制备成熟红细胞的体外方法与流程

本公开涉及红系细胞培养系统和方法领域，尤其涉及体外人cd34-红系细胞培养系统和方法。

背景技术：

1、红细胞(rbc)是血液中数量最多的细胞类型，占人体细胞总数的四分之一。rbc具有许多独特的特征，使其成为在治疗和诊断中用于多种目的的有吸引力的工具，例如，用于体内递送天然或合成的有效载荷，所述特征包括：例如，循环范围广(红细胞穿行身体的整个血管系统)；生物相容性良好；循环半衰期长(在人体中的寿命约为120天)；表面积与体积比大；无细胞核和线粒体(没有蛋白质合成，没有增殖，没有突变)。

2、为了满足对rbc的需求，红细胞再生技术发展迅速。目前的红细胞再生方法主要基于cd34+骨髓造血干细胞或cd34+脐带血造血干细胞。cd34+骨髓造血干细胞的提取会对细胞提供者造成巨大的身体痛苦和伤害，而cd34+脐带血造血干细胞只能在新生儿出生的特定时间段内获得。因此，上述两种方法在临床应用中具有很大的局限性。

3、关于cd34-造血干细胞的分化潜能，似乎存在不一致的结果，并且缺乏适宜的红系分化培养系统也限制了cd34-造血干细胞的使用。

4、因此，仍然需要用于在体外制备成熟红细胞的改进方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一个方面，本公开提供用于产生红细胞的方法，其包括以下步骤：(a)提供lin-cd34-造血祖细胞群体；(b)在第一培养基中培养来自(a)的lin-cd34-造血祖细胞群体，该第一培养基包含一种或多种选自以下的添加剂：芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂、pparα激动剂及其任何组合，优选芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂和pparα激动剂的组合；和(c)在第二培养基中培养从(b)获得的细胞群体，该第二培养基包含一种或多种选自以下的添加剂：维生素、甲基黄嘌呤化合物、甲状腺激素受体激动剂及其任何组合，优选维生素、甲基黄嘌呤化合物和甲状腺激素受体激动剂的组合，从而产生红细胞。

2、在一些实施方案中，在步骤(a)中，该lin-cd34-造血祖细胞群体已在扩增培养基如造血干细胞扩增培养基中扩增。

3、在一些实施方案中，该扩增培养基包含fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)、干细胞因子(scf)、白介素3(il-3)和白介素6(il-6)。

4、在一些实施方案中，该扩增培养基包含约10-100ng/ml flt3l、约50-150ng/mlscf、约1-20ng/ml il-3和约5-30ng/ml il-6。

5、在一些实施方案中，该扩增培养基是无血清扩增培养基。

6、在一些实施方案中，该lin-cd34-造血祖细胞群体已扩增了约2-5天。

7、在一些实施方案中，该第一培养基是第一分化培养基。

8、在一些实施方案中，该芳烃受体拮抗剂选自：sr1、4-(2-(吡啶-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(9-异丙基-2-(2-甲基-1h-咪唑-1-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(2-(5-氯吡啶-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(6-(5-氟吡啶-3-基)-1-异丙基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)乙基)苯酚、(r)-4-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-四氢呋喃-3-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、(r)-2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-9-基)丙-1-醇、(s)-2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-9-基)丙-1-醇、4-(2-(6-(5-氟吡啶-3-基)-1-异丙基-1h-咪唑[4,5-c]吡啶-4-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(5-(5-氟吡啶-3-基)-3-异丙基-3h-咪唑[4,5-c]吡啶-7-基氨基)乙基)苯酚、3-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)-1h-吲哚-5-基6-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并{3,4-d}咪唑-4-基)戊酰胺基)己酸酯和3-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)-1h-吲哚-5-基6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸酯及其任何组合。

9、在一些实施方案中，该芳烃受体拮抗剂的量为约0.1-5μm。

10、在一些实施方案中，该hif-1调节剂是hif-1激活剂，如脯氨酰羟化酶抑制剂(phi)，优选该phi选自：fg-4592、fg-2216、fg-4539、n-((l-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸、[(7-溴-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氯-4-羟基-7-甲氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、(7-氯-3-羟基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸、[(3-羟基-6-异丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸和[(4-羟基-7-苯硫基-异喹啉-3-羰基)-氨基}-乙酸和二甲基草酰甘氨酸(dmog)及其任何组合。

11、在一些实施方案中，该hif-1调节剂的量为约10-500nm。

12、在一些实施方案中，该pparα激动剂选自：非诺贝特(fenofibrate)、氯非贝特(clofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、克利贝特(clinofibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、依托贝特(etofibrate)、吉非贝特(gemfibrate)(吉非贝齐(gemfibrozil))、pemabate((r)-2-{3-{[n-(苯并唑-2-基)-n-3-(4-甲氧基苯氧基)丙基]氨基甲基}苯氧基}丁酸)、gw-7647(2-[[4-[2-[[(环己基氨基)羰基](4-环己基丁基)氨基]乙基]苯基]硫基]-2-甲基丙酸)、wy-14643(匹立尼酸)、am3102(cas号：213182-22-0)、cay15073(cas号：853652-40-1)、cp775146(cas号：702680-17-9)、gw9578(cas号：247923-29-1)、gw590735(cas号：622402-22-6)、油酰乙醇胺、棕榈酰乙醇胺、tesaglitazar((s)-2-乙氧基-3-[4-[4-[(甲基磺酰基)氧基]苯基乙氧基]苯基)丙酸)、ly518674(2-[4-[3-[2,5-二氢-1-[(4-甲基苯基)甲基]-5-氧代-1h-1,2,4-三唑-3-基]丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸)及其任何组合。

13、在一些实施方案中，该pparα激动剂的量为约0.01–50μm。

14、在一些实施方案中，该第一培养基进一步包含转铁蛋白、胰岛素、il-3、epo和scf。

15、在一些实施方案中，该第一培养基包含约100-600μg/ml转铁蛋白、约5-20μg/ml胰岛素、约0.5-7ng/ml il-3、约1-7u/ml epo和约5-120ng/ml scf。

16、在一些实施方案中，步骤(b)包括培养该lin-cd34-造血祖细胞群体约7-13天，如约9-11天。

17、在一些实施方案中，步骤(b)中的培养导致该lin-cd34-造血祖细胞群体的增殖和/或分化。

18、在一些实施方案中，该第二培养基是第二分化培养基。

19、在一些实施方案中，该维生素选自维生素c、维生素e、维生素c或e的衍生物或类似物、及其任何组合。

20、在一些实施方案中，该第二培养基以约1-100μm的量包含维生素。

21、在一些实施方案中，该第二培养基以约1-50μm的量包含维生素c和/或其衍生物或类似物。

22、在一些实施方案中，该第二培养基以约1-50μm的量包含维生素e和/或其衍生物或类似物。

23、在一些实施方案中，该甲基黄嘌呤化合物选自：咖啡因、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)、茶碱和可可碱，优选量为约1-50μm。

24、在一些实施方案中，该甲状腺激素受体激动剂是甲状腺激素受体α或β激动剂，优选甲状腺激素受体β激动剂。

25、在一些实施方案中，该甲状腺激素受体激动剂是甲状腺素(t4)、三碘甲状腺原氨酸(t3)及其类似物，优选甲状腺素及其类似物，优选量为约0.1-10μm。

26、在一些实施方案中，该第二培养基包含维生素c、维生素e、咖啡因和甲状腺素的组合。

27、在一些实施方案中，该第二培养基进一步包含转铁蛋白、胰岛素和epo，优选进一步包含约100-600μg/ml转铁蛋白、约5-20μg/ml胰岛素和约0.5-5u/ml epo。

28、在一些实施方案中，步骤(c)包括培养从(b)获得的细胞群体约5-11天，如约7-9天。

29、在一些实施方案中，该lin-cd34-造血祖细胞群体分离自血液样品，如外周血样品、脐带血样品或骨髓。

30、在一些实施方案中，该血液样品是人外周血样品。

31、在一些实施方案中，通过从血液样品分离外周血单个核细胞(pbmc)并从pbmc去除谱系阳性(lin+)细胞来获得lin-cd34-造血祖细胞群体。

32、在另一方面，本发明提供培养lin-cd34-造血祖细胞的方法，其包括在包含一种或多种添加剂的培养基中培养lin-cd34-造血祖细胞群体，其中所述添加剂选自：芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂、pparα激动剂及其任何组合，优选芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂和pparα激动剂的组合。

33、在一些实施方案中，该芳烃受体拮抗剂选自：sr1、4-(2-(吡啶-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(9-异丙基-2-(2-甲基-1h-咪唑-1-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(2-(5-氯吡啶-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(6-(5-氟吡啶-3-基)-1-异丙基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)乙基)苯酚、(r)-4-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-四氢呋喃-3-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚、(r)-2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-9-基)丙-1-醇、(s)-2-(6-(2-(1h-吲哚-3-基)乙基氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9h-嘌呤-9-基)丙-1-醇、4-(2-(6-(5-氟吡啶-3-基)-1-异丙基-1h-咪唑[4,5-c]吡啶-4-基氨基)乙基)苯酚、4-(2-(5-(5-氟吡啶-3-基)-3-异丙基-3h-咪唑[4,5-c]吡啶-7-基氨基)乙基)苯酚、3-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)-1h-吲哚-5-基6-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并{3,4-d}咪唑-4-基)戊酰胺基)己酸酯和3-2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9h-嘌呤-6-基氨基)乙基)-1h-吲哚-5-基6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸酯及其任何组合。

34、在一些实施方案中，该芳烃受体拮抗剂的量为约0.1-5μm。

35、在一些实施方案中，该hif-1调节剂是hif-1激活剂，如脯氨酰羟化酶抑制剂(phi)，优选该phi选自：fg-4592、fg-2216、fg-4539、n-((l-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基)-乙酸、[(7-溴-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氯-4-羟基-7-甲氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、(7-氯-3-羟基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸、[(3-羟基-6-异丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸和[(4-羟基-7-苯硫基-异喹啉-3-羰基)-氨基}-乙酸和二甲基草酰甘氨酸(dmog)及其任何组合。

36、在一些实施方案中，该hif-1调节剂的量为约10-500nm。

37、在一些实施方案中，该pparα激动剂选自：非诺贝特(fenofibrate)、氯非贝特(clofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、克利贝特(clinofibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、依托贝特(etofibrate)、吉非贝特(gemfibrate)(吉非贝齐(gemfibrozil))、pemabate((r)-2-{3-{[n-(苯并唑-2-基)-n-3-(4-甲氧基苯氧基)丙基]氨基甲基}苯氧基}丁酸)、gw-7647(2-[[4-[2-[[(环己基氨基)羰基](4-环己基丁基)氨基]乙基]苯基]硫基]-2-甲基丙酸)、wy-14643(匹立尼酸)、am3102(cas号：213182-22-0)、cay15073(cas号：853652-40-1)、cp775146(cas号：702680-17-9)、gw9578(cas号：247923-29-1)、gw590735(cas号：622402-22-6)、油酰乙醇胺、棕榈酰乙醇胺、tesaglitazar((s)-2-乙氧基-3-[4-[4-[(甲基磺酰基)氧基]苯基乙氧基]苯基)丙酸)、ly518674(2-[4-[3-[2,5-二氢-1-[(4-甲基苯基)甲基]-5-氧代-1h-1,2,4-三唑-3-基]丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸)及其任何组合。

38、在一些实施方案中，该pparα激动剂的量为约0.01-50μm。

39、在一些实施方案中，该培养基是分化培养基。

40、在一些实施方案中，该培养基进一步包含转铁蛋白、胰岛素、il-3、epo和scf。

41、在一些实施方案中，该分化培养基包含约100-600μg/ml转铁蛋白、约5-20μg/ml胰岛素、约0.5-7ng/ml il-3、约1-7u/ml epo和约5-120ng/ml scf。

42、在一些实施方案中，该方法包括培养该lin-cd34-造血祖细胞群体约7-13天，如约9-11天。

43、在一些实施方案中，该培养导致该lin-cd34-造血祖细胞群体的增殖和/或分化。

44、在另一方面，本公开提供产生红细胞的方法，其包括：在包含一种或多种添加剂的培养基中培养有核红细胞前体群体，其中所述添加剂选自维生素、甲基黄嘌呤化合物、甲状腺激素受体激动剂及其任何组合，优选维生素、甲基黄嘌呤化合物和甲状腺激素受体激动剂的组合，从而产生红细胞。

45、在一些实施方案中，该有核红细胞前体群体处于终末分化阶段。

46、在一些实施方案中，该有核红细胞前体是网织红细胞。

47、在一些实施方案中，该有核红细胞前体获自lin-cd34-造血祖细胞群体。

48、在一些实施方案中，该培养基是分化培养基。

49、在一些实施方案中，该维生素选自维生素c、维生素e、维生素c或e的衍生物或类似物、及其任何组合。

50、在一些实施方案中，该培养基以约1-100μm的量包含维生素。

51、在一些实施方案中，该培养基以约1-50μm的量包含维生素c和/或其衍生物或类似物。

52、在一些实施方案中，该培养基以约1-50μm的量包含维生素e和/或其衍生物或类似物。

53、在一些实施方案中，该甲基黄嘌呤化合物选自咖啡因、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)、茶碱和可可碱，优选量为约1-50μm。

54、在一些实施方案中，该甲状腺激素受体激动剂是甲状腺激素受体α或β激动剂，优选甲状腺激素受体β激动剂。

55、在一些实施方案中，该甲状腺激素受体激动剂是甲状腺素(t4)、三碘甲状腺原氨酸(t3)及其类似物，优选甲状腺素及其类似物，优选量为约0.1-10μm。

56、在一些实施方案中，该培养基包含维生素c、维生素e、咖啡因和甲状腺素的组合。

57、在一些实施方案中，该培养基进一步包含转铁蛋白、胰岛素和epo，优选进一步包含约100-600μg/ml转铁蛋白、约5-20μg/ml胰岛素和约0.5-5u/ml epo。

58、在一些实施方案中，培养该有核红细胞前体约5-11天，如约7-9天。

59、在另一方面，本公开提供通过本文所述的方法获得的细胞群体。

60、在另一方面，本公开提供培养基补充剂组合物，其包含一种或多种选自以下的添加剂：芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂、pparα激动剂及其任何组合，优选芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂和pparα激动剂的组合。在一些实施方案中，该组合物进一步包含转铁蛋白、胰岛素、il-3、epo和scf。

61、在另一方面，本公开提供培养基补充剂组合物，其包含维生素、甲基黄嘌呤化合物和甲状腺激素受体激动剂。在一些实施方案中，该组合物进一步包含转铁蛋白、胰岛素和epo。

62、在另一方面，本公开提供用于产生工程化红细胞的方法，其包括步骤：(a)提供lin-cd34-造血祖细胞群体；(b)在第一培养基中培养来自(a)的lin-cd34-造血祖细胞群体，该第一培养基包含一种或多种选自以下的添加剂：芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂、pparα激动剂及其任何组合，优选芳烃受体拮抗剂、hif-1调节剂和pparα激动剂的组合，以诱导分化为红系细胞，并且在分化之前或在分化的同时，将一种或多种外源核酸引入该红系细胞；和(c)培养该红系细胞以诱导去核，从而产生工程化红细胞。

63、在一些实施方案中，步骤(c)包括在第二培养基中培养从(b)获得的细胞，该第二培养基包含一种或多种选自以下的添加剂：维生素、甲基黄嘌呤化合物、甲状腺激素受体激动剂及其任何组合，优选维生素、甲基黄嘌呤化合物和甲状腺激素受体激动剂的组合，从而产生该工程化红细胞。