量与最大泡沫高度相关。对于具有》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆，ppo嵌段的分子量越高，最大泡沫高度越高。还发现，具有》45％(w/w)的环氧乙烷百分比和聚环氧丙烷嵌段《700g/mol的泊洛沙姆非常适合在细胞培养中作为泊洛沙姆188的低发泡替代方案，这是因为它们作为剪切应力保护剂也表现良好并且通常是无毒的。
7.本发明因此涉及包含泊洛沙姆的细胞培养基，所述泊洛沙姆具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比。
8.在优选的实施方案中，ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
9.在优选的实施方案中，peo百分比在47和90％之间。
10.在非常优选的实施方案中，聚环氧乙烷百分比为75-90％(w/w)，并且ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
11.具有所述属性的泊洛沙姆在室温下可以是液体或固体，在非常优选的实施方案中泊洛沙姆在室温下是固体，使得它们可例如等同于其它干粉培养基成分被研磨和处理。
12.在优选的实施方案中，细胞培养基包含对于液体培养基计算的0.1-10g/l的量的泊洛沙姆。在非常优选的实施方案中，泊洛沙姆的量为对于液体培养基计算的0.5-2g/l。
13.在一个实施方案中，细胞培养基是化学成分明确的培养基。
14.在一个实施方案中，细胞培养基是干粉或干压实的培养基。
15.在另一个实施方案中，细胞培养基至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。
16.本发明还涉及一种用于培养细胞的方法，其中所述细胞在包含泊洛沙姆的液体培养基中培养，所述泊洛沙姆具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比。优选地，所述方法包括搅动和/或鼓泡。
17.在优选的实施方案中，ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
18.在非常优选的实施方案中，环氧乙烷百分比是75-90％(w/w)，并且ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
19.在优选的实施方案中，与其它方面相同但包含泊洛沙姆188而不是具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的细胞培养基相比，液体培养基中的消泡剂的量减少。
20.本发明还涉及一种用于减少搅动和/或鼓泡细胞培养中的泡沫形成的方法，其中所述细胞在包含泊洛沙姆的液体培养基中培养，所述泊洛沙姆具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，泡沫形成减少。
21.附图
22.图1和2显示毒性测定的结果。进一步的细节可见实施例1。
23.图3显示细胞成活力和泊洛沙姆中的％eo之间的相关性。进一步的细节可见实施例1。
24.图4和5显示在连续鼓泡期间的泡沫演变的结果。进一步的细节可见实施例2。
25.图6显示平均最大泡沫高度以及平均平台高度和泊洛沙姆中的聚环氧丙烷嵌段的分子量之间的相关性。进一步的细节可见实施例2。
26.图7显示对于不同浓度的泊洛沙姆65的泡沫演变。进一步的细节可见实施例2。
27.图8显示剪切应力测定的结果。进一步的细节可见实施例3。
28.图9显示对于泊洛沙姆79a用尺寸排阻色谱法(参见方法1)测定的分子量分布。mp表示特定泊洛沙姆的峰值分子量。
29.图10显示分批进料细胞培养的结果。进一步的细节可见实施例4。
30.定义
31.在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的组合物或方法步骤，因为它们可以改变。必须注意的是，如本说明书和随附权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，对于“泊洛沙姆”的提及包括多种泊洛沙姆等等。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。为本文描述的发明的目的定义以下术语。
32.本文使用的术语“生物反应器”是指支持生物活性环境的任何制造或改造的装置或系统。在一些情况下，生物反应器是在其中进行细胞培养过程的容器或罐，所述过程涉及生物体或从这样的生物体衍生的生化活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。常用的生物反应器通常是圆筒状的，尺寸范围从几升到几立方米，并且通常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器可含有由非钢材料制成的一次性成分，并且是一次性的。在一些实施方案中，其是一次性的袋，其中维持生物活性环境。取决于具体的过程，预期生物反应器的总体积可以是范围从100ml至达到10000升或更大的任何体积。
33.搅动细胞培养是通过在细胞培养期间持久地或一次或几次搅动在生物反应器中带有细胞的细胞培养基，在生物反应器中进行的细胞培养。
34.搅动可例如通过搅拌、摇动或振荡进行。在搅拌罐生物反应器中，根据容器的几何形状，可配置一个或几个叶轮。将根据过程的主要混合任务和要求选择搅拌器类型。
35.鼓泡细胞培养是其中将气体引入到生物反应器中的细胞培养。这通常用喷射器(亦称为鼓泡器或充气器)进行。
36.通常，在鼓泡细胞培养中，用喷射器将空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合物引入到生物反应器中。用于细胞培养过程的典型喷射器包括钻孔环喷射器、烧结微喷射器、开管喷射器和混杂形式。表面充气也有助于氧传递，但在规模放大过程中表面充气的影响降低。在哺乳动物细胞培养过程中搅拌器和喷射器类型均通常根据细胞的剪切灵敏度来选择(nienow,a.w.,2006.reactor engineering in large scale animal cell culture,cytotechnology,50(1-3),p.9)。
37.根据本发明的细胞培养基是通常通过向细胞提供至少一种营养物来维持和/或支持体外细胞生长和/或支持特定生理状态的任何组分混合物。它可以是复合培养基或化学成分明确的培养基。细胞培养基可包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分，或仅一些组分，使得单独添加进一步的组分。根据本发明的细胞培养基的实例是包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分的完全培养基，以及培养基补充剂或进料。在优选的实施方案中，细胞培养基是完全培养基、灌注培养基或进料培养基。完全培养基，亦称为基础培养基，通常具有6.7和7.8之间的ph。进料培养基优选地具有低于8.5的ph。
38.通常，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持生物反应器中的细胞生长。
39.进料或进料培养基是细胞培养基，其不是在细胞培养中支持初始生长和生产的基础培养基，而是在后期添加以防止营养物耗尽和维持生产阶段的培养基。与基础培养基相比，进料培养基可具有更高浓度的一些组分。例如，一些组分，例如营养物，包括氨基酸或碳水化合物，可以约5x、6x、7x、8x、9x、10x、12x、14x、16x、20x、30x、50x、100x、200x、400x、600x、800x或甚至约1000x的在基础培养基中的浓度，存在于进料培养基中。
40.哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞的体外生长的组分混合物。哺乳动物细胞的实例是人或动物细胞，优选地cho细胞、cos细胞、i vero细胞、bhk细胞、ak-1细胞、sp2/0细胞、l5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。
41.化学成分明确的细胞培养基是不包含任何化学成分不明确的物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成是已知的。化学成分明确的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含饲养细胞、血清、水解产物、提取物或消化物或其它不充分明确的组分。化学成分不明确或不充分明确的化学组分是这样的组分，其化学组成
和结构是未知的，以不同的组成存在，或仅能用巨量的实验工作确定——与蛋白质例如胰岛素、白蛋白或酪蛋白的化学组成和结构的评价相当。
42.粉状细胞培养基或干粉培养基是通常从研磨过程或冻干过程得到的细胞培养基。这意味着粉状细胞培养基是颗粒状的微粒培养基——不是液体培养基。术语“干粉”可与术语“粉末”互换使用；然而，本文使用的“干粉”仅仅是指颗粒状材料的总体外观，并且不意指该材料完全不含复合或聚集的溶剂，除非另外指明。
43.干颗粒状培养基是从湿法或干法制粒过程得到的干培养基，例如通过喷雾干燥、湿法制粒或干法压实，通常具有大于0.5mm，例如0.5和5mm之间的颗粒大小。干法压实通常在辊压机中进行。us 6,383,810 b2公开了生产湿颗粒状的真核细胞培养基粉末的方法。该方法包括用溶剂润湿干粉细胞培养基，然后重新干燥湿润的培养基以获得干颗粒状的细胞培养基。优选地，干颗粒状培养基是从干粉培养基的碾压得到的培养基。本文使用的术语“干”仅仅是指颗粒状材料的总体外观，并且不意指该材料完全不含复合或聚集的溶剂，除非另外指明。
44.对于在细胞培养中的用途，即用于培养细胞，将液体细胞培养基添加至细胞。因此，干粉或干法压实的细胞培养基溶于合适量的液体，例如水或水性缓冲液，以产生液体细胞培养基，其可与细胞接触。由于液体细胞培养基的组成是直接影响细胞的因素，因此细胞培养基的浓度通常以重量/升提供，例如mg/升，定义了待添加至细胞的液体培养基中的组分浓度。干粉或干法压实的培养基的成分的量需要调整，使得当溶于一定量的液体时，得到的液体培养基中组分的目标浓度得以实现。
45.待用根据本发明的培养基培养的细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或真核细胞，例如植物或动物细胞。细胞可以是正常细胞、永生化细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中任何一种可以是已建立或转化的细胞系或从自然来源获得。
46.根据药典的平均分子量使用邻苯二甲酸酐-吡啶溶液通过滴定来确定。
47.通过sec确定的平均分子量如下测定：
48.重量平均分子量：mw＝∑in
i m
i2
/(∑inimi)
49.数量平均分子量：mn＝∑in
i mi/(∑ini)
50.峰值分子量：m
p
＝在最大ni处的分子量
51.ni＝在级分i中聚合物物类的数量
52.mi＝在级分i中聚合物物类的分子量
53.sec条件：
54.校准标准：peg(细节见实施例，方法1)
55.洗脱液：thf
56.流速：1ml/min
57.注射体积：100μl
58.柱：颗粒大小＝5μm，材料＝苯乙烯-二乙烯基苯
59.温度：40℃
60.细胞培养基可以呈水性液体形式，或使用时溶于水或水性缓冲液的干粉形式。本领域技术人员能够选择合适的细胞培养基用于设想的特定目的。
61.根据本发明的细胞培养基，尤其是包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分的完全培养基，通常至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。它们也可另外包含化学成分明确的生物化学成分，例如重组蛋白，例如r胰岛素、rbsa、r转铁蛋白、r细胞因子等。
62.糖组分是所有单糖或二糖，例如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。
63.根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸，蛋白质源性氨基酸，特别是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及非蛋白质源性氨基酸，例如d-氨基酸，其中l-氨基酸是优选的。术语氨基酸进一步包括氨基酸的盐，例如钠盐，或各自的水合物或盐酸盐。
64.例如，酪氨酸意指l-或d-酪氨酸，优选地l-酪氨酸，以及其盐或水合物或盐酸盐。
65.维生素的实例是维生素a(视黄醇、视黄醛、各种类视黄醇和四种类胡萝卜素)、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸、烟酰胺)、维生素b5(泛酸)、维生素b6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素b7(生物素)、维生素b9(叶酸、亚叶酸)、维生素b
12
(氰钴胺素、羟基钴胺素、甲钴胺素)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d(麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素e(生育酚、生育三烯酚)和维生素k(叶绿醌、甲萘醌)。还包括维生素前体。
66.盐的实例是这样的组分，其包含无机离子，例如碳酸氢根、钙、氯离子、镁、磷酸根、钾和钠，或微量元素，例如co、cu、f、fe、mn、mo、ni、se、si、ni、bi、v和zn。实例是硫酸铜(ii)五水合物(cuso
4.
5h2o)、氯化钠(nacl)、氯化钙(cacl
2.
2h2o)、氯化钾(kcl)、硫酸铁(ii)、柠檬酸铁铵(fac)、无水磷酸二氢钠(nah2po4)、无水硫酸镁(mgso4)、无水磷酸氢二钠(na2hpo4)、氯化镁六水合物(mgcl
2.
6h2o)、硫酸锌七水合物。
67.缓冲液的实例是co2/hco3(碳酸盐)、磷酸盐、hepes、pipes、aces、bes、tes、mops和tris。
68.辅助因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素c、nad/nadp、钴胺素、黄素单核苷酸和衍生物、谷胱甘肽、血红素磷酸核苷酸和衍生物。
69.根据本发明的核酸组分是核碱基，例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，核苷，例如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷，以及核苷酸，例如一磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
70.与完全培养基相比，进料培养基可具有不同的组成。它们通常包含氨基酸、微量元素和维生素。它们也可包含糖组分，但有时为了生产原因，糖组分在单独的进料中添加。
71.许多生物药物生产平台基于分批进料细胞培养方案。目的通常是为了开发高滴度细胞培养过程，以满足日益增加的市场需求和降低制造成本。除了使用高性能重组细胞系之外，需要细胞培养基和过程参数的改进以实现最大生产潜力。
72.在分批进料过程中，基础培养基支持初始生长和生产，并且进料培养基防止营养物耗尽和维持生产阶段。选择培养基以适应不同生产阶段的不同代谢需求。过程参数设置，包括进料策略和控制参数，定义了适合细胞生长和蛋白质生产的化学和物理环境。
73.在灌注过程中，细胞培养基通过泵连续地从生物反应器中添加和去除，而细胞通过细胞保留装置保留在生物反应器中。灌注的优点是达到非常高的细胞密度(由于恒定的
培养基交换)的可能性，以及生产非常脆弱的重组蛋白的可能性，这是因为产物可以每天从生物反应器中去除，从而减少重组蛋白对高温、氧化还原电位或释放的细胞酶的暴露时间。
74.用于灌注细胞培养的方法通常包括在包含具有培养基入口和收获物出口的生物反应器的生物反应器系统中培养细胞，其中
75.i.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过培养基入口将新的细胞培养基添加到生物反应器中；
76.ii.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过收获物出口将收获物从生物反应器中去除。收获物通常包含由细胞生产的目标产物、细胞和液体细胞培养基。
77.泊洛沙姆是两亲聚合物，具有两个亲水嵌段和在中间的疏水嵌段。泊洛沙姆是聚乙二醇(peg)/聚丙二醇(ppg)三嵌段共聚物，其中一个ppg嵌段在两侧与peg嵌段相接。聚乙二醇(peg)部分通常亦称为聚环氧乙烷(peo)部分。聚丙二醇(ppg)部分通常亦称为聚环氧丙烷(ppo)部分。
78.通常用于细胞培养应用的泊洛沙姆，cas号9003-11-6，称为泊洛沙姆188并具有通式i
79.i
80.其中x和z优选独立地是75-85，并且y优选地是25-30。本发明的泊洛沙姆可在x＝z＝3-72和y＝5-12的范围内存在。
81.一些泊洛沙姆是市售可得的(或例如溶液、凝胶或固体，例如f-68)。
82.或者，泊洛沙姆可根据本领域已知的方法从原材料制备(参见，例如美国专利号3,579,465和3,740,421)。
83.关于泊洛沙姆的进一步的信息可见于hagers handbuch der pharmazeutischen praxis,volume9“stoffe p-z”,1994,第282-284页。
84.以下表1显示泊洛沙姆的实例。
85.所有列举的泊洛沙姆通过测定它们的环氧乙烷百分比(％eo)和它们的分子量分布来表征。％eo使用1h nmr测定。分子量分布使用尺寸排阻色谱法测定(参见实施例，方法1)。峰值分子量(m
p
)用于表征各聚合物。ppo嵌段的分子量(mw ppo)从m
p
和％eo计算。
86.表1
[0087][0088]
发明详述
[0089]
本发明的主旨是某些泊洛沙姆显示用于细胞培养的改进性质的研究结果。它们不仅提供如同泊洛沙姆188一样的剪切保护，而且显示减少的泡沫形成。合适的泊洛沙姆还对于培养的细胞而言是无毒的。
[0090]
泊洛沙姆188通常添加至细胞培养以防止由鼓泡和/或搅动引起的流体动力学应力。它减少表面张力，但也通常增加泡沫形成。因为细胞趋于粘附至气泡表面，它们随气泡上升至表面区域，陷入泡沫层中，并且死亡。现在已发现，使用具有不同组成的其它泊洛沙姆，有益的剪切应力保护性质可得到保持，但此外，泡沫形成减少。
[0091]
因此，当使用根据本发明的细胞培养基时，减少泡沫形成的消泡剂例如消泡剂c的量可减少或甚至省略。在优选的实施方案中，根据本发明的培养基含有更少、优选地少至少25％(w/w)、最优选少于一半的消泡剂(例如消泡剂c)的量，所述消泡剂的量用于在相同条件下以及相同的培养基的同等细胞培养，除了所述培养基不含本发明定义的泊洛沙姆而是含有泊洛沙姆188之外。消泡剂的实例优选地是包含聚二甲基硅氧烷(pdms)以及任选的二氧化硅颗粒的试剂，亦称为例如二甲硅油或西甲硅油，例如dow-corning q7-2587(o/w乳剂，含30.4％pdms、1.2-2.1％sio2颗粒)、来自sigma aldrich的消泡剂c(o/w乳剂，29.4％pdms、1.2-2.1％sio2颗粒)和来自gibco的foam away(在水中30％西甲硅油乳剂)。
[0092]
已鉴定为特别合适的泊洛沙姆是具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％、通常在
45％和95％之间、优选在45％和90％之间、最优选在75和90％之间(全部w/w)的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆。
[0093]
在优选的实施方案中，ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
[0094]
在非常优选的实施方案中，环氧乙烷百分比为75-90％(w/w)，并且ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
[0095]
本领域技术人员知道如何使用泊洛沙姆作为细胞培养基的成分。他知道合适的量和使用形式。通常，将泊洛沙姆作为细胞培养基的一部分应用至细胞培养。然而，它也可单独应用。
[0096]
泊洛沙姆通常以固体，例如颗粒，或液体，例如油或表现得像糊状物的高粘性液体，或水性溶液的形式存在。优选地，它以固体颗粒的形式存在。如果需要调整它的颗粒大小，它在添加至细胞培养基之前可任选地被研磨。
[0097]
根据本发明的细胞培养基是包含具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的细胞培养基。
[0098]
在优选的实施方案中，ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
[0099]
在非常优选的实施方案中，环氧乙烷百分比是75-90％(w/w)，并且ppo嵌段的分子量在300和700g/mol之间。
[0100]
在另一个优选的实施方案中，与不包含本发明的泊洛沙姆而是包含泊洛沙姆188的细胞培养相比，细胞培养基不包含消泡剂或包含减少量的消泡剂，优选地少于50％。
[0101]
在细胞培养基中泊洛沙姆的浓度优选地为对于液体培养基计算的0.1-10g/l。在非常优选的实施方案中，泊洛沙姆的量为对于液体培养基计算的0.5-2g/l。泊洛沙姆可以是一种类型的如上文定义的泊洛沙姆，或两种或更多种的如上文定义的泊洛沙姆的混合物。
[0102]
优选地，细胞培养基是干粉或干颗粒状培养基或液体培养基。在干培养基的情况下，在使用前将培养基溶于合适量的水或水性缓冲液中。
[0103]
本发明的细胞培养基可用于任何类型的细胞培养。细胞培养是细胞在其中培养的任何设置。细胞培养可在适合培养细胞的任何容器(container)中进行，例如培养皿、接触板、瓶、管、孔、容器(vessel)、袋、烧瓶和/或罐。优选地，其在生物反应器中进行。通常，容器在使用前被灭菌。培养通常通过在合适的条件，例如合适的温度、渗透压、通气、搅动等之下在水性细胞培养基中孵育细胞进行，所述条件从环境中限制外来微生物的污染。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞的生长/培养的合适孵育条件。
[0104]
因此，本发明还涉及用于培养细胞的方法，其中所述细胞在包含具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的液体培养基中培养。
[0105]
细胞培养可以是适合培养细胞的任何设置。优选地，它是分批、分批进料或灌注细胞培养。
[0106]
优选地，用于培养细胞的方法包括以下步骤：
[0107]
a)提供生物反应器；
[0108]
b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合；
[0109]
c)孵育步骤b)的混合物。
[0110]
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0111]
a)提供生物反应器；
[0112]
b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合；
[0113]
c)孵育步骤b)的混合物，
[0114]
其中细胞培养基，在该情况下为进料培养基，在整个时间中连续地或在步骤c)的细胞孵育时间内一次或几次被添加至生物反应器。
[0115]
进料培养基可以是根据本发明的细胞培养基，但它也可以是不包含泊洛沙姆的进料培养基。优选地，它不包含泊洛沙姆。
[0116]
在一个实施方案中，生物反应器是灌注生物反应器。灌注生物反应器是其中可进行灌注细胞培养的生物反应器。它包含在细胞培养期间通常关闭的生物反应器容器，在所述容器中的搅拌器，用于引入新鲜培养基的管线，用于从生物反应器去除包含细胞、液体培养基和目标产物的收获物流的收获物管线，以及在收获物管线中在收获物的液体部分可被收集的同时保留细胞的细胞保留装置。提供关于有利设置的细节的关于灌注细胞培养的综述可见于“perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing
–
a critical review”jean-marc bielser等,biotechnology advances 36(2018)1328
–
1340。
[0117]
在灌注过程中，细胞培养基通过泵连续地加入和从生物反应器中去除，同时通过细胞保留装置将细胞保留在生物反应器中。灌注的优点是达到非常高的细胞密度(由于恒定的培养基交换)的可能性和生产非常脆弱的重组蛋白的可能性，这是因为产物可以每天从生物反应器中去除，从而减少重组蛋白对高温、氧化还原电位或释放的细胞蛋白酶的暴露时间。
[0118]
在一个实施方案中，本发明的方法包括在包含具有培养基入口和收获物出口的生物反应器的生物反应器系统中培养细胞，其中
[0119]
i.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过培养基入口将新的根据本发明的细胞培养基添加到生物反应器中；
[0120]
ii.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过收获物出口将收获物从生物反应器中去除。收获物通常包含由细胞生产的目标产物、细胞和液体细胞培养基。
[0121]
与在相同条件下但用包含泊洛沙姆188而不是上文定义的泊洛沙姆的培养基进行的细胞培养相比，当使用根据本发明的细胞培养基时，培养显示同等性能和减少的泡沫形成。
[0122]
因此，本发明还涉及用于在搅动和/或鼓泡细胞培养中减少泡沫形成的方法，其中在包含具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的液体培养基中培养细胞，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，泡沫形成减少。
[0123]
本发明还涉及用于在搅动和/或鼓泡细胞培养中培养细胞的方法，其中在包含具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的液体培养基中培养细胞，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有聚环氧丙烷嵌段《700g/mol和》45％的环氧乙烷百分比的泊洛沙姆的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，液体培养基中的消泡
剂的量减少。优选地，消泡剂的量减少至少25％，优选地至少50％。
[0124]
上文和下文引用的所有申请、专利和出版物以及2020年10月21日提交的相应申请ep20203086.2的全部公开内容通过引用结合到本文中。
实施例
[0125]
方法1
[0126]
所有尺寸排阻色谱法(sec)测量如下进行：
[0127]
校准标准：peg(mp:430、982、1960、3020、6690、12300、26100和44000g/mol)
[0128]
洗脱液：thf
[0129]
流速：1ml/min
[0130]
注射体积：100μl
[0131]
柱：颗粒大小＝5μm，材料＝苯乙烯-二乙烯基苯
[0132]
温度：40℃
[0133]
检测器：折射率(ri)
[0134]
对于所有泊洛沙姆计算分子量分布曲线，并测定mp(峰最大值)(表1)。示例性的分布曲线显示在图9中，其显示对于泊洛沙姆79a用尺寸排阻色谱法测定的分子量分布。mp表示特定泊洛沙姆的峰值分子量。
[0135]
方法2
[0136]
在37℃下在水中泊洛沙姆的泡沫演变测量
[0137]
制备泊洛沙姆的水溶液
[0138]
以选择的浓度制备目标泊洛沙姆在milliq水中的溶液，然后通过辊式搅拌器搅拌或混合过夜，直到完全分散。溶液按重量制备。
[0139]
泡沫测量
[0140]
通过使用动态泡沫分析仪dfa 100(kr
ü
ss gmbh)测试泡沫演变。
[0141]
应用以下参数：
[0142]
流速(空气)：0.3l/min
[0143]
温度：37℃
[0144]
液体体积：15ml
[0145]
测量持续时间：60min
[0146]
高度照明：20％
[0147]
最小气泡面积：1200μm2[0148]
最大气泡面积：35mm2[0149]
最小直方图面积：0mm2[0150]
最大直方图面积：1mm2[0151]
将泊洛沙姆溶液倾入泡沫分析仪dfa 100的玻璃柱中。将溶液加热至37℃，因为这是生物反应器中使用的温度。开始气流，并在60分钟的时间范围内通过泡沫分析仪记录泡沫形成(泡沫高度、液体高度和泡沫结构)。在泡沫到达210mm的最大柱高度的情况下，自动停止气流以防止溢出。
[0152]
方法3
[0153]
毒性测定
[0154]
为了测定泊洛沙姆的毒性性质，用两种内部细胞系——cho-dg44和chozn，进行以下细胞培养毒性测定。在实验中测试之前，至少将两种细胞系传代到第5代。cho-220comp.(1.03687|merck kgaa；darmstadt,germany)，一种含有2g/l泊洛沙姆188的化学成分明确的细胞培养基，用作毒性测定的基础培养基。在cho-dg44细胞系的情况下，基础培养基补充有8mm l-谷胺酰胺(1.00286|cas 56-85-9|merck kgaa；darmstadt,germany)。基础培养基根据用户指南制备。以浓度4g/l制备各泊洛沙姆的原液。将原液溶解至少1小时。从基础培养基和原液制备泊洛沙姆浓度为1g/l的稀释液。通过使用25％盐酸(1.00316|merck kgaa；darmstadt,germany)和32％氢氧化钠溶液(1.05587|cas 1310-73-2|merck kgaa；darmstadt,germany)，将ph调节至7.0
±
0.1。测量渗透压，并用氯化钠(1.06400|cas 7647-14-5|merck kgaa；darmstadt,germany)调节至335
±
15mosmol/kg。通过使用0.22μm&filter units(merck kgaa；darmstadt,germany)过滤，将培养基灭菌。
[0155]
各实验的起始vcd为0.5x 106个活细胞/ml，体积为30ml。因此，将足够体积的细胞悬浮液(包括15x 106个活细胞)转移至50ml tpp生物反应器(tpp；trasadingen,switzerland)，并在1,200rpm和4℃离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬浮于30ml的特定培养基。在37℃、320rpm、5％co2和80％湿度下将细胞培养4天。在第0、1、2、3和4天测量vcd和成活力。按条件应用一式三份。
[0156]
在图1和图2中，成活力结果提供为平均值
±
标准偏差。对于第4天以它们的标准偏差报告vcd结果。
[0157]
方法4
[0158]
剪切应力测定
[0159]
为了研究在非常高的剪切速率下泊洛沙姆的保护性质，开发了以下剪切应力测定。
[0160]
cho-s细胞系用于该测定并至少传代到第5代以及最多到第25代，然后对其测试剪切保护。含有2g/l泊洛沙姆188并补充有8mm l-谷胺酰胺(1.00286|cas 56-85-9|merck kgaa；darmstadt,germany)的cellvento cho-220comp.(1.03687|merckkgaa；darmstadt,germany)用作传代培养基并根据用户指南制备。不含泊洛沙姆188并补充有6mm l-谷胺酰胺(1.00286|cas 56-85-9|merckkgaa；darmstadt,germany)的cellvento cho-220(1.03797|merckkgaa；darmstadt,germany)用作培养基基础。基础培养基根据用户指南制备。浓度为1g/l的泊洛沙姆188expert cell culture optimized(1.37097|lot 48854497711|cas 9003-11-6|merckkgaa,darmstadt,germany)用作阳性对照。使用浓度为1g/l和比率为99:1(m％)的p188 emprove和p407(16758|lot bcbv0465|cas 9003-11-6|sigma-aldrich,st.louis,u.s.a.)的混合物作为阴性对照(nc)。产生1g/l的各泊洛沙姆的原液。在称重并加入至培养基基础之后，将原液和对照溶解至少1小时。之后，通过使用25％盐酸(1.00316|merck kgaa；darmstadt,germany)和32％氢氧化钠溶液(1.05587|cas 1310-73-2|merck kgaa；darmstadt,germany)，将ph调节至7.0
±
0.1。测量渗透压，并且如果需要的话，用氯化钠(1.06400|cas 7647-14-5|merck kgaa；darmstadt,germany)调节至
335
±
15mosmol/kg。最后，通过使用0.22μm和filter units(merck kgaa；darmstadt,germany)过滤，将培养基灭菌。
[0161]
含有50ml总体积的250ml挡板摇瓶(corning；new york,u.s.a.)用作在350rpm的高摇动速度下产生剪切应力的测试容器。在挡板摇瓶中预填充46ml的特定培养基。按一式三份进行各实验。
[0162]
剪切应力测定以1.5x 106个活细胞/ml的vcd开始。因此，将包括75x 106个活细胞的所需体积的细胞悬浮液转移至50ml tpp生物反应器(tpp；trasadingen,switzerland)，并以1,200rpm和4℃离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬浮于4ml的特定培养基，之后将全部加入至已预填充在挡板摇瓶中的46ml特定培养基。在时间t＝0直接获得样品。随后测量vcd和成活力。在5％co2、37℃和350rpm下将挡板摇瓶孵育4小时。在摇动的每小时，测量vcd和成活力，持续4小时。
[0163]
在图8中，成活力结果提供为平均值
±
标准偏差。相对vcd(rvcd)结果计算为vcd
最后
和vcd
起始
的比率以及高斯误差传递。
[0164]
方法5
[0165]
分批进料细胞培养
[0166]
进行分批进料细胞培养以评价在培养期间泊洛沙姆的保护性能。使用chok1svd1细胞。在旋转管(tpp,art.no.87050)中以最终体积30ml在37℃和320rpm转速下进行培养。
[0167]
在开始分批进料之前，细胞在含有2g/l泊洛沙姆188的细胞培养基4cho(merck kgaa,103795)中培养。向此培养基中加入ht补充物100x(次黄嘌呤钠(10mm)和胸苷(1.6mm),life technologies,art.no.11067-030)和l-甲硫氨酸亚砜亚胺(sigma aldrich m5379)。
[0168]
在分批进料的第0天，在2000rpm下将细胞离心5分钟，然后重悬浮于不含泊洛沙姆188的4cho+ht中并合并。
[0169]
用0.2x106个细胞/ml，在不同条件下(各4个重复)接种chok1svd1细胞。对于各条件，使用不含泊洛沙姆188的细胞培养基4cho(merck kgaa,4.74000.9999)，并加入选择的泊洛沙姆以实现浓度1g/l。将溶液搅拌至少2小时，以允许完全分散。
[0170]
在第3、5、7和10天向细胞进料。
[0171]
从d3开始每日测量葡萄糖浓度。在整个发酵过程期间，按需要维持6g/l葡萄糖的连续进料。
[0172]
每日进行用vicell(beckman coulter)的vcd和成活力分析，以及通过使用cedex(bio ht analyzer,roche)的igg测定。
[0173][0174]
在图11中，vcd、成活力和igg生产力的结果提供为各条件的4次重复的平均值，并且误差棒是平均值的标准偏差。
[0175]
实施例1：毒性
[0176]
对于表1描述的泊洛沙姆，研究对cho细胞的毒性效果。毒性细胞测定描述于方法3。
[0177]
发现具有少于45％eo的泊洛沙姆对于两种细胞系cho-dg44和chozn是有毒的(图1和2)。它们加入至细胞培养导致细胞成活力显著降低。数据显示成活力与％eo明显相关。具有％eo《45的泊洛沙姆导致低成活力，并因此对cho细胞有毒(图3)。相反，加入具有％eo》45的泊洛沙姆导致成活力》90％。这些样品因此是无毒的。
[0178]
图1：泊洛沙姆对cho-dg44细胞系的毒性测定。从左至右以递增的eo百分比报告泊洛沙姆。以浓度1g/l(灰色条)测试泊洛沙姆，持续4天(重复数n＝3)。a.在第4天cho-dg44的vcd。黑色线表示0.5x106个活细胞/ml的起始vcd(t＝0)。b.在第4天cho-dg44的成活力。
[0179]
图2：泊洛沙姆对chozn细胞系的毒性测定。从左至右以递增的eo百分比报告泊洛沙姆。以浓度1g/l(灰色条)测试泊洛沙姆，持续4天(重复数n＝3)。a.在第4天chozn的vcd。黑色线表示0.5x106个活细胞/ml的起始vcd(t＝0)。b.在第4天chozn的成活力。
[0180]
图3：在细胞成活力和泊洛沙姆的％eo之间的相关性。
[0181]
实施例2：发泡
[0182]
研究所有无毒泊洛沙姆的发泡行为。实验设置描述于方法2。
[0183]
在水中0.25g/l(即250ppm)浓度的泊洛沙姆188的发泡行为在图4中报告。在50s内达到最大泡沫高度210mm(即泡沫分析仪柱高度)，并且由仪器自动停止测量以防止溢出。
[0184]
选择泊洛沙姆101作为阴性对照，并且如所期望的，在鼓泡时仅产生很少泡沫(图4)，并且在鼓泡停止后泡沫立即消失(数据未显示)。该行为与泊洛沙姆188明显相反。
[0185]
泊洛沙姆105由于其中等的疏水性(50％eo)，预期产生比泊洛沙姆101更多的泡沫，但比泊洛沙姆188更少的泡沫。令人惊讶的是，泊洛沙姆105的发泡行为最终非常类似于泊洛沙姆188。在44秒后达到最大泡沫高度(图4)。
[0186]
对于泊洛沙姆99、129、128、108、78、138和126在37℃下连续鼓泡期间的泡沫演变显示与泊洛沙姆188和105类似的发泡行为。在44-50秒后，达到最大泡沫高度210mm并且鼓泡停止。仅在泡沫衰减方面观察到差异，但泡沫衰减被认为与生物反应器无关，因为该过程在连续鼓泡下进行。
[0187]
在泊洛沙姆79a、79b、66、65、55、46和37的情况下，达到在190和60mm之间的泡沫高度，持续很短时间，但然后泡沫高度快速降低并且达到大约30-70mm的恒定高度(图5，表)。泡沫高度的降低和恒定泡沫水平(即平台高度)的形成可根据由于鼓泡导致的泡沫形成和由于排水和气泡聚结导致的泡沫衰减之间的平衡来解释。
[0188]
图5：在37℃下连续鼓泡期间具有不同疏水性和分子量的泊洛沙姆的泡沫演变(水溶液250ppm)。该图显示最大泡沫和平台高度。报告的曲线是从重复中选出的一次测量，作为各泊洛沙姆的趋势的代表。
[0189]
表2：最大泡沫高度和平台高度。在37℃的水中0.25g/l(250ppm)泊洛沙姆溶液。
[0190][0191]
与从文献中已知的相反，结果是ppo嵌段长度是影响发泡行为的关键参数。ppo嵌段的分子量与最大泡沫高度相关(图5和6，表2)。ppo嵌段的分子量越高，最大泡沫高度越高。
[0192]
图6：在平均最大泡沫高度以及平均平台高度和泊洛沙姆中聚环氧丙烷嵌段的分子量之间的相关性。
[0193]
对于具有ppo分子量《700g/mol的所有泊洛沙姆，观察到低发泡，而％eo可在45％和95％之间改变，并且在该范围内对发泡行为具有很少影响。
[0194]
较高的泊洛沙姆浓度导致更多泡沫产生。对于泊洛沙姆65作为实例，该现象显示于图7。泊洛沙姆65的发泡行为在4个不同浓度下测试：250、500、1000和2000ppm。最大泡沫高度和平台高度随着增加的泊洛沙姆浓度而增加。该证据显示比较相同浓度的不同泊洛沙姆的发泡行为是重要的。为了能够用动态泡沫分析仪dfa 100观察发泡行为的差异以及防止柱溢出，对于所有上述测量选择250ppm的浓度。以250ppm观察的发泡趋势与更高浓度下观察的那些相当。
[0195]
图7：在37℃下泊洛沙姆65水溶液的泡沫演变。测试了不同浓度。
[0196]
实施例3：剪切应力保护
[0197]
在剪切应力保护测定(参见方法4)中，测试了所有无毒和低发泡泊洛沙姆并与基准泊洛沙姆188比较(图8)。除了阴性对照，所有泊洛沙姆提供类似于泊洛沙姆188的对于cho细胞的足够剪切应力保护(图8a)。除了阴性对照，对于测试的所有泊洛沙姆观察到≥90％的非常好的成活力(图8b)。
[0198]
图8：泊洛沙姆对cho-s细胞系的剪切应力测定。从左至右以递增的eo百分比报告泊洛沙姆。以浓度1g/l测试泊洛沙姆，持续4小时(重复数n＝3)。在左侧显示阳性对照1g/l泊洛沙姆188(对角条纹，n＝32)。浓度为1g/l和比率为99:1(wt.％)的p188和p407用作阴性对照(nc)(垂直条纹，n＝32)。a.相对vcd：cho-s的相对vcd计算为比率vcd
最后
/vcd
起始
。虚线表
示相对接种物vcd(t＝0)。b.在4小时后cho-s的成活力(％)。
[0199]
实施例4：分批进料细胞培养
[0200]
进行分批进料细胞培养(参见方法5)以研究3种不同的泊洛沙姆(即75、69和49)与基准188相比的剪切应力保护性质。
[0201]
这些泊洛沙姆是低发泡和无毒的，如同类似分子量和乙氧基化程度的其它泊洛沙姆。泊洛沙姆75是液体的，并且具有53.6的乙氧基化程度，然而泊洛沙姆69和49是固体和更加亲水的，具有大约88％的％eo。与具有相当的亲水性的其它泊洛沙姆相比，泊洛沙姆49还具有更低分子量。作为固体和低发泡的，泊洛沙姆69和49对于在细胞培养基中实施特别有吸引力。
[0202]
对于所有四种条件，活细胞密度、成活力和igg生产力(图10)是类似的。三种定制的泊洛沙姆具有与泊洛沙姆188相当的性能，并且证实了足够作为剪切应力保护剂以支持细胞培养和抗体生产。
[0203]
图10：分批进料细胞培养结果。在旋转管中进行培养13天。在4cho细胞培养基中的所有泊洛沙姆溶液具有1g/l的浓度。a.在分批进料培养期间chok1svd1细胞的活细胞密度(vcd)。各个值是各条件的4次重复的平均值。误差棒是平均值的标准偏差。b.在分批进料培养期间chok1svd1细胞的成活力(％)。各个值是各条件的4次重复的平均值。误差棒是平均值的标准偏差。c.在分批进料培养期间chok1svd1细胞的igg生产力。各个值是各条件的4次重复的平均值。误差棒是平均值的标准偏差。