靶细胞限制性、共刺激性、双特异性二价抗CD28抗体的制作方法

本发明提供了一种新的双特异性抗cd28抗体形式，其是二价的并且包含两个cd28结合位点和至少一个靶标结合位点。本发明的双特异性抗cd28抗体由于其严格的靶细胞限制性的共刺激活性而具有令人惊讶的优势。本发明的双特异性cd28抗体被提供用于单独或与诱导cd3/t细胞受体信号的另一双特异性抗体组合来治疗疾病。描述t细胞的活化是抗原特异性免疫反应启动的核心。在过去的几十年里，已经鉴定出许多塑造这一过程的t细胞表面受体。最重要的是抗原特异性t细胞受体(tcr)/cd3复合体。当mhc分子呈递的抗原肽与tcr结合时，通过复合体的cd3部分的信号(也称为“信号一”)，启动t细胞活化[1]。重要的是，为了获得有效和持续的反应，需要通过cd28、4-1bb或ox40等受体的另外的共刺激信号(“第二信号”)[2,3]。事实上，在缺乏此类信号的情况下，分离的tcr/cd3刺激可能最终导致t细胞无反应性或甚至死亡，因此共刺激信号似乎是有效的t细胞反应的核心先决条件[4,5]。参与t细胞活化的表面受体的鉴定是两种功能非常相似的策略的基础，这两种策略旨在招募对抗肿瘤细胞的t细胞[6]：·用嵌合受体转染car t细胞，所述嵌合受体包含结合肿瘤相关抗原(taa)的抗体部分和cd3分子的细胞内信号基序[7]·类似地，已经构建了与taa以及cd3分子结合的双特异性抗体(bsab)，这里称为bsabcd3[8]。这两种类型的试剂都能够独立于t细胞的抗原特异性将t细胞重定向至肿瘤细胞，并且已经在80年代末提出[9-13]。它们配备了针对cd19的抗体部分，如今已被稳固地建立用于b细胞衍生的白血病和淋巴瘤的治疗。然而，这两种试剂类型也有一个共同的主要副作用：过度的全身性t细胞活化导致——通常是严重的——剂量限制性细胞因子释放综合征[14]。然而，也有显著的区别：“第一代”car t细胞仅含有cd3衍生的信号基序，具有有限的治疗效率。只有当“第二代”car构建体配备有来自共刺激分子cd28和/或4-1bb的额外基序时，它们才能够发挥持久的治疗作用[15]。值得注意的是，在80年代末已经提出了具有taa×cd3-和taa×cd28的双特异性抗体的组合应用[16]，但尚未发展到监管批准阶段。这是由于实现这种方法所需的大量技术努力，但也由于2006年所谓的tegenero事件的负面影响，当时六名健康志愿者在超拮抗cd28抗体的输注期间经历了严重的细胞因子释放综合征，需要立即对所有参与者进行重症监护[17]。这显著地表明，刺激t细胞的抗体的激动活性将受到靶细胞的限制，也就是说，依赖于与相应靶抗原的结合，以避免临床应用中不可耐受的副作用。在实践中，这可以通过(i)选择合适的fc耗尽的抗体形式来防止t细胞被表达fcr的细胞而不是靶细胞活化，以及(ii)通过刺激性抗体的亲和力和/或价的仔细设计来实现。重组抗体技术为基于双功能和多功能抗体的分子的构建提供了多种形式[18]。基准bsab博纳吐单抗(blinatumomab)是一种具有cd19×cd3特异性的抗体，具有所谓的双特异性t细胞衔接器(bite)形式，由两个由甘氨酸丝氨酸接头融合的单链抗体组成。由于fc部分的缺乏以及cd3结合部分的单价性和相当低的亲和力，这种形式支持靶细胞限制性。然而，bite分子具有低分子量，导致相应的约1小时的低血清半衰期。这需要繁琐的连续输注方案。通过ch2结构域中的选定突变而fc减弱的基于全长igg的形式提供了相当大的半衰期的优点，但需要仔细设计，特别是如果t细胞刺激部分是二价的并且针对cd28而不是cd3。这是因为一般来说，二价形式的cd3抗体不会活化t细胞[19]。它们需要固定化，例如通过与表达fcr的细胞结合。相反，cd28抗体可以作为可溶性二价抗体递送有效的共刺激[20]。因此，原则上，似乎很难用含有二价cd28结合部分的taa×cd28抗体实现靶细胞限制性活性。在本技术中，本发明描述了具有二价cd28结合部分的双特异性taa×cd28抗体，该二价cd28结合部分为完全靶细胞限制性的，以避免在这些试剂的临床应用期间的系统性t细胞活化。即使实现了靶细胞限制，在几乎所有情况下，只要选定的靶抗原在正常健康组织上表达，特异性问题仍然存在。这导致了t细胞不理想的“肿瘤脱靶(off-tumor ontarget)”活化。这个问题的例子是众所周知的博纳吐单抗的副作用，博纳吐单抗是一种靶向cd19的bsabcd3，cd19是一种在正常b细胞和脑壁细胞上表达的抗原[21]。这导致脑组织中的系统性t细胞活化以及相应的剂量限制性副作用。为了解决这里举例说明的特异性问题，我们还建议在本技术中使用靶细胞限制性bicos与针对b7h3的taa×tcr/cd3bsab的组合，b7h3是一种在肿瘤细胞和肿瘤血管系统上表达的taa。这些bsabcd3本身只诱导微弱的亚促有丝分裂(submitogenic)t细胞活化，因此在很大程度上依赖于bicos的存在。或者，亚促有丝分裂cd3刺激可以通过合适的低剂量促有丝分裂bsabcd3来实现。在任何情况下，如果这两种成分针对两种不同的靶标抗原，则这种bsab组合的特异性将大大增加，因为它们的活性取决于这两种不同靶标抗原的同时存在。综上所述，需要进一步的治疗选择，其允许肿瘤块的有效靶向，这可以通过靶向存在于肿瘤血管系统上的这种肿瘤相关抗原来实现。因此，本发明试图鉴定可用于癌症病症的治疗的抗体。

背景技术：

技术实现思路

0、发明简述

1、通常，通过简要描述，本发明的主要方面可以描述如下：

2、在第一方面，本发明涉及结合分子，其至少是双特异性的，包括至少两个第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点，用于受试者的疾病的治疗，其中

3、·所述至少两个第一抗原结合位点能够特异性结合t细胞特异性表面糖蛋白cd28的表位；和

4、·所述至少一个第二抗原结合位点能够结合在受试者中与疾病相关的细胞上或细胞中表达的抗原靶蛋白的表位；

5、其中所述治疗包括向所述受试者施用所述结合分子。

6、在备选的方面，本发明还涉及内皮糖蛋白结合分子，其包含至少具有序列rnyvtgfdy(seq id no:16)的重链互补决定区(cdr)3，或与该序列相比具有不超过3、2，优选不超过1个氨基酸突变的序列；和具有序列hqylssyt(seq id no:20)的轻链cdr3，或与该序列相比具有不超过3、2，优选不超过1个氨基酸突变的序列。

7、在第二方面，本发明涉及分离的核酸，其包含编码第一方面中任一项的结合分子、或结合分子的抗原结合片段或单体(例如重链或轻链)的序列。

8、在第三方面，本发明涉及核酸构建体(nac)，其包含第二方面的核酸和一个或多个另外的序列特征，所述序列特征允许编码的结合分子或所述结合分子的组分或(例如抗体重链或轻链)在(宿主)细胞中的表达。

9、在第四方面，本发明涉及包含根据第二方面或第三方面的核酸或nac的重组宿主细胞。

10、在第五方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包括：(i)第一方面的结合分子，或(ii)第二方面或第三方面的核酸或nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稳定剂和/或赋形剂。

11、在第六方面，本发明涉及包装或药物组合物的试剂盒，所述试剂盒在单独的容器中包含：(i)前述任一方面中所述的分离的结合分子、编码所述分离的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的结合分子的重组宿主细胞；和(ii)前述任一方面中所述的分离的另外的结合分子、编码所述分离的另外的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的另外的结合分子的重组宿主细胞。

12、在第七方面，本发明涉及用于药物的组分，其中所述组分选自由以下组成的列表：(i)第一方面的结合分子，或(ii)第二方面或第三方面的核酸或nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞和(iv)根据第五方面或第六方面的药物组合物或试剂盒。