生产邻氨基苯甲酸的重组宿主细胞的制作方法

本发明涉及生产邻氨基苯甲酸、特别是使用重组宿主细胞生产邻氨基苯甲酸的领域。

背景技术：

1、邻氨基苯甲酸是莽草酸途径的天然中间体和芳香族氨基酸l-色氨酸生物合成的前体。它在工业上被用作合成染料、香料、药品和其他有价值产品的中间体。

2、邻氨基苯甲酸的化学合成是一个不可持续且昂贵的过程，需要高温高压和不可再生的萘的条件，并产生有毒副产物。因此，对于提供邻氨基苯甲酸的可再生和源自于生物的来源的可持续技术，存在着迫切需要。

3、某些微生物和植物具有合成邻氨基苯甲酸的代谢能力。具体而言，细菌中邻氨基苯甲酸和芳香族酸的生物合成途径已被充分了解。如图所示，图1代表了在大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)中该途径的简化路线。简而言之，第一个中间体3-脱氧-d-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸，从来自于戊糖磷酸途径的赤藓糖-4-磷酸(e4p)和来自于糖酵解的磷酸烯醇式丙酮酸(pep)这两种前体通过dahp合酶arof、aroh或arog产生。然后，arob、arod和aroe催化从dahp产生莽草酸(shk)的三个反应。随后，从shk通过arol/k、aroa和aroc合成分支酸。最后，trpe和trpg催化从分支酸产生邻氨基苯甲酸。随后，使用邻氨基苯甲酸，在由酶trpd、trpc、trpa和trpb相继催化的几个反应后产生色氨酸。因此，作为一种代谢中间体，邻氨基苯甲酸不积累并且也不被分泌。

4、对大肠埃希氏杆菌中l-色氨酸操纵子的早期研究鉴定到了分泌邻氨基苯甲酸的突变体(yanofsky等，genetics,1971,69,409–433)。通过uv诱变获得的菌株之一(w3110trpd9923)的表征揭示出所述突变存在于编码双功能蛋白trpgd的基因中，产生终止密码子和无功能的trpd结构域。为了提供用于邻氨基苯甲酸生产的微生物菌株，将该菌株进一步修饰以过表达编码抗反馈抑制型dahp合酶、转酮酶、葡萄糖激酶和半乳糖透性酶的基因(balderas-hernández等，microb cell fact.2009apr 2；8:19)。类似地，在突变的芽孢杆菌菌株中也观察到邻氨基苯甲酸积累(us专利5,422,256)。

5、然而，作为主要缺点，这些菌株是色氨酸营养缺陷型。由于需要在培养基中添加色氨酸，使用营养缺陷型菌株导致在工业生产中成本急剧增加。因此，对于使用色氨酸非营养缺陷型细菌菌株来实现邻氨基苯甲酸的工业上有意义的生产率的大大改进的方法，仍存在着迫切需求。

技术实现思路

1、本发明人的目的是在作为色氨酸非营养缺陷型菌株、即能够在缺少色氨酸的培养基中生长的菌株的重组细菌宿主细胞中生产邻氨基苯甲酸。

2、因此，第一方面，本发明涉及一种生产邻氨基苯甲酸的方法，所述方法包括培养重组细菌和任选地回收邻氨基苯甲酸，所述重组细菌已被遗传修饰以诱导邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性与邻氨基苯甲酸合酶活性之间有利于邻氨基苯甲酸合酶活性的失衡，并且能够在缺少色氨酸的培养基中生长。在优选实施方式中，对应于所述重组细菌的未修饰细菌表达表现出trpg和trpd活性的双功能蛋白，而所述重组细菌已被遗传修饰以单独地表达表现出谷氨酰胺酰胺转移酶活性(trpg)的多肽和表现出邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性(trpd)的多肽。

3、具体而言，本发明涉及一种生产邻氨基苯甲酸的方法，所述方法包括培养重组细菌和任选地回收邻氨基苯甲酸，其中与所述重组细菌对应的未修饰细菌表达表现出trpg和trpd活性的双功能蛋白，而所述重组细菌已被遗传修饰以单独表达(i)表现出谷氨酰胺酰胺转移酶活性(trpg)并且不表现出邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性的多肽和(ii)表现出邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性(trpd)并且不表现出谷氨酰胺酰胺转移酶活性的多肽，并且与所述未修饰细菌相比降低邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性与邻氨基苯甲酸合酶活性之间的比率，所述重组细菌能够在缺少色氨酸的培养基中生长。

4、优选地，所述表现出谷氨酰胺酰胺转移酶活性(trpg)的多肽不表现出邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性，并且所述表现出邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶活性(trpd)的多肽不表现出谷氨酰胺酰胺转移酶活性。

5、所述重组细菌可能已被遗传修饰，以优选地通过缺失全部或一部分编码内源双功能蛋白trpgd的trpd结构域的核酸序列来抑制所述结构域的表达。

6、优选地，所述重组细菌已被进一步遗传修饰，以优选地通过缺失全部或一部分编码内源双功能蛋白trpgd的核酸序列来抑制所述蛋白质的表达。

7、具体而言，所述细菌可以是大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)。

8、所述重组细菌可能包含：(i)包含在第一启动子控制之下的编码谷氨酰胺酰胺转移酶(trpg)的基因或第一操纵子的重组核酸，其中所述第一操纵子至少包含编码trpg的核酸序列和任选的编码邻氨基苯甲酸合酶(trpe)的核酸序列，和/或(ii)包含在第二启动子控制之下的编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpd)的基因或第二操纵子的重组核酸，其中所述第二操纵子至少包含编码trpd的核酸序列。在某些特定实施方式中，所述第一启动子强于所述第二启动子。优选地，所述第一启动子是在所述未修饰细菌中不与编码trpg的基因可操作连接的启动子，和/或所述第二启动子是在所述未修饰细菌中不与编码trpd的基因可操作连接的启动子。所述第二操纵子可能进一步包含编码吲哚-3-甘油磷酸合酶(trpc)的核酸序列、编码磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpf)的核酸序列、编码色氨酸合酶的α亚基(trpa)的核酸序列和/或编码色氨酸合酶的β亚基(trpb)的核酸序列。

9、或者，所述重组细菌可能包含在同一启动子控制之下的编码谷氨酰胺酰胺转移酶(trpg)的基因和编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpd)的基因，从而表达两种不同蛋白质trpg和trpd。

10、所述重组细菌也可以被遗传修饰以表达编码抗反馈3-脱氧-d-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的基因，和/或被遗传修饰以过表达编码转酮酶的内源基因或表达编码转酮酶的异源基因。

11、优选地，在本发明的方法中，所述重组细菌在缺少色氨酸或任何色氨酸源的培养基中培养。

12、另一方面，本发明涉及如上所定义的重组细菌。具体而言，本发明涉及一种重组大肠埃希氏杆菌细菌，其已被遗传修饰以包含在第一启动子控制之下的编码谷氨酰胺酰胺转移酶(trpg)的核酸序列和在第二启动子控制之下的编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpd)的核酸序列。优选地，所述重组细菌包含：(i)在第一启动子控制之下的编码谷氨酰胺酰胺转移酶(trpg)的基因或第一操纵子，其中所述第一操纵子至少包含编码trpg的核酸序列并任选地包含编码邻氨基苯甲酸合酶(trpe)的核酸序列，和(ii)在第二启动子控制之下的编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpd)的基因或第二操纵子，其中所述第二操纵子至少包含编码trpd的核酸序列并任选地包含编码吲哚-3-甘油磷酸合酶(trpc)的核酸序列、编码磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpf)的核酸序列、编码色氨酸合酶的α亚基(trpa)的核酸序列和/或编码色氨酸合酶的β亚基(trpb)的核酸序列。

13、本发明还涉及本发明的重组细菌用于生产邻氨基苯甲酸的用途。