生产高溶胀性透明质酸珠凝胶的方法与流程

本技术涉及一种制备均匀球形透明质酸珠凝胶的方法，其中透明质酸是透明的并且在交联反应后分散在油中的状态下通过再形成交联反应具有高溶胀度。本技术可以在不使用乳化剂、表面活性剂、增溶剂等的情况下，通过控制油和透明质酸溶液的比例，稳定地获得透明、具有高溶胀度、均匀球形和各种尺寸的球形透明质酸珠。为了在获得步骤中保持球形，不使用添加作为包封形成材料的合成聚合物如plga和pcl的方法、通过离子键产生不溶性沉淀物的方法、在有机溶剂中沉淀的方法等。在没有添加剂的情况下，通过分散在油相中的透明质酸溶液中的两步交联来保持球形。此外，本技术涉及一种通过去除诸如油和未反应物质之类的杂质来生产透明珠凝胶的通过应用三步纯化方法的生产方法。所获得的球形透明质酸珠凝胶具有透明的球形，显示出所选择的尺寸、分解期、粘弹性和溶胀度，具有优异的生物相容性，并且对热和酶非常稳定。根据本技术的具有这种特性的球形透明质酸珠凝胶可以以多种方式使用，例如用于去除皱纹的填充剂、植入物、药物递送基质、细胞载体、细胞支架、关节注射剂和化妆品。

背景技术：

1、透明质酸((ha)，透明质烷，(c14h20nnao11)n(n>1000))是一种存在于生物体中的聚合物，是一种多糖，称为糖胺聚糖。它的结构由交替的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺组成，通过交替的β-1,3和β-1,4键连接在一起。它是一种具有显著高粘度和弹性的水溶性材料，其分子量在1000至10000000da(道尔顿)之间变化，具有直链多糖广泛的外延结构。

2、透明质酸有很强的保湿作用，在物理摩擦状态下具有很强的润滑功能。此外，由于它在功效和物理性能方面具有非常理想的优势，例如对细菌入侵的保护作用，因此它在美容和医疗方面有着广泛的应用。

3、为了开发透明质酸，过去基本上使用了生物组织提取方法或微生物培养方法。然而，由于鸡毛提取方法会导致病毒入侵、杂质和炎症反应等许多缺点，因此能够控制分子量和生产力并能够获得高质量原材料的微生物培养生产方法正成为主流。

4、特别地，根据通过微生物培养方法调节和生产的透明质酸的分子量的范围来确定透明质酸使用是最近的发展趋势。也就是说，100000da或更低的超低分子量透明质酸主要用于食品或化妆品，而平均分子量为100万da的低分子量的透明质酸用于开发滴眼液原料或其衍生物。当用作膝关节注射的原料时，平均分子量为300万至400万da的透明质酸是非常有价值的。

5、此外，它作为眼科手术辅助剂的应用也在增加。作为体内的一种超高分子量材料，它已被重点用作防粘剂的原料。

6、然而，透明质酸在体内或在酸和碱等条件下很容易分解，加工性差，因此开发用于各种用途是有限制的。因此，正在努力开发具有结构稳定的透明质酸的物质。(laurent，t.c.，“透明质酸及其衍生物的化学、生物学和医学应用”，波特兰出版社，伦敦，1998年)。

7、交联透明质酸正被开发用于各种用途，如术后防粘连膜、凝胶型防粘连剂、除皱填充物、美容助剂、关节注射剂、给药基质和细胞支架。特别是，交联透明质酸已被积极研究用于商业用途，如除皱填充物和美容助剂。(f.manna，m.dentini，p.desider，o.de pita，e.mortilla，b.maras，《欧洲皮肤性病学院杂志》，13(1999)183-192)。

8、混合并使用化学方法和物理方法的方法是生产由交联透明质酸组成的珠粒的通常众所周知的方法。作为分离珠粒的已知方法，存在通过精细喷嘴的沉淀、外部的脂质化和包封、使用表面活性剂分散溶解的可生物降解聚合物以及通过溶剂提取和蒸发获得珠粒等。

9、在物理方法中，颗粒的高均匀性受到叶轮形状和搅拌速度的影响，并且在大多数情况下必须保持高搅拌速度。在使用精细喷嘴的方法中，会产生类似石榴果实的外观，因此无法保持完美的球形。在珠粒外部通过脂质化和封装获得球形珠粒的情况下，珠粒被物理外力破坏，内部的液相流出。在使用溶剂萃取蒸发法时，必须使用对人体有害的表面活性剂和有机溶剂，并且有必要将它们从最终产品中完全去除。

10、作为生产由交联透明质酸组成的珠粒的其他一般方法，有一种使用过量的代表阳离子的物质通过与阴离子透明质酸的离子键合形成不溶性沉淀物的方法；一种使用过多量的交联剂形成不溶形式，然后干燥以进行物理造粒的方法；一种将疏水性物质与透明质酸的羧基结合，将其溶解在有机溶剂中，在两种不同的相分离溶剂中使用乳化剂形成微珠，并通过溶剂萃取收集微珠的方法。例如，美国专利6066340和6039970公开了通过将乙醇或苄醇与透明质酸的羧基结合而合成的透明质酸衍生物的用途。这种物质不溶于水，但溶于二甲基亚砜等有机溶剂。存在使用这种疏水性透明质酸衍生物通过乳液溶剂萃取生产固体微珠的实例。

11、此外，正在进行用壳聚糖制备珠子并将其用作药物递送基质的研究。(s.t.lim，g.p.martin，d.j.berry和m.b.brown，《控制释放杂志》，2-3，66(2000)，281-292；s.t.lim，b.forbes，d.j.贝里，g.p.马丁和m.b.布朗，《国际药物学杂志》，1231(2002)，73-82)。

12、此外，在与生产由1，3-丁二烯二环氧化物交联的透明质酸珠粒有关的文献中，公开了在碱性水溶液中搅拌透明质酸和植物油的混合物后，通过加入1，3-丁二烯二环氧化物进行交联反应的条件。在这种条件下，通过向100mg透明质酸施用0.4ml的过量3-丁二烯二环氧化物(与交联反应位点相比约800mol％)，溶胀(％)约为500％，其太硬并且具有不均匀的形状。此外，由于使用了过量的交联剂，它在应用领域有局限性。(聚合物(韩国)，第29卷，第5期，第445-450页，2005年)。

13、此外，在生产透明质酸微珠的方法中，通过在压缩空气的压力下通过喷嘴将透明质酸水溶液的液滴通过微珠产生装置滴入正在搅拌的交联溶液中来生产透明质酸微珠。在这种方法中，存在的问题是，由于使用二乙烯基砜作为交联剂，可能会出现安全问题，颗粒之间的形状不均匀且均匀性差，并且必须使用昂贵的设备。(《生物材料研究》(2009)13(3):105-108；《生物材料学研究》(2010)14(4):157-160；chun等人，《生物物质研究》(2016)20:24，使用多糖的微珠及其制备方法(韩国专利授权号105489650000(2006.01.26)))。

14、此外，还有一种通过滴入-10℃至-200℃的冷冻制冷剂来生产固体珠粒型乳液珠粒的方法，但需要许多成分，并且没有纯化过程。因此，其应用领域的使用是有限的。(通过在低温下冷冻制备具有圆珠形式的乳液，从而制备具有圆珠形式的乳状液，韩国专利授权号1015532330000(2015.09.09))。

15、此外，与通过bdde交联的透明质酸珠的生产相关的文献公开了一种制造方法，包括将透明质酸在碱性水溶液中在10℃下溶解过夜以降低分子量，添加过量的bdde(每100mg透明质酸用20mg bdde，与弱交联反应位点相比约40mol％)，用橄榄油搅拌反应，通过过滤器收集，并用70％丙酮水溶液、蒸馏水(dw)和pbs纯化。这里，由于接近20％至30％的高化学应变和18.99至23.02的低溶胀度，它具有太硬和不均匀的形状，并且它在应用领域的使用受到限制。(acs omega 2019，4，9，13834-13844，具有增强的结构稳定性和高可注射性的基于透明质酸的混合水凝胶微球)。

16、此外，还有一种通过将透明质酸与选自阿仑膦酸盐(ald)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)的配体交联并溶解交联的透明质酸，并将溶解的透明质酸滴在多价阳离子上来制备纳米/微珠的方法。然而，由于安全性和稳定性方面的问题，其在应用领域的应用受到限制。(生产透明质酸微珠的方法和透明质酸微球的用途，韩国专利授权号1021085520000(2020.04.29))。

17、然而，由于透明质酸是一种具有非常高亲水性的物质，因此通过上述通常已知的方法生产透明且具有高度溶胀度的均匀球形珠粒存在局限性。具有水相的透明质酸在油相中具有非常高的亲水性，因此很难通过溶剂蒸发去除水分，并且当通过溶剂萃取添加有机溶剂时，颗粒相互缠绕，从而不能产生均匀尺寸的珠粒。此外，在迄今为止已知的生产透明质酸珠的方法有，通过使用过量的代表阳离子的物质通过离子键与阳离子透明质酸产生不溶性沉淀物；或者通过使用过量交联剂形成不溶性形式，然后干燥以获得物理造粒；或者将疏水性物质与透明质酸的羧基结合并溶解在有机溶剂中，进行溶剂萃取。然而，以这种方式生产的珠粒具有相当小的颗粒尺寸、不均匀的形状、在水溶液中溶胀度非常低的坚硬不透明颗粒，因此，它们的应用受到限制。

18、如上所述，由于透明质酸独特的材料特性，常规技术不能应用于生产在水溶液中具有非常高溶胀度同时保持均匀球形和透明度的珠粒的工艺。

技术实现思路

1、发明目的

2、为了解决上述技术问题，本技术的目的是，提供一种具有透明度和高溶胀度的均匀球形透明质酸珠凝胶。

3、也就是说，本技术的目的是提供一种具有透明度和高溶胀度的均匀球形透明质酸珠凝胶，由于其通过均匀的球形形状和尺寸控制、通过交联透明质酸珠凝胶的沉积期、在水溶液中具有高溶胀度和优异的物理稳定性，在体内外各种环境中具有优异的生物相容性，因此可在医疗器械、制药、化妆品和食品工业中有效使用。

4、本技术的另一个目的是提供一种通过使用少量交联剂形成球形的高效两步反应工艺和三步纯化工艺生产球形透明质酸珠凝胶的方法。该方法不执行常规方法，例如对球形珠外部进行脂质化和包封的方法、使用乳化剂和表面活性剂的方法、用过量交联剂形成不溶形式然后干燥和物理造粒的方法，不进行结合疏水性物质并将其溶解在有机溶剂中然后相分离的方法。因此，它适合于提供具有高纯度的透明球形透明质酸珠凝胶。

5、为了实现这一目的，经过广泛的研究和大量的实验，本技术人在不使用化学乳化剂和化学表面活性剂的情况下，通过透明质酸溶液和油的相对比例控制珠粒的大小、以及通过使用少量交联剂的两步反应工艺获得高效化学键和三步纯化工艺，生产透明质酸凝胶。球形透明质酸珠凝胶不仅具有高纯度、均匀性和选择性尺寸的透明球形，而且具有即使在121℃灭菌条件下也不会分解的特性，并且具有优异的生物相容性、粘弹性、溶胀性、稳定性等，从而完成了本技术。

6、技术方案

7、为了解决上述技术问题，本技术提供了一种生产具有高溶胀度的透明质酸珠凝胶的方法，包括(a)在碱性水溶液中加入透明质酸或其盐，加入交联剂，然后使均匀混合的反应物反应的反应步骤；(b)通过将反应物与油搅拌来形成交联共价键的交联反应步骤；及(c)纯化在交联反应步骤中获得的产物的步骤，其中透明质酸珠凝胶是均匀球形的。

8、在本技术的另一个实施方案中，通过纯化过程最终获得的透明质酸珠凝胶的溶胀度(％)可以是3000％或更高。

9、作为本技术的另一个实施方案，本技术的生产方法的特征在于不使用乳化剂、化学表面活性剂和化学增溶剂。

10、作为本技术的另一个实施方案，本技术的生产方法的特征在于，在步骤(a)中，基于透明质酸或其盐的重复单元，以1-30当量％的范围添加交联剂。

11、如果交联剂的添加量基于透明质酸或其盐的重复单元低于1当量％，则交联剂容易分解，并且不能保持形状。此外，如果交联剂的添加量超过30当量％，则由于使用大量交联剂而产生副作用的频率增加，并且由于具有低溶胀度的硬物理性质，在易用性方面也是不理想的。

12、作为本技术的另一个实施方案，在步骤(a)中，基于0.1-10n的碱性水溶液，透明质酸或其盐在反应物中的浓度为1-30重量％，优选5-20重量％，。

13、如果透明质酸或其盐的浓度基于0.1至10n的碱水溶液小于1重量％，则不能适当地进行交联并且难以保持形状，这是不优选的。此外，当该浓度超过30重量％时，由于浓度过高而难以均匀混合，导致反应不均匀，并且过高的交联导致硬性能，这是不优选的。

14、在本技术的另一个实施方案中，步骤(a)可以在5至50℃的反应温度和30分钟至24小时的反应时间下进行。

15、在本技术的另一个实施方案中，步骤(b)可以在5至50℃的反应温度和1小时至96小时的反应时间下进行。优选在100rpm至2000rpm的搅拌速度下进行反应。

16、在本技术的另一个实施方案中，在步骤(b)中，加入交联剂的透明质酸或其盐碱水溶液与油的重量比可以是1:1至1:9。

17、在步骤(c)中交联和共价键合后，使用各种类型的有机溶剂进行沉淀，以去除交联产物中残留的水分，并收集交联的透明质酸珠，同时洗涤数次以去除油脂。

18、在本技术的另一个实施方案中，交联剂可以是选自由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde，1,4-butandiol diglycidyl ether)、乙二醇二缩水甘油醚(egdge，ethyleneglycol diglycidyl ether)、1,6-己二醇二缩水甘油醚(1,6-hexanediol diglycidylether)、丙二醇二缩水甘油醚(propylene glycol diglycidyl ether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚四甲基乙二醇二缩水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二缩水甘油醚(neopentylglycol diglycidyl ether)、丙三醇均聚物丙氧基醚(polyglycerol polyglycidylether)、二甘油聚缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、丙三醇缩水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、三羟甲基丙烷三缩水甘油醚(tri-methylpropanepolyglycidyl ether)、1,2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、季戊四醇缩水甘油醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)和山梨醇缩甘油醚(sorbitol polyglycidyl ether)组成的组中的1种或多种。

19、在本技术的另一个实施方案中，油可以是选自由矿物油、中链甘油三酯、鲱鱼油、亚麻籽油、椰子油、鳕鱼油(鱼油)、大豆油、鲸油、棉花籽油、芝麻籽油、花生油、橄榄油、猪油、棕榈油、玉米油、菜籽油、骨油、中国木油和蓖麻油组成的组中的一种或多种。

20、在本技术的另一个实施方案中，纯化方法优选包括(a)收集经过交联反应步骤的透明质酸珠凝胶的步骤；(b)第一纯化步骤，用选自蒸馏水、酸性溶液、含有酸盐的水溶液和pbs中的一种或多种洗涤收集的球形凝胶；(c)第二纯化步骤，用有机溶剂水溶液洗涤经过第一纯化步骤的透明质酸珠凝胶；(d)第三纯化步骤，用选自蒸馏水、酸性溶液、含有酸盐的水溶液和pbs中的一种或多种洗涤经过第二纯化步骤的透明质酸珠凝胶；以及(e)分离并收集在第三纯化步骤中获得的透明质酸珠凝胶。

21、在纯化步骤中交联到一定水平的透明质酸或其交联盐在步骤(b)中用蒸馏水、酸性溶液或含有盐和pbs的水溶液洗涤数次，以除去未反应的交联剂和氢氧根离子。

22、将步骤(b)中纯化的珠凝胶再次在有机溶剂中沉淀，然后在步骤(c)中在有机溶剂水溶液中溶胀一定时间，然后用有机溶剂洗涤数次，以除去油和未反应的交联剂以及杂质；

23、在步骤(d)中，通过用蒸馏水、酸性溶液或含盐的水溶液和pbs再次洗涤数次来去除未反应的交联剂、杂质和有机溶剂，最后，在步骤(e)中，使珠凝胶溶胀以制备透明质酸珠凝胶。

24、在本技术的另一个实施方案中，有机溶剂可以使用选自dmso、dmf、乙腈、甲醇、thf、丙酮、丙酮水溶液和具有2-6个碳原子的醇中的一种或多种。

25、在本技术的另一个实施方案中，溶胀步骤中使用的有机溶剂水溶液优选蒸馏水与有机溶剂的重量比为9:1至1:9。

26、有益效果

27、如上所述，在本技术的球形透明质酸珠凝胶的制备方法中，在油相中不使用乳化剂，并且控制各种类型的油和水溶液的类型和相对比例，以控制球形透明质酸珠凝胶的尺寸和物理性质。

28、此外，本技术可以通过两步交联反应在使用少量交联剂的同时获得高的交联效率和产率，还可以通过三步纯化方法控制球形透明质酸珠凝胶的透明度和物理性能。

29、通过本技术制备的透明质酸球形珠凝胶具有透明的球形，具有选定的尺寸、分解期、粘弹性和溶胀度，具有优异的生物相容性，并且对热和酶非常稳定。