诱导性多能干细胞的改善的重编程、维持和保存的制作方法

本公开广泛涉及产生人诱导性多能干细胞(ipsc或ips细胞)的领域。更具体地，本公开涉及使用质粒载体的组合来以更高的效率和增加的可靠性获得具有期望特性的无足迹ipsc。

背景技术：

1、最初使用整合病毒系统表达关键转录因子来产生ipsc。逆转录病毒和慢病毒系统(包括多顺反子和诱导型系统)现在已经成功地用于ipsc产生。然而，由于插入诱变和ipsc分化后外源基因再活化的可能性引起的永久基因组变化可能对随后的药物筛选和通过这些方法产生的细胞的治疗应用提出潜在的问题。实际上，已经报道了使用相同病毒系统产生的ipsc克隆之间的显著差异，当作为分化的神经球移植时，啮齿动物中很大百分比的克隆形成肿瘤。研究表明，使用相同病毒方法产生的ipsc一旦分化就可能表现不同。异位基因整合位点的差异可导致转基因表达的不同插入诱变和表观遗传调控。对于包括整合系统的ipsc产生方法，可能需要衍生和筛选许多克隆以鉴定在多能和分化状态中均稳定的那些克隆。

2、在细胞疗法制造过程中的许多关键方面中，细胞扩增和深低温保藏已经被鉴定为所关注的关键领域，其中细胞活力和功能性在冻-融循环期间受到极大影响，并且来源于ipsc分化的效应细胞的体内细胞功效和存留在ipsc分化后的效应细胞扩增阶段期间受到复杂影响。

技术实现思路

1、鉴于上述内容，本领域实质上需要有效产生无足迹ipsc的同质群体，该无足迹ipsc优选地处于多能性的“初始”或“基态”状态，以及优选地处于限定的培养条件。多能性的“初始”或“基态”状态赋予ipsc包括但不限于高克隆性、可持续的自我更新、最小的自发分化和基因组异常，以及作为解离的单细胞的高存活率的质量。根据本公开的实施方案的方法和组合物，以及特别是新的培养基和质粒载体系统解决了这种需要并提供了细胞重编程领域中的其他相关优点。

2、通过使用使外源基因的存在降至最低以降低宿主基因组整合的可能性的有效但瞬时和暂时表达系统，本公开的目的是提供有效产生ipsc而不包含引入非多能细胞以诱导重编程的外源dna的方法和组合物。本公开的目的是提供一种组合质粒系统以有效地产生具有多能性和/或高克隆性的“初始”或“基态”状态的ipsc。具有基态多能性的ipsc能够实现单细胞解离的ipsc的长期存活和遗传稳定性，并且因此使得有可能产生适合于建库和操纵(诸如单细胞分选和/或耗竭、克隆ipsc靶向基因组编辑，和ipsc的同质群体的定向再分化)的克隆ipsc系。因此，本公开的另一个目的是提供产生单细胞衍生的ipsc克隆系或由其衍生的细胞的方法和组合物，所述ipsc克隆系或由其衍生的细胞在选择的位点处包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代，并且所述修饰在随后衍生的细胞中在分化、去分化、重编程、扩增、传代和/或移植后保留并保持功能性。

3、本技术的一个方面提供了一种用于诱导性多能干细胞(ipsc)产生的组合物(例如，fmm2)，所述组合物包含(i)tgfβ家族蛋白、(ii)rock抑制剂和(iii)mek抑制剂和wnt活化剂，其中所述组合物不包含tgfβ抑制剂，其中所述组合物在长期ipsc维持中有效地改善ipsc多能性和基因组稳定性。在一些实施方案中，所述长期ipsc维持包括一个或多个阶段，所述阶段包括：ipsc集落的单细胞解离、解离的ipsc的单细胞分选、ipsc单细胞克隆扩增、克隆ipsc主细胞库(mcb)深低温保藏、ipsc mcb的解冻和任选地所述ipsc mcb的附加深低温保藏-解冻循环；或者所述tgfβ家族蛋白任选地在ipsc集落的单细胞解离时，或在ipsc单细胞克隆扩增时，或在其间的任何阶段添加到所述组合物中；或者所述mek抑制剂和/或所述wnt活化剂的量为用于将非多能细胞重编程为所述ipsc的重编程组合物中使用的量的30％-60％。在一些实施方案中，所述tgfβ家族蛋白包含激活素a、tgfβ、nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者所述wnt活化剂包括gsk3抑制剂。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括t细胞；或者所述重编程组合物包含rock抑制剂、mek抑制剂、wnt活化剂、tgfβ抑制剂和任选的hdac抑制剂，其中所述tgfβ抑制剂和所述hdac抑制剂在重编程期间的特定阶段被包含在所述重编程组合物中。

4、在一些实施方案中，与没有接触所述组合物的ipsc相比，所述改善的长期ipsc多能性通过减少的多能性逆转或减少的自发分化来指示；并且与没有接触所述组合物的ipsc相比，所述改善的基因组稳定性通过更低的基因组异常倾向来指示。在一些实施方案中，所述改善的基因组稳定性包括减少或预防从对t细胞进行重编程获得的ipsc中的三体性或核型异常。在一些实施方案中，所述组合物还包含ipsc，任选地其中所述ipsc包含至少一种基因组编辑。

5、在一些实施方案中，所述ipsc维持还包括ipsc基因编辑以获得工程改造的ipsc池、工程改造的ipsc池的单细胞分选、工程改造的ipsc单细胞克隆扩增、克隆工程改造的ipsc主细胞库(mcb)深低温保藏、工程改造的ipsc mcb的解冻和任选地所述工程改造的ipsc mcb的附加深低温保藏-解冻循环；并且所述工程改造的ipsc包含至少一种基因组编辑。

6、在另一方面，本发明提供了一种用于诱导性多能干细胞(ipsc)产生的组合物(例如，frm2)，所述组合物包含(i)rock抑制剂、mek抑制剂和wnt活化剂；(ii)hdac抑制剂；和(iii)tgfβ抑制剂，其中所述组合物有效地改善非多能细胞的重编程以获得具有建立的多能性和改善的基因组稳定性的ipsc，并且任选地，其中将(i)、(ii)或(iii)添加到所述组合物中在所述非多能细胞的重编程期间对于提高的重编程效率是阶段特异性的。在一些实施方案中，所述非多能细胞的所述重编程包括一个或多个阶段，所述阶段包括：体细胞转染(第0天)、外源基因表达、异染色质增加、体细胞身份丧失和ipsc集落形成；或者所述hdac抑制剂的所述添加任选地在染色质重组时，或在约第2-3天(转染后)；或者所述tgfβ抑制剂的所述添加任选地在体细胞身份丧失时，或在约第6-8天(转染后)，其中重编程中的所述一个或多个阶段通过细胞形态学变化和/或标记基因谱来指示。

7、在一些实施方案中，所述hdac抑制剂包含丙戊酸(vpa)或其功能变体或衍生物；并且/或者所述wnt活化剂包括gsk3抑制剂。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括t细胞。在一些实施方案中，所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：mael、klf4、dnmt3l、dppa5、prdm14、fgf4、utf1、tfcp2l1和tbx3；并且/或者其中所述改善的基因组稳定性通过比在重编程期间没有接触所述组合物获得的ipsc更低的基因组异常倾向来指示；并且/或者所述提高的重编程效率通过重编程后ipsc池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的所述ipsc池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。

8、在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括对ipsc群体进行深低温保藏的步骤，其中所述ipsc与如本文所述的组合物(例如，frm2)接触，并且其中所述ipsc的多能性和基因组稳定性在深低温保藏期间得以维持；并且任选地，其中包含同质ipsc的所述ipsc群体从克隆ipsc单细胞扩增。

9、在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法还包括将单细胞ipsc克隆扩增以获得所述克隆ipsc群体的步骤，其中所述ipsc与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触，并且其中所述ipsc的多能性和基因组稳定性在扩增期间得以维持。

10、在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法还包括对解离的ipsc进行单细胞分选以获得单细胞ipsc克隆的步骤，其中所述ipsc与如本文所述的组合物(例如，fmm2)接触，并且其中所述ipsc的多能性和基因组稳定性在单细胞分选期间得以维持。

11、在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法还包括将ipsc集落解离成单细胞ipsc的步骤，其中所述ipsc与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触，并且其中所述ipsc的多能性和基因组稳定性在ipsc单细胞解离期间得以维持。

12、在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法还包括获得至少一个包含由对非多能细胞进行重编程产生的ipsc的集落的步骤。

13、在产生诱导性多能干细胞的方法的各种实施方案中，所述ipsc从体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程，或者其中所述ipsc从t细胞重编程。在各种实施方案中，所述多能性包括基态多能性；并且/或者所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：mael、klf4、dnmt3l、dppa5、prdm14、fgf4、utf1、tfcp2l1和tbx3；并且/或者所述基因组稳定性包括比在没有接触本文所述的组合物的所述步骤中的ipsc更低的基因组异常倾向。

14、在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法，其中所述方法包括(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；以及(ii)使步骤(i)后的所述细胞与本文所述的组合物(例如，frm2)接触足够长的时间，从而通过对所述非多能细胞进行重编程来产生至少一个包含ipsc的集落。在一些实施方案中，所述转移步骤包括向所述非多能细胞中引入：(i)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码ebna或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少oct4，或至少oct4、yap1、sox2和大t抗原(ltag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及(ii)以下项中的一者：(1)包含编码ebna的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)ebna mrna；和(3)ebna蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个第一质粒还共同包含编码sox2和klf中的一者或两者，或myc、lin28、esrrb和zic3中的一者或多者的多核苷酸。

15、在一些实施方案中，所述接触步骤还包括在rock抑制剂、mek抑制剂、wnt活化剂、hdac抑制剂和tgfβ抑制剂的存在下培养所述细胞。在特定实施方案中，所述接触步骤包括：(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含rock抑制剂、mek抑制剂和wnt活化剂的组合接触；(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与hdac抑制剂接触；以及(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与tgfβ抑制剂接触，从而产生至少一个包含ipsc的集落；其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者其中所述ipsc是无足迹的，具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括t细胞。在一些实施方案中，所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：mael、klf4、dnmt3l、dppa5、prdm14、fgf4、utf1、tfcp2l1和tbx3；并且/或者所述改善的基因组稳定性包括比来自没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程的ipsc更低的基因组异常倾向；并且/或者所述提高的重编程效率通过重编程后ipsc池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的ipsc池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。在一些实施方案中，所述改善的基因组稳定性还包括减少或预防从对t细胞进行重编程获得的ipsc中的三体性或核型异常。

16、在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(ipsc)的方法，其中所述方法包括：(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；(ii)使步骤(i)后的所述细胞与本文所述的组合物(例如，frm2)接触足够长的时间，从而产生至少一个包含ipsc的集落，其中建立所述ipsc的多能性和基因组稳定性；(iii)将步骤(ii)的所述ipsc集落解离成解离的ipsc，其中所述ipsc与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触；(iv)对解离的ipsc进行分选以获得一个或多个单细胞ipsc克隆，其中所述单细胞ipsc克隆与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触；以及任选地，(v)将所述单细胞ipsc克隆扩增成克隆ipsc群体，其中所述克隆ipsc群体与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触；以及任选地，(vi)对所述克隆ipsc群体进行深低温保藏，其中所深低温保藏的群体与本文所述的组合物(例如，fmm2)接触；其中所述ipsc的多能性和基因组稳定性在所述解离、分选、扩增、深低温保藏或解冻的步骤期间得以维持。在一些实施方案中，所述一种或多种重编程因子包含至少oct4。

17、在各种实施方案中，所述转移步骤(i)包括向所述非多能细胞中引入：(a)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码ebna或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少oct4，或至少oct4、yap1、sox2和大t抗原(ltag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及(b)以下项中的一者：(1)包含编码ebna的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)ebna mrna；和(3)ebna蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个第一质粒还共同包含编码sox2和klf中的一者或两者，或myc、lin28、esrrb和zic3中的一者或多者的多核苷酸。

18、在一些实施方案中，所述接触步骤(ii)还包括在rock抑制剂、mek抑制剂、wnt活化剂、hdac抑制剂和tgfβ抑制剂的存在下培养所述细胞。在特定实施方案中，所述接触步骤(ii)还包括：(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含rock抑制剂、mek抑制剂和wnt活化剂的组合接触；(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与hdac抑制剂接触；以及(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与tgfβ抑制剂接触，从而产生至少一个包含ipsc的集落；其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者其中所述ipsc具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。在一些实施方案中，所述方法还包括：(1)使所述分选步骤(iv)、扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)的所述细胞与rock抑制剂、mek抑制剂和wnt活化剂接触，其中所述mek抑制剂和所述wnt活化剂中的一者或两者的浓度为步骤(ii)中的浓度的30％-60％；以及(2)另外使所述扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)和/或分选步骤(iv)的所述细胞与tgfβ家族蛋白接触；并且其中步骤(iii)、(iv)、(v)和(vi)中的所述细胞不与tgfβ抑制剂或hdac抑制剂接触。

19、在各种实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括t细胞。在一些实施方案中，所述多能性包括基态多能性；并且/或者所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：mael、klf4、dnmt3l、dppa5、prdm14、fgf4、utf1、tfcp2l1和tbx3；并且/或者所述ipsc包含至少一种基因组编辑；并且/或者所述基因组稳定性包括更低的基因组异常倾向。在一些实施方案中，所述基因组稳定性还包括减少或预防从对t细胞进行重编程获得的ipsc中的三体性或核型异常。

20、在一些实施方案中，所述方法还包括对ipsc进行基因编辑以获得工程改造的ipsc池、工程改造的ipsc池的单细胞分选、工程改造的ipsc单细胞克隆扩增、克隆工程改造的ipsc主细胞库(mcb)深低温保藏、工程改造的ipsc mcb的解冻和任选地所述工程改造的ipsc mcb的附加深低温保藏-解冻循环；并且其中所述工程改造的ipsc包含至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，基因组编辑导致b2m、tap1、tap2、tapasin、nlrc5、pd1、lag3、tim3、rfxank、citta、rfx5或rfxap的缺失或减少的表达；或ipsc或ipsc衍生效应细胞中hla-e、hla-g、cd16、4-1bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd137、cd80、pdl1、a2ar、car、tcr、衔接子或衔接子的表面触发受体的引入或增加的表达。

21、在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含诱导性多能细胞(ipsc)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其中所述ipsc与rock抑制剂、mek抑制剂、wnt活化剂和tgfβ家族蛋白的组合接触，并且其中所述ipsc包含增加的初始特异性基因表达，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：mael、klf4、dnmt3l、dppa5、prdm14、fgf4、utf1、tfcp2l1和tbx3；并且任选地，所述ipsc具有以下特性中的至少一者：高克隆性、遗传稳定性和基态多能性。在一些实施方案中，所述tgfβ家族蛋白包含激活素a、tgfβ、nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者其中所述wnt活化剂包括gsk3抑制剂。在一些实施方案中，所述ipsc通过对非多能细胞进行重编程来产生。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者其中所述非多能细胞包括t细胞。在一些实施方案中，所述ipsc包含至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，所述组合物还包含培养基，其中所述培养基是无饲养层的。

22、在另一方面，本发明提供了一种诱导性多能细胞(ipsc)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其通过本文所述的任何方法产生。在一些实施方案中，所述ipsc包含至少一种基因组编辑。

23、在另一方面，本发明提供了一种衍生的非天然细胞或其群体，其从本文所述的多能细胞或细胞系的体外分化获得。在一些实施方案中，所述细胞是免疫效应细胞，并且任选地，所述免疫效应细胞包含所述ipsc中包含的至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，所述细胞包括cd34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞、b细胞或免疫调控细胞。在一些实施方案中，所述细胞是包含至少一种以下特性的再生细胞：异染色质的总体增加；改善的线粒体功能；增加的dna损伤应答；端粒延长和短端粒百分比的降低；衰老细胞的分数降低；以及与其天然细胞对应物相比更高的增殖、存活、存留或记忆样功能的潜力。

24、在另一方面，本发明提供了一种用于制造应用于基于细胞的疗法的多能细胞的组合物，其中所述组合物包含通过本文所述的方法产生的多能细胞。在一些实施方案中，所述多能细胞是同种异体的或自体的。在另一方面，本发明提供了一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含通过本文所述的方法获得的多能细胞。在另一方面，本发明提供了一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的诱导性多能细胞或本文所述的衍生的非天然细胞。

25、本技术的再另一个方面提供了一种用于在非多能细胞中启动重编程的体外系统，其中所述系统包括：一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码ebna或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码oct4、yap1、sox2和ltag的多核苷酸；以及任选地以下项中的一者：(1)包含编码ebna的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸，(2)ebna mrna，和(3)ebna蛋白。在一些实施方案中，所述系统的所述第二质粒具有高丧失率；并且其中所述第二质粒对ebna的表达是短暂的、瞬时的和暂时的。在一些其他实施方案中，所述系统不在细胞核中提供ebna复制和/或连续表达。在一个实施方案中，所述系统可以能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行ebna的瞬时/细胞质表达。在一些实施方案中，所述系统能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行包含在所述第一质粒中的一种或多种重编程因子的瞬时/细胞质表达。

26、在所述系统的一个实施方案中，第一质粒的所述复制起点是选自由多瘤病毒科病毒、乳头瘤病毒科病毒和γ疱疹病毒亚科病毒组成的组的复制起点。在一些实施方案中，所述复制起点是选自由sv40、bk病毒(bkv)、牛乳头瘤病毒(bpv)或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)组成的组的复制起点。在一个特定实施方案中，所述复制起点对应于或来源于ebv的野生型复制起点。在一些其他实施方案中，所述系统中的所述第二质粒的所述ebna是基于ebv的。在一些实施方案中，所述系统提供了一个或多个第一质粒共同包含编码重编程因子的多核苷酸，所述重编程因子包含(i)nanog、klf、lin28、myc、ecat1、utf1、esrrb、hesrg、cdh1、tdgf1、dppa4、dnmt3b、zic3和l1td1中的一者或多者；或(ii)myc、lin28、esrrb和zic3。在一些实施方案中，所述编码重编程因子的多核苷酸包含在第一质粒中的多顺反子构建体或非多顺反子构建体中。在多顺反子构建体的一个实施方案中，其包含单个开放阅读框或多个开放阅读框。在系统包括两个或更多个第一质粒的实施方案中，每个第一质粒可包含由多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在一些实施方案中，所述系统包括四个第一质粒，每个第一质粒包含由所述多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在系统包括四个第一质粒的实施方案中，每个第一质粒包含分别编码oct4和yap1、sox2和myc、lin28和ltag以及esrrb和zic3的多核苷酸的至少一个拷贝。

27、在所述系统的一些实施方案中，所述第一质粒包含多于一种编码重编程因子的多核苷酸，其中所述相邻多核苷酸通过编码自切割肽或ires的接头序列能够操作地连接。在一个实施方案中，所述自切割肽是2a肽，选自包含f2a、e2a、p2a和t2a的组。在另一个实施方案中，包含在第一质粒构建体中的所述2a肽能够是相同或不同的。在所述系统的所述质粒包含多个2a的另一实施方案中，相邻位置的两个2a肽是不同的。在所述系统的一些其他实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自包含用于表达重编程因子和ebna的一个或多个启动子，并且所述一个或多个启动子包含cmv、ef1α、pgk、cag、ubc和组成型、诱导型、内源调控型或时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的其他合适启动子中的至少一者。在一个实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自包含cag启动子。

28、在一个方面，本公开提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文公开的一种或多种组合物，诸如(i)用于ipsc产生的第一组合物和用于ipsc产生的第二组合物，和/或(ii)用于ipsc产生的第一组合物和用于ipsc维持的第二组合物。还提供了包含如本文所述的体外系统的试剂盒。

29、通过结合附图进行的以下描述，本发明方法和组合物的使用的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施方案。