抑制基因表达的组合物和方法与流程

背景技术：

1、基因表达的错误调控是许多疾病的根本原因(例如，在哺乳动物中，例如人类)。虽然存在短时间调节基因表达的技术，但许多疾病的治疗需要稳定、长期的基因表达调节。需要新的工具、系统和方法来稳定地改变(例如，减少)疾病相关基因的表达。

技术实现思路

1、本披露尤其提供可用于调节(例如，降低)靶基因表达的表达阻遏物和表达阻遏系统。

2、在一些方面，表达阻遏物包含dna靶向部分和能够调节(例如，降低)靶基因表达的阻遏物结构域。在一些实施例中，表达阻遏物包含dna靶向部分、第一阻遏物结构域和第二阻遏物结构域。在一些实施例中，第一阻遏物结构域不同于第二阻遏物结构域。在一些实施例中，第一阻遏物结构域与第二阻遏物结构域相同。

3、在一些方面，本披露的特征在于表达阻遏系统，其包含含有第一dna靶向部分和第一阻遏物结构域的第一表达阻遏物，以及含有第二dna靶向部分和第二阻遏物结构域的第二表达阻遏物。在一些实施例中，第一dna靶向部分特异性结合第一dna序列，并且第二dna靶向部分特异性结合不同于第一dna序列的第二dna序列。在一些实施例中，第一阻遏物结构域不同于第二阻遏物结构域。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：(i)包含第一dna靶向部分、第一阻遏物结构域和第二阻遏物结构域的第一表达阻遏物，和(ii)包含第二dna靶向部分和第一阻遏物结构域的第二表达阻遏物。在一些实施例中，所有三个阻遏物结构域都不同。在一些实施例中，至少两个阻遏物结构域是相同的。在一些实施例中，表达阻遏系统包括：(i)包含第一dna靶向部分、第一阻遏物结构域和第二阻遏物结构域的第一表达阻遏物，和(ii)包含第二dna靶向部分、第一阻遏物结构域和第二阻遏物结构域的第二表达阻遏物。在一些实施例中，所有四个阻遏物结构域都不同。在一些实施例中，至少两个阻遏物结构域是相同的。

4、通常，表达阻遏系统对靶基因表达的调节涉及第一表达阻遏物和第二表达阻遏物分别与第一和第二dna序列的结合。第一和第二dna序列的结合将第一和第二阻遏物结构域的功能定位于那些位点。不希望受理论的束缚，在一些实施例中，认为使用第一和第二阻遏物结构域的功能稳定地阻遏与第一和/或第二dna序列相关或包含第一和/或第二dna序列的靶基因的表达，例如，其中第一和/或第二dna序列是或包含靶基因或一个或多个可操作地连接的转录控制元件的序列。

5、在一些方面，本披露提供了表达阻遏物或表达阻遏系统，其包含：结合包含seq idno:1-21序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的靶向部分，其中表达阻遏物或表达阻遏系统能够降低靶基因的表达。

6、在一些方面，本披露提供了表达阻遏物，其包含：dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))，或所述转录调控元件近侧的序列；和阻遏物结构域。在一些实施例中，表达阻遏物包含dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))或所述转录调控元件近侧的序列；第一阻遏物结构域与第二阻遏物结构域。在一些实施例中，第一阻遏物结构域与第二阻遏物结构域相同。在一些实施例中，第一阻遏物结构域与第二阻遏物结构域不同。

7、在一些方面，本披露提供了表达阻遏系统，其包含：(i)第一表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))，或所述转录调控元件近侧的序列；和第一阻遏物结构域，以及第二表达阻遏物，该第二表达阻遏物包含第二dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))，或所述转录调控元件近侧的序列；和第一阻遏物结构域。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的第一阻遏物结构域相同。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物的第一阻遏物结构域不同。在一些实施例中，第一dna靶向部分和第二dna靶向部分相同。在一些实施例中，第一dna靶向部分和第二dna靶向部分不同。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，该第一表达阻遏物包含第一dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))或所述转录调控元件近侧的序列；第一阻遏物结构域与第二阻遏物结构域；该第二表达阻遏物包含第二dna靶向部分(其中任选地，dna靶向部分包含crispr/cas分子，例如无催化活性的crispr/cas蛋白)，其结合可操作地连接至靶基因的转录调控元件(例如启动子或转录起始位点(tss)))，或所述转录调控元件近侧的序列；第一阻遏物结构域和第二阻遏物结构域。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的第一阻遏物结构域相同。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物的第一阻遏物结构域不同。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的第二阻遏物结构域相同。在一些实施例中，第一和第二表达阻遏物的第二阻遏物结构域不同。

8、在一些方面，本披露的特征在于编码表达阻遏物或其组分(例如，grna)的核酸。在一些方面，本披露涉及编码第一表达阻遏物、第二表达阻遏物、两者或其组分(例如，grna)的核酸。在一些方面，本披露涉及包含本文描述的核酸的载体。在一些方面，本披露涉及包含本文所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸或载体的细胞。在一些方面，本披露涉及包含本文所述的载体、核酸、表达阻遏系统或表达阻遏物的脂质纳米颗粒。在一些方面，本披露涉及包含本文所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体或脂质纳米颗粒的反应混合物。在一些方面，本披露涉及包含本文所述的表达阻遏系统、核酸或载体的药物组合物。

9、在一些方面，本披露涉及降低靶基因的表达的方法，该方法包括提供本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统，并使该靶基因和/或一个或多个可操作地连接的转录控制元件与该表达阻遏物或该表达阻遏系统接触，从而降低该靶基因的表达。

10、在一些方面，本披露涉及治疗与受试者中靶基因的过度表达相关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统、核酸或载体，从而治疗该病症。

11、在一些方面，本披露涉及治疗与受试者中靶基因的错误调控相关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的表达阻遏物或表达阻遏系统、核酸或载体，从而治疗该病症。

12、任何前述方法或组合物的附加特征包括以下列举的实施例中的一个或多个。

13、本领域技术人员将认知到、或不使用过度常规实验就能够确定本文所述发明的特定实施例的许多等效实施例。这样的等同形式意在由以下列举的实施例所涵盖。

14、本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如，本文提及的所有genbank、unigene和entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另外指明，否则本文指定的序列登录号(包括在本文任一表中)是指截至2019年9月23日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。

15、列举的实施例

16、1.一种表达阻遏物，其包含：

17、dna靶向部分和

18、阻遏物结构域，

19、其中该表达阻遏物能够降低靶基因的表达。

20、2.如实施例1所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分结合转录调控元件(例如，启动子、增强子、超级增强子或转录起始位点(tss))，该转录调控元件可操作地连接至该靶基因或结合所述转录调控元件近侧的序列。

21、3.如实施例1或2所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域共价连接至该dna靶向部分。

22、4.如实施例1或2所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域通过接头连接至该dna靶向部分。

23、5.如实施例1-4中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

24、6.如实施例1-4中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端。

25、7.如实施例1-6中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域由选自seq idno:47-56中任一个的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

26、8.如实施例1-7中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域包含根据seqid no:57-66、90中任一个的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

27、9.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是mq1或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:57或90的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

28、10.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是dnmt1或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:58的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

29、11.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是dnmt3a/3l或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:59或60的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

30、12.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是krab或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:61的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

31、13.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是g9a或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:62的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端。

32、14.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是hdac8或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:63的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

33、15.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是lsd1或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:64的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

34、16.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是ezh2或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:64的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，其中任选地该阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端。

35、17.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域是fog1或其功能变体或片段，例如，其中该阻遏物结构域包含seq id no:66的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

36、18.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其进一步包含第二阻遏物结构域。

37、19.如实施例18所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分位于该阻遏物结构域和该第二阻遏物结构域之间。

38、20.一种表达阻遏物，其包含：

39、dna靶向部分，

40、第一阻遏物结构域和

41、第二阻遏物结构域，

42、其中该表达阻遏物能够降低靶基因的表达。

43、21.如任一前述实施例所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分结合转录调控元件(例如，启动子、增强子、超级增强子或转录起始位点(tss))，该转录调控元件可操作地连接至该靶基因或结合所述转录调控元件近侧的序列。

44、22.如实施例18-21中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域与该第二阻遏物结构域相同。

45、23.如实施例18-21中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域与该第二阻遏物结构域不同。

46、24.如实施例18-23中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域和该第二阻遏物结构域共价连接至该dna靶向部分。

47、25.如实施例18-24中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域通过第一接头连接至该dna靶向部分并且该第二阻遏物结构域通过第二接头连接至该dna靶向部分。

48、26.如实施例25的表达阻遏物，其中该第一接头与该第二接头相同。

49、27.如实施例25的表达阻遏物，其中该第一接头与该第二接头不同。

50、28.如实施例18-27中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端。

51、29.如实施例18-28中任一项所述的表达阻遏物，其中该第二阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

52、30.如实施例25-29中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域的c末端通过该第一接头连接至该dna靶向部分的n末端，并且该第二阻遏物结构域的n末端通过该第二接头连接至该dna靶向部分的c末端。

53、31.如实施例18-30中任一项所述的表达阻遏物，其中：

54、该第一阻遏物结构域是ezh2或其功能变体或片段，例如，其中该第一阻遏物结构域包含seq id no:64的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第一阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端；以及

55、该第二阻遏物结构域是krab或其功能变体或片段，例如，其中该第二阻遏物结构域包含seq id no:61的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第二阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

56、32.如实施例18-30中任一项所述的表达阻遏物，其中：

57、该第一阻遏物结构域是g9a或其功能变体或片段，例如，其中该第一阻遏物结构域包含seq id no:62的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第一阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端；以及

58、该第二阻遏物结构域是krab或其功能变体或片段，例如，其中该第二阻遏物结构域包含seq id no:61的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第二阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

59、33.如实施例18-30中任一项所述的表达阻遏物，其中：

60、该第一阻遏物结构域是fog1或其功能变体或片段，例如，其中该第一阻遏物结构域包含seq id no:66的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第一阻遏物结构域在该dna靶向部分的n末端；以及

61、该第二阻遏物结构域是fog1或其功能变体或片段，例如，其中该第二阻遏物结构域包含seq id no:66的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，并且该第二阻遏物结构域在该dna靶向部分的c末端。

62、34.如实施例1-33中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分结合包含seqid no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座。

63、35.如实施例1-34中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分包含crispr/cas分子(例如，无催化活性的crispr/cas蛋白)、锌指结构域或tal效应子分子。

64、36.如实施例35所述的表达阻遏物，其中该crispr/cas分子包含一个或多个选自d10a、d839a、h840a和n863a的突变。

65、37.如实施例1-36中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分结合靶基因的启动子区域、增强子区域(例如超增强子区域)或锚序列。

66、38.如实施例1-37中任一项所述的表达阻遏物，其中该阻遏物结构域包含dnmt1、dnmt3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1，

67、39.如实施例18-38中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一阻遏物结构域包含dnmt1、dnmt3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1，并且该第二阻遏物结构域包含dnmt1、dnmt3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1，

68、40.如实施例1-39中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物由选自seq idno:22-32、92、95中任一个的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

69、41.如实施例1-40中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物包含选自seqid no:33-36、38-44、67-69、93、96中任一个的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

70、42.如实施例1-41中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分由选自seq idno:45或89中任一个的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列编码。

71、43.如实施例1-42中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分包含根据seqid no:46或88中任一个的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

72、44.如实施例18-43中任一项所述的表达阻遏物，其中，

73、(i)该第一阻遏物结构域由选自seq id no:47-56、90中任一个或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的核苷酸序列编码，以及

74、(ii)该第二阻遏物结构域由选自seq id no:47-56、90中任一个或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的核苷酸序列编码。

75、45.如实施例18-43中任一项所述的表达阻遏物，其中，

76、(i)该第一阻遏物结构域包含根据seq id no:57-66中任一个的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列，以及

77、(ii)该第二阻遏物结构域包含根据seq id no:57-66中任一个的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性，或与其差异不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置的序列。

78、46.如任一前述实施例所述的表达阻遏物，其中该dna靶向部分包含tal效应子分子、crispr/cas分子、锌指结构域、tetr结构域、大范围核酸酶结构域或寡核苷酸。

79、47.如任一前述实施例的表达阻遏物，其中该dna靶向部分进一步包含grna，例如，结合包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的grna，例如，其中该grna包含的序列包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

80、48.如实施例35-47中任一项所述的表达阻遏物，其中该dna靶向结构域包含crispr/cas分子，例如，无催化活性的crispr/cas蛋白，和grna，例如，结合包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的grna，例如，其中该grna包含的序列包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸并且该阻遏物结构域包含选自dnmt1、dnmt3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1的部分。

81、49.如实施例35-47所述的表达阻遏物，其中该dna靶向结构域包含crispr/cas分子，例如，无催化活性的crispr/cas蛋白，和grna，例如，结合包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的基因组基因座的grna，例如，其中该grna包含的序列包含seq id no:1-21中任一个的序列的至少14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，该第一阻遏物结构域包含选自dnmt1、dnm t3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1的部分，并且该第二结构域包含选自dnmt1、dnmt3a/3l、mq1、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2或fog1的部分。

82、50.如实施例35-49中任一项所述的表达阻遏物，其中该crispr/cas分子包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)。

83、51.如实施例35-50中任一项所述的表达阻遏物，其中该crispr/cas分子包含无催化活性的crispr/cas蛋白，例如dcas9。

84、52.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其：(i)包含一个或多个核定位信号序列(nls)，或(ii)不包含nls。

85、53.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其在n末端包含第一nls，例如，其中该第一nls具有seq id no:86的序列。

86、54.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其在c末端包含nls，例如第二nls，例如具有seq id no:87的序列。

87、55.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一和该第二nls具有相同序列。

88、56.如实施例52-55中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一和该第二nls具有不同序列。

89、57.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其包含表位标签。

90、58.如实施例57的表达阻遏物，其中该表位标签是ha标签，例如，包含seq id no:80的氨基酸序列的ha标签。

91、59.如实施例37-58中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列包含seq id no:81或82的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

92、60.如实施例37-58中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列包含根据seq idno:83或84的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

93、61.如实施例37-60中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列与该基因位于同一染色体上。

94、62.如实施例37-61中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列在该靶基因的上游(例如，tss上游或启动子上游)。

95、63.如实施例37-61中任一项所述的表达阻遏物，其中该锚序列在该靶基因的下游(例如，tss下游或启动子上游)。

96、64.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该靶基因基因座的结合使细胞中该靶基因的表达与不存在该表达阻遏物时该靶基因的表达相比降低10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

97、65.如前述实施例中任一项所述的表达阻遏物，其中该表达阻遏物与该靶基因基因座的结合使该靶基因的表达明显降低持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天的时间段。

98、66.如实施例18-65中任一项所述的表达阻遏物，其中该第一和/或第二阻遏物结构域包含dna甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白去甲基化酶或组蛋白修饰复合物的募集子。

99、67.一种表达阻遏系统，其包含：

100、包含第一dna靶向部分和第一阻遏物结构域的第一表达阻遏物，和

101、包含第二dna靶向部分和第二阻遏物结构域的第二表达阻遏物，

102、其中该第一dna靶向部分特异性结合第一dna序列，并且该第二dna靶向部分特异性结合不同于该第一dna序列的第二dna序列，并且

103、其中该第一阻遏物结构域不同于该第二阻遏物结构域。

104、68.一种表达阻遏系统，其包含：

105、包含第一dna靶向部分和第一阻遏物结构域的第一表达阻遏物，和

106、包含第二dna靶向部分和第二阻遏物结构域的第二表达阻遏物，

107、其中该第一或第二阻遏物结构域包含mq1结构域或其功能变体或片段，

108、其中该第一阻遏物结构域不同于该第二阻遏物结构域。

109、69.如实施例67或68所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含第三阻遏物结构域。

110、70.如实施例67-69中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含第四阻遏物结构域。

111、71.如实施例67-70中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分特异性结合第一dna序列，并且该第二dna靶向部分特异性结合不同于该第一dna序列的第二dna序列。

112、72.如实施例67-70中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分和该第二dna靶向部分特异性结合相同的dna序列。

113、73.如实施例67-72中任一项所述的表达阻遏系统，

114、其中该第一dna靶向部分包含第一crispr/cas分子，该第一crispr/cas分子包含第一crispr/cas蛋白和第一指导rna，并且该第二dna靶向部分包含第二crispr/cas分子，该第二crispr/cas分子包含第二crispr/cas蛋白和第二指导rna。

115、74.如实施例73所述的表达阻遏系统，

116、其中该第一crispr/cas蛋白不结合该第二指导rna，例如，以至少10、20、50、100、1000或10,000nm的kd结合，并且该第二crispr/cas蛋白不结合该第一指导rna，例如，以至少10、20、50、100、1000或10,000nm的kd结合。

117、75.如实施例73或74中任一项所述的表达阻遏系统：

118、其中该第一crispr/cas蛋白包含与该第二crispr/cas蛋白不同的氨基酸序列。

119、76.如实施例67-75中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或第二dna靶向部分包含crispr/cas分子，该crispr/cas分子包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)。

120、77.如实施例67-76中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分包含第一crispr/cas分子，该第一crispr/cas分子包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)，并且该第二dna靶向部分包含第二crispr/cas分子，该第二crispr/cas分子包含选自表1的不同cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)。

121、78.如实施例70-77中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性。

122、79.如实施例70-78所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含选自setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2的蛋白质或其任一项的功能变体或片段，例如其任一项的set结构域。

123、80.如实施例70-79中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性(例如，赖氨酸去甲基化酶活性)。

124、81.如实施例70-80中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含选自kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66的蛋白质或其任一项的功能变体或片段。

125、82.如实施例70-81中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性。

126、83.如实施例70-82所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含选自hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9的蛋白质，或其任一项的功能变体或片段。

127、84.如实施例70-83中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第二、第三或第四阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性。

128、85.如实施例70-84所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含选自mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l的蛋白质，或其任一项的功能变体或片段。

129、86.如实施例70-85中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

130、87.如实施例70-86所述的表达阻遏系统，其中该第一、第二、第三或第四阻遏物结构域包含选自krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12的蛋白质或其任一项的功能变体或片段。

131、88.如实施例67-87中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

132、第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，并且

133、第二阻遏物结构域包含选自以下的不同蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段。

134、89.如实施例69-88中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

135、(i)第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，并且

136、(ii)第三阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质(例如，不同的蛋白质)：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段。

137、90.如实施例69-89中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

138、(i)第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，

139、(ii)第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质(例如，不同的蛋白质)：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，并且

140、(iii)第三阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段。

141、91.如实施例70-90中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

142、(i)第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，

143、(ii)第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质(例如，不同的蛋白质)：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，

144、(iii)第三阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段并且

145、(iv)第四阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质(例如，不同的蛋白质)：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段。

146、92.如实施例70-91中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

147、(i)第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段，并且

148、(ii)第四阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质(例如，不同的蛋白质)：setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6、hdac7、hdac8、hdac9、hdac10、hdac11、sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6、sirt7、sirt8、sirt9、mq1、dnmt1、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l、krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12或其功能变体或片段。

149、93.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性。

150、94.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性。

151、95.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性。

152、96.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性。

153、97.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

154、98.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白甲基转移酶活性(例如，其中这些组蛋白甲基转移酶活性彼此相同或不同)。

155、99.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性。

156、100.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性。

157、101.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性。

158、102.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

159、103.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白去甲基化酶活性(例如，其中这些组蛋白去甲基化酶活性彼此相同或不同)。

160、104.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性。

161、105.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性。

162、106.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

163、107.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性并且该第二阻遏物结构域包含组蛋白脱乙酰酶活性(例如，其中这些组蛋白脱乙酰酶活性彼此相同或不同)。

164、108.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性。

165、109.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

166、110.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna甲基转移酶活性(例如，其中这些dna甲基转移酶活性彼此相同或不同)。

167、111.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性。

168、112.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性并且该第二阻遏物结构域包含dna去甲基化酶活性(例如，其中这些dna去甲基化酶活性彼此相同或不同)。

169、113.如实施例67-92中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含转录阻遏物活性并且该第二阻遏物结构域包含转录阻遏物活性(例如，其中这些转录阻遏物活性彼此相同或不同)。

170、114.如实施例67-113中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

171、该第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：krab、set结构域(例如，setdb1、ezh2、g9a或suv39h1的set结构域)、组蛋白去甲基化酶lsd1、fog1(例如，fog1的n末端残基)、kap1或其任一项的功能变体或片段；以及

172、该第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：dnmt3a(例如，人dnmt3a)、dnmt3b、dnmt3l、dnmt3a/3l复合物、细菌mq1或其任一项的功能变体或片段。

173、115.如实施例67-114中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

174、该第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：ezh2、g9a、suv39h1、fog1或其任一项的功能变体或片段；以及

175、该第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：dnmt3a(例如，人dnmt3a)、dnmt3b、dnmt3l、dnmt3a/3l、dnmt1、lsd1、fog1、krab、hdac8、细菌mq1或其任一项的功能变体或片段。

176、116.如实施例67-115中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

177、(i)该第一阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：krab、mecp2、hp1、rbbp4、rest、fog1、suz12、kdm1a(即lsd1)、kdm1b(即lsd2)、kdm2a、kdm2b、kdm5a、kdm5b、kdm5c、kdm5d、kdm4b、no66、setdb1、setdb2、ehmt2(即g9a)、ehmt1(即glp)、suv39h1、ezh2、ezh1、suv39h2、setd8、suv420h1、suv420h2、kap1、hdac8、mq1、dnmt1、dnmt3a、dnmt3a/3l，或其任一项的功能变体或片段；以及

178、(ii)该第二阻遏物结构域包含选自以下的蛋白质：krab、fog1、g9a、lsd1、hdac8、ezh2、dnmt3a/3l、mq1、dnmt1、dbmt3a、dnmt3a1、dnmt3a2、dnmt3b1、dnmt3b2、dnmt3b3、dnmt3b4、dnmt3b5、dnmt3b6、dnmt3l或其任一项的功能变体或片段。

179、117.如实施例67-116中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含krab，并且该第二阻遏物结构域包含dnmt3a(例如，人dnmt3a)。

180、118.如实施例67-115中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，并且该第二阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段。

181、119.如实施例67-118中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，并且该第二阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段。

182、120.如实施例67-119中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段并且该第二阻遏物结构域包含细菌mq1或其功能变体或片段。

183、121.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

184、该第一阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端；并且

185、该第二阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的n末端。

186、122.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

187、该第一阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端；并且

188、该第二阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的n末端。

189、123.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

190、该第一阻遏物结构域包含mq1或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端；并且

191、该第二阻遏物结构域包含hdac8或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

192、124.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

193、该第一阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端；并且

194、该第二阻遏物结构域包含hdac8或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

195、125.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

196、该第一阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端；并且

197、该第二阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的n末端。

198、126.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

199、该第一阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端；并且

200、该第二阻遏物结构域包含hdac8或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

201、127.如实施例67-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

202、该第一阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端；并且

203、该第二阻遏物结构域包含hdac8或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

204、128.如实施例69-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

205、该第一阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

206、该第三阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端；并且

207、该第二阻遏物结构域包含mq1或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

208、129.如实施例69-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

209、该第一阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

210、该第三阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端，并且

211、该第二阻遏物结构域包含mq1或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

212、130.如实施例69-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

213、该第一阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

214、该第三阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端，并且

215、该第二阻遏物结构域包含hdac8或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

216、131.如实施例69-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

217、该第一阻遏物结构域包含fog1或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

218、该第三阻遏物结构域包含fog1或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端，并且

219、该第二阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

220、132.如实施例69-120中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

221、该第一阻遏物结构域包含ezh2或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

222、该第三阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端，并且

223、该第二阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

224、133.如实施例69-130中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

225、该第一阻遏物结构域包含g9a或其功能变体或片段，其中任选地该第一阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的n末端，

226、该第三阻遏物结构域包含krab或其功能变体或片段，其中任选地该第三阻遏物结构域在该第一dna靶向部分的c末端，并且

227、该第二阻遏物结构域包含lsd1或其功能变体或片段，其中任选地该第二阻遏物结构域在该第二dna靶向部分的c末端。

228、134.如实施例67-133中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分选自tal效应子分子、crispr/cas分子、锌指结构域、tetr结构域、大范围核酸酶或寡核苷酸。

229、135.如实施例67-134中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二dna靶向部分选自tal效应子分子、crispr/cas分子、锌指结构域、tetr结构域、大范围核酸酶或寡核苷酸。

230、136.如实施例67-135中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分是或包含crispr/cas分子，该crispr/cas分子包含crispr/cas蛋白(例如，其是或包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体))和指导rna。

231、137.如实施例67-136中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二dna靶向部分是或包含crispr/cas分子，该crispr/cas分子包含crispr/cas蛋白(例如，其是或包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体))和指导rna。

232、138.如实施例67-137中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

233、该第一dna靶向部分是或包含crispr/cas分子，该crispr/cas分子包含crispr/cas蛋白，该crispr/cas蛋白是或包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)并且

234、该第二dna靶向部分是或包含crispr/cas分子，该crispr/cas分子包含不同crispr/cas蛋白，该不同crispr/cas蛋白是或包含选自表1的cas蛋白或cpf1蛋白或其任一项的变体(例如，突变体)。

235、139.如实施例135-138中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

236、该第一dna靶向部分是或包含由seq id no:45或89的核酸序列编码的crispr/cas分子，并且

237、该第二dna靶向部分是或包含由seq id no:45或89的核酸序列编码的crispr/cas分子。

238、140.如实施例135-138中任一项所述的表达阻遏系统，其中：

239、该第一dna靶向部分是或包含含有seq id no:46或88的氨基酸序列的crispr/cas分子，并且

240、该第二dna靶向部分是或包含含有seq id no:46或88的氨基酸序列的crispr/cas分子。

241、141.如实施例67-140中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合启动子序列或启动子序列的近侧dna，例如，可操作地连接至靶基因的启动子序列。

242、142.如实施例67-141中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合增强子序列或增强子序列近侧的dna，例如影响靶基因表达和/或与靶基因可操作地连接的增强子序列。

243、143.如实施例67-142中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合靶基因，例如靶基因的转录起始位点和终止密码子之间包含的序列。

244、144.如实施例67-143中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合靶基因的转录起始位点。

245、145.如实施例67-144中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合靶基因的内含子，例如与内含子相关的剪接位点。

246、146.如实施例67-145中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或该第二dna靶向部分特异性结合靶基因的外显子。

247、147.如实施例67-146中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一或第二dna靶向部分特异性结合锚序列。

248、148.如实施例147的表达阻遏系统，其中该锚序列包含seq id no:81或82的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

249、149.如实施例147的表达阻遏系统，其中该锚序列包含seq id no:83或84的序列，或相对其具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个改变的序列。

250、150.如实施例147-149中任一项所述的表达阻遏系统，其中该锚序列与该基因位于同一染色体上。

251、151.如实施例147-149中任一项所述的表达阻遏系统，其中该锚序列与该基因位于不同染色体上。

252、152.如实施例147-151中任一项所述的表达阻遏系统，其中该锚序列在该靶基因的上游(例如，tss上游或启动子上游)。

253、153.如实施例148-151中任一项所述的表达阻遏系统，其中该锚序列在该靶基因的下游(例如，tss下游或启动子上游)。

254、154.如实施例67-141中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列是可操作地连接至靶基因的启动子内或近侧的第一位点，并且该第二dna序列是可操作地连接至靶基因的启动子内或近侧的第二位点。

255、155.如实施例67-142中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列在可操作地连接至靶基因的启动子内或近侧，并且该第二dna序列在影响该靶基因表达并且可操作地连接至该靶基因的增强子内或近侧。

256、156.如实施例67-142中任一项的表达阻遏系统，其中该第一dna序列影响靶基因表达并且可操作地连接至该靶基因的增强子内或近侧，并且该第二dna序列在可操作地连接至该靶基因的启动子内或近侧。

257、157.如实施例67-141或143中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列包含靶基因的转录起始位点并且该第二dna序列在可操作地连接至该靶基因的启动子内或近侧。

258、158.如实施例67-140、142或143中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列包含靶基因的转录起始位点并且该第二dna序列在影响该靶基因表达并且可操作地连接至该靶基因的增强子内或近侧。

259、159.如实施例67-141或143中任一项所述的表达阻遏系统，其中启动子内或近侧的该第一dna序列可操作地连接至靶基因并且该第二dna序列是该靶基因的转录起始位点。

260、160.如实施例67-140、142或143中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列在影响靶基因表达并且可操作地连接至该靶基因的增强子内或近侧，并且该第二dna序列是该靶基因的转录起始位点。

261、161.如实施例67-160中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列和该第二dna序列之间的距离是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对或其间的任何大小，例如20-500个碱基对。

262、162.如实施例67-161中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列和该第二dna序列之间的距离不超过100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对或其间的任何大小，例如20-500个碱基对。

263、163.如实施例67-162中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna序列和该第二dna序列位于不同的核酸上，例如不同的染色体上。

264、164.如实施例67-163中任一项所述的表达阻遏系统，其中该靶基因是β-2-微球蛋白、myc、hspa1b、gata1、apob、foxp3、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl6、cxcl7、和/或cxcl8。

265、165.如实施例73-164中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一指导rna包含对该第一dna序列特异(例如互补)的序列并且该第二指导rna包含对该第二dna序列特异(例如互补)的序列。

266、166.如实施例67-165中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分不明显结合该第二dna序列并且该第二dna靶向部分不明显结合该第一dna序列。

267、167.如实施例67-166中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一dna靶向部分以至少500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10,000或100,000nm的kd结合该第二dna序列，并且该第二dna靶向部分以至少500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10,000或100,000nm的kd结合该第一dna序列。

268、168.如实施例67-167中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合降低细胞中靶基因的表达，例如，与该第一dna序列可操作地连接的靶基因。

269、169.如实施例168的表达阻遏系统，其中与不存在该第一表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

270、170.如实施例67-169中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合使靶基因，例如与该第一dna序列可操作地连接的靶基因的表达明显降低持续以下时间段：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

271、171.如实施例67-170中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合降低细胞中靶基因的表达，例如，与该第二dna序列可操作地连接的靶基因。

272、172.如实施例171的表达阻遏系统，其中与不存在该第二表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

273、173.如实施例67-172中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合使靶基因，例如与该第二dna序列可操作地连接的靶基因的表达明显降低持续以下时间段：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

274、174.如实施例67-173中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合以及该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合降低细胞中靶基因的表达，例如，可操作地连接至该第一dna序列和/或该第二dna序列的靶基因。

275、175.如实施例174的表达阻遏系统，其中与不存在该第一和第二表达阻遏物的情况下的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

276、176.如实施例1-175中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合和该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合使靶基因，例如与该第一dna序列可操作地连接的靶基因的表达明显降低持续以下时间段：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

277、177.如实施例174-176中任一项所述的表达阻遏系统，其中由该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合以及该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合导致的表达降低大于由该第一表达阻遏物与该第一dna序列结合或该第二表达阻遏物与该第二dna序列结合各自导致的表达降低。

278、178.如实施例177所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合以及该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该第一dna序列结合或该第二表达阻遏物与该第二dna序列结合各自对表达的降低高1.05x(即1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过elisa测量或如实施例2-4中所述。

279、179.如实施例174-178所述的表达阻遏系统，其中由该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合以及该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合导致的表达降低比由该第一表达阻遏物与该第一dna序列结合或该第二表达阻遏物与该第二dna序列结合各自导致的表达降低持续更长的时间(例如，更多的小时、天或细胞分裂)。

280、180.如实施例179所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物与该第一dna序列的结合以及该第二表达阻遏物与该第二dna序列的结合对表达的降低比该第一表达阻遏物与该第一dna序列结合或该第二表达阻遏物与该第二dna序列结合各自对表达的降低长(例如，以小时、天或细胞分裂来测量)1.05x(即1.05倍)、1.1x、1.15x、1.2x、1.25x、1.3x、1.35x、1.4x、1.45x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、50x或100x，例如，如通过elisa测量或如实施例2-4中所述。

281、181.如实施例174-180中任一项所述的表达阻遏系统，其中该细胞以每24、36、48、60或72小时不超过一次的速率分裂(并且任选地，至少每24、36、48、60或72小时一次)。

282、182.如实施例174-181中任一项所述的表达阻遏系统，其中该细胞以每24、36、48、60或72小时至少一次的速率分裂(并且任选地，每24、36、48、60或72小时不超过一次)。

283、183.如实施例174-182中任一项所述的表达阻遏系统，其中表达明显地无限定地降低(例如，持续比可通过实验测量的时间更长的时间段)。

284、184.如实施例67-183中任一项所述的表达阻遏系统，其中

285、该第一dna靶向部分包含选自表1的化脓性链球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)，例如化脓性链球菌dcas9，例如，包含seq id no:46的氨基酸序列的dcas9；或选自表1的金黄色葡萄球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)，例如，金黄色葡萄球菌dcas9，例如，包含seq id no:88的氨基酸序列的dcas9并且

286、该第二dna靶向部分包含选自表1的化脓性链球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)，例如化脓性链球菌dcas9，例如，包含seq id no:46的氨基酸序列的dcas9；或含有选自表1的金黄色葡萄球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)的crispr/cas分子，例如，金黄色葡萄球菌dcas9，例如，包含seq id no:88的氨基酸序列的dcas9。

287、185.如实施例67-184中任一项所述的表达阻遏系统，其中

288、该第一dna靶向部分包含含有crispr/cas蛋白的crispr/cas分子，例如无催化活性的dcas9，例如dcas9，例如包含选自d10a、d839a、h840a和n863a突变的一个或多个突变的dcas9；并且

289、该第二dna靶向部分包含含有crispr/cas蛋白的crispr/cas分子，例如无催化活性的dcas9，例如dcas9，例如包含选自d10a、d839a、h840a和n863a突变的一个或多个突变的dcas9。

290、186.如实施例67-185中任一项所述的表达阻遏系统，其中

291、该第一表达阻遏物包含含有crispr/cas分子的第一dna靶向部分以及含有krab或其功能变体或片段的第一阻遏物结构域，该crispr/cas分子包含选自表1的化脓性链球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)，例如化脓性链球菌dcas9；并且

292、该第二表达阻遏物包含含有crispr/cas分子的第二dna靶向部分以及含有细菌mq1或其功能变体或片段的第二阻遏物结构域，该crispr/cas分子包含选自表1的金黄色葡萄球菌crispr/cas蛋白或其变体(例如，突变体)，例如金黄色葡萄球菌dcas9。

293、187.一种多肽，其包含：

294、dna靶向部分；以及

295、包含细菌mq1或其功能变体或片段的阻遏物结构域。

296、188.一种多肽，其包含：

297、dna靶向部分；

298、第一阻遏物结构域，其包含mq1、dnmt1、dnmt3a/3l、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2、fog1或其功能变体或片段，和

299、第二阻遏物结构域，其包含mq1、dnmt1、dnmt3a/3l、krab、g9a、hdac8、lsd1、ezh2、fog1或其功能变体或片段。

300、189.如实施例88a所述的多肽，其中该dna靶向部分位于该第一阻遏物结构域和该第二阻遏物结构域之间。

301、190.一种核酸，其编码如实施例67-189中任一项所述的表达阻遏系统的第一表达阻遏物。

302、191.一种核酸，其编码如实施例67-189中任一项所述的表达阻遏系统的第二表达阻遏物。

303、192.一种核酸，其编码如实施例67-189中任一项所述的表达阻遏系统，例如第一表达阻遏物和第二表达阻遏物。

304、193.如实施例190-192中任一项所述的核酸，其是rna，例如mrna。

305、194.一种表达阻遏系统，其包含：

306、第一核酸，其包含编码如实施例67-189中任一项所述的表达阻遏系统的第一表达阻遏物的序列；以及

307、第二核酸，其包含编码如实施例67-189中任一项所述的表达阻遏系统的第二表达阻遏物的序列。

308、195.一种核酸，其编码如实施例187-189中任一项所述的多肽。

309、196.如实施例190-193或195中任一项所述的核酸，其中该核酸包含mrna。

310、197.一种载体，其包含编码如任何前述实施例所述的表达阻遏物或表达阻遏系统的核酸。

311、198.一种脂质纳米颗粒，其包含如任何前述实施例所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、mrna或载体。

312、199.如实施例198所述的脂质纳米颗粒，其包含可电离脂质，例如阳离子脂质，例如mc3、ssop。

313、200.如实施例198或199所述的脂质纳米颗粒，其进一步包含一种或多种中性脂质、可电离的含胺脂质、可生物降解的炔烃脂质、类固醇、磷脂、多不饱和脂质、结构脂质(例如甾醇)、peg、胆固醇或聚合物缀合脂质。

314、201.一种反应混合物，其包含如任何前述实施例所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体或脂质纳米颗粒。

315、202.如实施例201所述的反应混合物，其进一步包含细胞。

316、203.一种细胞，其包含如实施例1-202中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、mrna、载体或纳米颗粒。

317、204.如实施例203所述的细胞，其中该细胞选自肝细胞、神经元细胞、内皮细胞、肌细胞和淋巴细胞。

318、205.一种细胞，其由包括以下的方法产生：

319、提供i)细胞和ii)如实施例1-202中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、多肽、核酸、载体、脂质纳米颗粒或反应混合物；以及

320、使该细胞与该表达阻遏物、表达阻遏系统、多肽、核酸、载体、脂质纳米颗粒或反应混合物接触。

321、206.一种药物组合物，其包含如实施例1-202中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、多肽、载体、脂质纳米颗粒或反应混合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。

322、207.如实施例1-202中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第一表达阻遏物进一步包含选自以下的另外部分：标记部分或监测部分、可切割部分(例如，位于dna靶向部分和阻遏物结构域之间或位于多肽的n或c末端的可切割部分)、小分子、膜易位多肽、或药剂部分。

323、208.如实施例1-202中任一项所述的表达阻遏系统，其中该第二表达阻遏物进一步包含选自以下的另外部分：标记部分或监测部分、可切割部分(例如，位于dna靶向部分和阻遏物结构域之间或位于多肽的n或c末端的可切割部分)、小分子、膜易位多肽、或药剂部分。

324、209.一种降低细胞中靶基因组序列的表达的方法，该方法包括：

325、提供如实施例1-204或206中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、多肽、载体、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物；以及

326、使该细胞与该表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、多肽、载体、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物接触

327、从而降低该靶基因组序列的表达。

328、210.一种在细胞中表观遗传修饰靶基因组序列的方法，该方法包括：

329、提供如实施例1-204或206中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体、多肽、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物；以及

330、使该细胞与该表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体、多肽、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物接触，

331、从而表观遗传修饰该靶基因组序列。

332、211.如实施例209或210所述的方法，其中该靶基因组序列是：

333、靶基因(例如，靶基因内的位点，例如外显子、内含子或剪接位点)，例如编码β-2-微球蛋白(β2m)的基因、编码myc的基因、编码hspa1b的基因，或编码gata1的基因，

334、可操作地连接至靶基因的转录控制元件，或

335、靶基因近侧的锚序列或与可操作地连接至该靶基因的锚序列介导的连接相关联的锚序列。

336、212.如实施例211所述的方法，其中该表观遗传修饰导致该靶基因表达的降低。

337、213.如实施例174-212中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、细胞、药物组合物、核酸、载体或方法，其中该细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。

338、214.如实施例213所述的方法，其中该方法离体(例如，在来自受试者的样品中)或体内(例如，通过向受试者施用该表达阻遏系统)进行。

339、215.如实施例209-214中任一项所述的方法，其中与除了不存在该表达阻遏系统之外在其他方面相似的细胞中的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

340、216.如实施例209-214中任一项所述的方法，其中与除了未接触该表达阻遏系统之外在其他方面相似的细胞中的表达相比，表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

341、217.如实施例209-216中任一项所述的方法，其中表达降低持续以下时间段：至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次细胞分裂，例如，如通过elisa测量或如实例2-4中所述。

342、218.如实施例215-217中任一项所述的方法，其中表达的降低包括该靶基因编码的rna例如mrna水平的降低。

343、219.如实施例215-218中任一项所述的方法，其中表达的降低包括该靶基因编码的蛋白质水平的降低。

344、220.如实施例209-219中任一项所述的方法，其中提供包括使该细胞与编码针对包含该靶基因的细胞的表达阻遏系统的核酸，例如载体接触。

345、221.如实施例209-220中任一项所述的方法，其中编码该第一表达阻遏物的核酸布置在第一核酸分子上并且编码该第二表达阻遏物的核酸布置在第二核酸分子上。

346、222.如实施例209-221中任一项所述的方法，其中编码该第一表达阻遏物的核酸与编码该第二表达阻遏物的核酸布置在相同的核酸分子上。

347、223.如实施例209-222中任一项所述的方法，其中施用包括使该细胞与该第一核酸分子和该第二核酸分子一起接触，例如同时接触。

348、224.如实施例209-223中任一项所述的方法，其中施用包括使该细胞与该第一核酸分子和该第二核酸分子分开接触，例如，顺序接触。

349、225.如实施例209-224中任一项所述的方法，其中提供包括使该细胞与包含该表达阻遏系统或编码该表达阻遏系统的核酸(例如载体)的囊泡接触。

350、226.如实施例209-225中任一项所述的方法，其中提供包括使该细胞与包含该表达阻遏系统或编码该表达阻遏系统的核酸(例如载体)的脂质纳米颗粒(lnp)接触。

351、227.如实施例209-226中任一项所述的方法，其中该表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，并且提供包括施用该第一表达阻遏物和分开地施用该第二表达阻遏物。

352、228.如实施例209-227中任一项所述的方法，其中该表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物并且提供包括一起施用该第一表达阻遏物和该第二表达阻遏物，例如同时施用。

353、229.一种治疗与受试者中靶基因的过度表达相关的病症的方法，该方法包括：

354、向该受试者施用如实施例1-204或206-208中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体、多肽、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物，

355、从而治疗与受试者中靶基因的过度表达相关的病症。

356、230.一种治疗与受试者中靶基因的错误调控相关的病症的方法，该方法包括：

357、向该受试者施用如实施例1-204或206-208中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体、多肽、脂质纳米颗粒、反应混合物、细胞或药物组合物，

358、从而治疗与受试者中靶基因的错误调控相关的病症。

359、231.一种制备包含表达阻遏系统的细胞的方法，该方法包括：

360、提供如实施例1-201或206-208中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体、多肽或药物组合物；并且

361、使该细胞与该表达阻遏物、表达阻遏系统、核酸、载体或药物组合物接触，

362、从而制备包含表达阻遏系统的细胞。

363、232.一种制备编码表达阻遏系统的核酸的方法，该方法包括：

364、提供编码如实施例67-186、207或208中任一项所述的表达阻遏系统的第一表达阻遏物的第一核酸；

365、提供编码如实施例67-186、9207或208中任一项所述的表达阻遏系统的第二表达阻遏物的第二核酸；

366、将该第一核酸和该第二核酸组合(例如，连接或重组)成单个核酸分子，

367、从而制备编码表达阻遏系统的核酸。

368、233.一种细胞，其通过如实施例209-228或230中任一项所述的方法处理或产生。

369、234.如实施例233所述的细胞，其中该细胞不包含该表达阻遏系统，例如，该表达阻遏系统的至少一种组分(例如，所有组分)。

370、235.如实施例233或234中任一项所述的细胞，其中相对于未通过如实施例209-228或230中任一项所述的方法接触、处理或产生的细胞，该靶基因的表达降低。

371、236.一种试剂盒，其包含容器，该容器包含组合物，该组合物包含如实施例1-208中任一项所述的表达阻遏物、表达阻遏系统、编码所述表达阻遏物或表达阻遏系统的一种或多种核酸、载体、脂质纳米颗粒或药物组合物以及包含至少一种用所述组合物调节例如降低细胞内基因表达的方法的一套说明书。

372、定义

373、锚序列：如本文所用的术语“锚序列”是指被成核剂识别的核酸序列，其充分结合以形成锚序列介导的连接，例如复合物。在一些实施例中，锚序列包含一个或多个ctcf结合基序。在一些实施例中，锚序列不位于基因编码区内。在一些实施例中，锚序列位于基因间区域内。在一些实施例中，锚序列不位于增强子或启动子内。在一些实施例中，锚序列位于距离任何转录起始位点至少400bp、至少450bp、至少500bp、至少550bp、至少600bp、至少650bp、至少700bp、至少750bp、至少800bp、至少850bp、至少900bp、至少950bp、或至少1kb处。在一些实施例中，锚序列位于与基因组印记、单等位基因表达和/或单等位基因表观遗传标记物无关的区域内。在一些实施例中，锚序列具有一种或多种选自以下的功能：结合内源性成核多肽(例如，ctcf)、与第二种锚序列相互作用以形成锚序列介导的连接，或与锚序列介导的连接之外的增强子隔离。在本披露的一些实施例中，提供了可以特异性靶向一个或多个特定锚序列，而不靶向其他锚序列(例如，在不同上下文中可能含有成核剂(例如，ctcf)结合基序的序列)的技术；此类靶向的锚序列可以被称为“靶锚序列”。在一些实施例中，靶锚序列的序列和/或活性受到调节，而可能存在于与靶向的锚序列相同的系统中(例如，在相同的细胞中和/或在一些实施例中在相同的核酸分子(例如，相同的染色体)上)的一个或多个其他锚序列的序列和/或活性不受调节。在一些实施例中，锚序列包含或者是成核多肽结合基序。在一些实施例中，锚序列邻近成核多肽结合基序。

374、锚序列介导的连接：如本文所用的术语“锚序列介导的连接”是指一种dna结构，在一些情况下是一种复合物，其经由通过一种或多种多肽(如成核多肽)或者一种或多种蛋白质和/或核酸实体(如rna或dna)(其结合锚序列以实现锚序列之间的空间接近和功能性连接)与dna中至少两个锚序列的物理相互作用或结合而产生和/或维持(参见，例如图1)。

375、相关联：如果一个事件或实体的存在、水平、形式和/或功能与另一个事件或实体相关联，则两个事件或实体彼此“相关”,如该术语在本文中所使用的。例如，在一些实施例中，如果特定实体(例如，多肽、遗传特征、代谢物、微生物等)的存在、水平、形式和/或功能与疾病、障碍或病症的发病率和/或易感性相关(例如，在相关群体中)，则其被认为与特定疾病、障碍或病症相关联。在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使得它们在物理上彼此接近和/或保持在物理上彼此接近，则它们在物理上彼此“相关联”。在一些实施例中，在物理上彼此相关联的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施例中，在物理上彼此相关联的两个或更多个实体不是彼此共价连接，而是非共价结合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性、及其组合。在一些实施例中，当核酸至少部分位于靶基因组或转录复合物内，并且dna序列中基因的表达受到靶基因组或转录复合物的形成或破坏的影响时，dna序列与靶基因组或转录复合物“相关联”。

376、结构域：如本文所用，术语“结构域”是指实体的区段或部分。在一些实施例中，“结构域”与实体的特定结构和/或功能特征相关联，使得当该结构域与其父实体的其余部分物理分离时，它基本上或完全保留该特定结构和/或功能特征。可替代地或另外地，在一些实施例中，结构域可以是或包括实体的一部分，该实体在与该(父)实体分离并与不同的(接收)实体连接时，基本上保留和/或赋予接收实体一个或多个在父实体中表征它的结构和/或功能特征。在一些实施例中，结构域是或包含分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸、多肽等)的区段或部分。在一些实施例中，结构域是或包含多肽的区段。在一些此类实施例中，结构域的特征在于特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠特征、螺旋卷曲特征、随机卷曲特征等)，和/或特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号活性等)。

377、表达阻遏物：如本文所用，术语“表达阻遏物”是指具有一种或多种功能性的药剂或实体，其降低细胞中靶基因的表达并特异性结合dna序列(例如，与靶基因相关的dna序列，或可操作地连接至靶基因的转录控制元件)。表达阻遏物包含至少一个dna靶向部分和至少一个阻遏物结构域。

378、表达阻遏系统：如本文所用，术语“表达阻遏系统”指降低细胞中靶基因表达的多个表达阻遏物。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物和第二表达阻遏物(或编码第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的核酸)一起存在于单一组合物中，混合物或药物组合物中。在一些实施例中，表达阻遏系统包含第一表达阻遏物和第二表达阻遏物，其中第一表达阻遏物和第二表达阻遏物(或编码第一表达阻遏物和第二表达阻遏物的核酸)存在于分开的组合物或药物组合物中。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物同时存在于同一细胞中。在一些实施例中，第一表达阻遏物和第二表达阻遏物不同时存在于同一细胞中，例如，它们顺序地存在。例如，第一表达阻遏物可以在细胞中存在第一时间段，然后第二表达阻遏物可以在细胞中存在第二时间段，其中第一和第二时间段可以重叠或不重叠。

379、基因组复合物：如本文所用，术语“基因组复合物”是经由多个蛋白质和/或其他组分(可能包括基因组序列元件)之间和其中的相互作用，将在一条或多条染色体上彼此隔开的两个基因组序列元件聚集在一起的复合物。在一些实施例中，基因组序列元件是锚序列，复合物的一种或多种蛋白质组分与之结合。在一些实施例中，基因组复合物可以包含锚序列介导的连接。在一些实施例中，基因组序列元件可以是或包含ctcf结合基序、启动子和/或增强子。在一些实施例中，基因组序列元件包括启动子和/或调控位点(例如，增强子)中的至少一者或二者。在一些实施例中，复合物形成在一个或多个基因组序列元件处成核和/或通过一种或多种蛋白质组分与一个或多个基因组序列元件的结合而成核。如本领域技术人员将理解的，在一些实施例中，经由形成复合物进行的基因组位点的共定位(例如，结合)改变了一个或多个基因组序列元件处或附近(在一些实施例中，包括它们之间)的dna拓扑结构。在一些实施例中，基因组复合物包含锚序列介导的连接，其包含一个或多个环。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物由成核多肽(例如像ctcf和/或黏连蛋白)成核。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物可以包含例如ctcf、黏连蛋白(cohesin)、非编码rna(例如，erna)、转录机器蛋白(例如，rna聚合酶、一个或多个转录因子，例如选自由tfiia、tfiib、tfiid、tfiie、tfiif、tfiih等组成的组)、转录调节因子(例如，中介体(mediator)、p300、增强子结合蛋白、阻遏物结合蛋白、组蛋白修饰剂等)等。在一些实施例中，如本文所述的基因组复合物包含一个或多个多肽组分和/或一个或多个核酸组分(例如，一个或多个rna组分)，在一些实施例中，它们可以彼此相互作用和/或与一个或多个基因组序列元件(例如，锚序列、启动子序列、调节序列(例如，增强子序列))相互作用，以便将一段基因组dna限制到拓扑结构(例如，环)中，当复合物没有形成时，不会采用这种拓扑结构。

380、核酸：如本文所用，在其最广义上，术语“核酸”是指被并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含rna；在一些实施例中，“核酸”是或包含dna。在一些实施例中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核酸类似物或由其组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种“肽核酸”或由其组成，这些肽核酸是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本披露的范围内。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由其组成。在一些实施例中，核酸是、包含一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基、及其组合)或由其组成。在一些实施例中，与天然核酸中的相比，核酸包含一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能基因产物(如rna或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制以及化学合成中的一种或多种来制备核酸。在一些实施例中，核酸长度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，核酸部分或全部是单链的；在一些实施例中，核酸部分或全部是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个编码多肽的元件或者是编码多肽的序列的互补序列的核苷酸序列。在一个实施例中，核酸具有酶活性。

381、可操作地连接：如本文所用，短语“可操作地连接”是指一种并列关系，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与功能元件(例如，基因)“可操作地连接”的转录控制元件以这样的方式关联：在与转录控制元件相容的条件下实现功能元件(例如，基因)的表达和/或活性。在一些实施例中，“可操作地连接的”转录控制元件与感兴趣的编码元件(例如，基因)是连续的(例如，共价连接)；在一些实施例中，可操作地连接的转录控制元件反式作用于感兴趣的功能元件(例如，基因)或以其他方式在距其一定距离处起作用。在一些实施例中，可操作地连接意味着两个核酸序列包含在同一核酸分子上。在另一个实施例中，可操作地连接可以进一步意指两个核酸序列在同一核酸分子上彼此接近，例如，彼此在1000、500、100、50或10个碱基对内或彼此直接邻近。

382、肽、多肽、蛋白质：如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指由通过肽键或通过除了肽键之外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含两个或更多个通过肽键或通过除了肽键之外的方式相互连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链和长链二者，该短链在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体，并且该长链在本领域中通常称为蛋白质，这些蛋白质具有许多类型。

383、阻遏物结构域：如本文所用，术语“阻遏物结构域”是指具有一种或多种功能的结构域，当适当地定位在细胞核中时，该结构域降低细胞中靶基因的表达。在一些实施例中，阻遏物结构域是或包括多肽。在一些实施例中，阻遏物结构域是或包含多肽和核酸。与阻遏物结构域相关联的功能可能直接影响靶基因的表达，例如，阻断会刺激该基因的表达的转录因子的募集。与阻遏物结构域相关的功能可能会间接影响靶基因的表达，例如，引入表观遗传修饰或募集其他引入表观遗传修饰的因子，从而诱导染色体拓扑结构的变化，从而抑制靶基因的表达。

384、特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”是指在结合发生的环境中区分可能的结合配偶体的能力。在一些实施例中，当其他潜在靶标存在时与一个特定靶标相互作用的结合剂被称为“特异性结合”至与其相互作用的靶标。在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的结合程度来评估；在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估。在一些实施例中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体和另一实体之间的选择性相互作用竞争的能力来评估。在一些实施例中，特异性结合是通过在一定浓度范围内进行此类检测或确定来评估的。

385、基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”可以用于本文的一些实施例中，以捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在不完整性。

386、症状减轻：如本文所用，当特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状的程度(例如，强度、严重性等)和/或频率降低时，可以使用短语“症状减轻”。在一些实施例中，延迟特定症状的发作被认为是降低该症状频率的一种形式。

387、靶标：根据本披露，如果一种试剂或实体在它们彼此接触的条件下与靶向的试剂或实体特异性结合，则认为该试剂或实体“靶向”另一种试剂或实体。例如，在一些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)靶向其同源表位或抗原。在一些实施例中，具有特定序列的核酸靶向基本上互补序列的核酸。

388、靶基因：如本文所用，术语“靶基因”意指被靶向用于调节例如表达的基因。在一些实施例中，靶基因是靶向的基因组复合物的一部分(例如，其基因组序列的至少一部分作为靶基因组复合物的一部分的基因，例如在锚序列介导的连接内)，该基因组复合物被一种或多种如本文所述的调节剂靶向。在一些实施例中，调节包括抑制靶基因的表达。在一些实施例中，通过将靶基因或可操作地连接至靶基因上的转录控制元件与本文所述的表达阻遏系统(例如表达阻遏物)接触来调节靶基因。在一些实施例中，靶基因在细胞(例如，受试者(例如，患者)中的细胞)中异常表达(例如，过表达)。

389、dna靶向部分：如本文所用，在表达阻遏物的上下文中，术语“dna靶向部分”意指与dna序列(例如，与靶基因相关联的dna序列，或可操作地连接至靶基因的转录控制元件)特异性结合的结构域。

390、治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用至受试者时，具有治疗效果和/或引起所期望的生物学和/或药理学效果的试剂。在一些实施例中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的任何物质。在一些实施例中，治疗剂包含本文所述的表达阻遏系统，例如表达阻遏物。在一些实施例中，治疗剂包含编码本文所述的表达阻遏系统例如表达阻遏物的核酸。在一些实施例中，治疗剂包含本文所述的药物组合物。

391、治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时，引起所期望生物应答的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制品)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当施用至患有或易患疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防疾病、障碍和/或病症和/或延迟其发作的量。如本领域的普通技术人员将理解，物质的有效量可取决于以下这类因素变化：如一个或多个所希望的生物学终点、待递送的物质、一个或多个靶细胞或一个或多个组织等。例如，在一些实施例中，用于治疗疾病、障碍和/或病症的配制品中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发病率的量。在一些实施例中，治疗有效量以单个剂量施用；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。