本发明涉及经工程化改造以表现出改进的重组丝氨酸蛋白酶，以及包含这些新型丝氨酸蛋白酶的细胞和生物体。还提供了使用重组丝氨酸蛋白酶改进植物健康或生长的方法。
背景技术：
1、植物寄生虫和病原体是经济作物产量损失的主要原因，导致了巨大的经济损失。通过种子、叶片或土壤处理用微生物处理植物可通过向植物或周围土壤提供外源蛋白质来改进植物健康。由于丝氨酸蛋白酶的表达，某些细菌菌株保护植物免受害虫(如植物寄生线虫和真菌植物病原体)的侵害。丝氨酸蛋白酶在蛋白质的特异性识别位点内的丝氨酸残基处裂解肽键，并且已经显示出降解线虫的肠组织以及具有对某些真菌特异的抗真菌活性。本领域持续需要开发新型微生物组合物和方法，其可用于在各种农业田间环境中进一步改进作物植物生长和产量。
技术实现思路
1、一方面，本发明提供了重组dna分子，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核酸序列。所述多肽可在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、或可在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、或可在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或可包含这三个残基中任一种的保守置换，且包含相对于seq id no：1的至少第一个氨基酸残基缺失。在某些实施方案中，所述多肽可在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸，且可在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸，且可在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸，或可包含这三个残基中任意或全部的保守置换。
2、在一些实施方案中，由所提供的重组dna分子编码的多肽可包含对应于seq idno：1的残基177-243中任何的至少一个残基的氨基酸缺失、或包含对应于seq id no：1的残基181-240中任何的至少一个残基的氨基酸缺失。在一个实施方案中，氨基酸缺失对应于少于seq id no：1的残基181-240中的所有残基。在另一个实施方案中，编码的多肽可包含至少对应于seq id no：1的残基226-241的残基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基182-211的残基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基178-243的残基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基178-240的残基的氨基酸缺失。编码的多肽可具有以下任一种序列：seq id nos：2或4-13。
3、由本发明的重组dna分子编码的多肽与seq id no：1的多肽相比可表现出丝氨酸蛋白酶活性增加，或与seq id no：1的多肽相比可表现出杀线虫活性增加或抗真菌活性增加。编码的多肽与seq id no：1的多肽相比还可表现出底物结合力相同或增强。编码的多肽可进一步在对应于seq id no：1的残基122的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基123的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基124的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基125的残基处包含谷氨酰胺、在对应于seq id no：1的残基126的残基处包含酪氨酸、在对应于seq id no：1的残基146的残基处包含甲硫氨酸、在对应于seqid no：1的残基147的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基148的位置包含亮氨酸、在对应于seq id no：1的残基149的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基150的残基处包含甘氨酸，或包含这些残基中任一种的保守置换。
4、另一方面，本发明提供了由本文提供的重组dna分子编码的多肽。在某些实施方案中，所述多肽可包含选自seq id nos：2或4-13的序列，例如seq id nos：2、4-6或8-10中的任一种。
5、另一方面，本发明提供了dna构建体，其包含与启动子可操作地连接的本文提供的重组dna分子。
6、又另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文提供的重组dna分子。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如来自芽孢杆菌属(bacillus)的细菌宿主细胞，例如选自以下芽孢杆菌属的宿主细胞：炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(bacillus mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(bacillus pseudomycoides)、bacillus samanii、大山芽孢杆菌(bacillus gaemokensis)、韦氏芽孢杆菌(bacillus weihenstephensis)和东洋芽孢杆菌(bacillus toyoiensis)。还提供了包含宿主细胞和农业上可接受的载体的制剂。还提供了用本文公开的制剂处理的植物种子。
7、另一方面，提供了刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治线虫的方法，包括将本文提供的重组宿主细胞施用至植物生长介质、植物、植物种子、或植物或植物种子的周围区域。
8、另一方面，本发明提供了转基因植物细胞，其包含编码本文提供的多肽的重组dna分子，例如在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、或在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、或在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸，或包含这三个残基中任一种的保守置换，且包含相对于seq id no：1的至少第一个氨基酸残基缺失的多肽。
9、又另一方面，本发明提供了转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其包含编码本文提供的多肽的重组dna分子。本发明还提供了转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其表达或包含本文公开的多肽。
10、另一方面，本发明提供了转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的重组dna分子，其中所述多肽在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、且在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或包含这三个残基中任一种的保守置换。在另一个实施方案中，转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子表达或包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽在对应于seq idno：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、且在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或包含这三个残基中任一种的保守置换。在这些实施方案的一方面，所述多肽包含seq id no：1；另一方面，所述多肽包含seq id no：2；另一方面，所述多肽包含seq id nos：4-13中任何一个。
11、包含编码本文提供的多肽的重组dna分子的植物细胞、植物、植物部位和种子可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性。还提供了包含本文公开的重组dna分子的子代植物。
12、本文还提供了产生转基因植物的方法，包括用本发明的重组dna分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞，并使转化的植物细胞再生以产生转基因植物。所得的转基因植物可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性增强。
13、在另一方面，本发明提供了产生包含本文提供的重组dna分子的转基因植物的方法，包括将包含本发明的重组dna分子的转基因植物与其自身或另一种植物杂交以产生一株或多株子代植物，并选择包含所述重组dna分子的子代植物。子代植物可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性增加。
14、在某些方面，本发明提供了融合蛋白，其包含：a)靶向序列、孢子外壁蛋白(exosporium protein)或孢子外壁蛋白片段，其将融合蛋白靶向至重组芽孢杆菌属宿主细胞的孢子外壁；和b)本文提供的多肽。在一个实施方案中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段包含序列x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-x15-x16，其中：
15、x1是任何氨基酸或不存在；
16、x2是苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)；
17、x3是任何氨基酸；
18、x4是脯氨酸(p)或丝氨酸(s)；
19、x5是任何氨基酸；
20、x6是亮氨酸(l)、天冬酰胺(n)、丝氨酸(s)或异亮氨酸(i)；
21、x7是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；
22、x8是甘氨酸(g)；
23、x9是脯氨酸(p)；
24、x10是苏氨酸(t)或脯氨酸(p)；
25、x11是亮氨酸(l)或苯丙氨酸(f)；
26、x12是脯氨酸(p)；
27、x13是任何氨基酸；
28、x14是任何氨基酸；
29、x15是脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)或苏氨酸(t)；以及
30、x16是脯氨酸(p)、苏氨酸(t)或丝氨酸(s)。
31、在另一个实施方案中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段包含seq idno：14。
32、还提供了包含融合蛋白的重组宿主细胞，例如细菌宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含融合蛋白的来自蜡状芽孢杆菌家族成员的细菌宿主细胞。在本实施方案的一方面，蜡状芽孢杆菌家族成员是炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillus samanii、大山芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、或bacillustoyonensis。在本实施方案的特定方面，蜡状芽孢杆菌家族成员是苏云金芽孢杆菌。还提供了包含细菌宿主细胞的发酵产物，以及包含所述发酵产物和农业上可接受的载体的制剂。
33、另一方面，提供了刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治线虫的方法，包括将本文提供的制剂施用至植物生长介质、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。