本发明涉及gpc3(glypican 3)特异性抗体及其用途，更详细地，涉及与gpc3特异性结合的抗体、包含上述抗体的嵌合抗原受体、表达上述嵌合抗原受体嵌合抗原受体-t(car-t)细胞以及包含它们的用于预防或治疗由表达gpc3的细胞介导的疾病的药物组合物。
背景技术：
1、已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3，glypican 3)为属于固定有糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol)的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfateproteoglycan)的聚糖集团中的癌胚抗原(oncofetal antigen)的一种，已知细胞膜结合的聚糖-3由通过一个以上二硫键(disulfide bond)连接的两个亚基(subunit)构成。
2、成人组织中，在胎盘以外的组织确认不到gpc3的表达，但在肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状上皮细胞癌等多种癌症组织中确认到其表达。如上所述，gpc3与甲胎蛋白(α-fetoprotein；afp)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen；cea)等蛋白质一样是胚胎期的组织中表达的蛋白质，因此分类为癌胚抗原。即，gpc3虽不在正常组织细胞中表达，但却表现出在癌细胞中特异性表达的特征，因此可以用作癌症治疗的靶向分子或肿瘤标记物及诊断标记物。
3、与gpc3的功能及用途相关地，据报告，可以发挥肝细胞癌标记物的功能。根据最近的报告，gpc3在多种癌症，尤其是在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)、黑色素瘤(melanoma)、维尔姆斯氏瘤(wilm’s tumor)以及肝母细胞瘤(hepatoblastoma)中表达(jakubovic and jothy,ex mol path,82:184-189,2007；nakatsura and nishimura,biodrugs,19(2):71-77 2005)，有发表可以实际利用对gpc3的抗体来治疗肝癌等肿瘤的观点的报告(国际公开专利wo2014/097648号；国际公开专利wo 2018-131586号；韩国公开专利第10-2017-0049831号等)。
4、迄今，虽有几种抗gpc3抗体的报告，但尚无具有令人满意的治疗功效，尤其具是有对癌症的优秀治疗功效的抗体的报告。因此，对具有更为优秀的治疗功效的抗gpc3抗体的需求日益高涨。
技术实现思路
1、技术问题
2、于是，为了开发更为特异性地与gpc3结合的抗体，本发明中通过筛选与gpc3结合的抗体来确立了6种新型抗体(10e9、8b2、7c6、7b9、5e11、1a8)，确认到本发明中筛选的6种抗体特异性地与gpc3抗原结合。并且，确认到可以利用本发明的与gpc3特异性结合的抗体制备以gpc3为靶向的嵌合抗原受体，从而完成本发明。
3、因此，本发明的目的在于，提供与gpc3特异性结合的抗体。
4、本发明的再一目的在于，提供编码上述抗体的多核苷酸、表达上述抗体的载体、由上述载体转化的重组细胞。
5、本发明的另一目的在于，提供包含上述抗体或表达靶向gpc3的嵌合抗原受体免疫效应细胞的用于预防或治疗由表达gpc3的细胞介导的疾病的药物组合物。
6、本发明的又一目的在于，提供包含上述抗体的用于诊断或监控由表达gpc3的细胞介导的疾病的组合物。
7、技术方案
8、为了实现上述目的，提供由如下部分构成的与gpc3特异性结合的抗体或其片段：(1)包含由序列1的氨基酸表示的cdr1区域、由序列2的氨基酸表示的cdr2区域及由序列3的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列4的氨基酸表示的cdr1区域、由序列5的氨基酸表示的cdr2区域及由序列6的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(2)包含由序列11的氨基酸表示的cdr1区域、由序列12的氨基酸表示的cdr2区域及由序列13的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列14的氨基酸表示的cdr1区域、由序列15的氨基酸表示的cdr2区域及由序列16的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(3)包含由序列21的氨基酸表示的cdr1区域、由序列47的氨基酸表示的cdr2区域及由序列23的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列24的氨基酸表示的cdr1区域、由序列25的氨基酸表示的cdr2区域及由序列26的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(4)包含由序列31的氨基酸表示的cdr1区域、由序列32的氨基酸表示的cdr2区域及由序列33的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列34的氨基酸表示的cdr1区域、由序列35的氨基酸表示的cdr2区域及由序列36的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(5)包含由序列41的氨基酸表示的cdr1区域、由序列42的氨基酸表示的cdr2区域及由序列43的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列44的氨基酸表示的cdr1区域、由序列45的氨基酸表示的cdr2区域及由序列46的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；或者(6)包含由序列51的氨基酸表示的cdr1区域、由序列52的氨基酸表示的cdr2区域及由序列53的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列54的氨基酸表示的cdr1区域、由序列55的氨基酸表示的cdr2区域及由序列56的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区。
9、在本发明的一优选实施例中，上述抗体可以为单克隆抗体，优选地，可以为单链可变区片段(scfv，single-chain variable fragment)。
10、在本发明的再一优选实施例中，上述(1)抗体由以序列7的氨基酸表示的重链可变区及以序列8的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(2)抗体由以序列17的氨基酸表示的重链可变区及以序列18的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(3)抗体由以序列27的氨基酸表示的重链可变区及以序列28的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(4)抗体由以序列37的氨基酸表示的重链可变区及以序列38的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(5)抗体由以序列47的氨基酸表示的重链可变区及以序列48的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(6)抗体由以序列57的氨基酸表示的重链可变区及以序列58的氨基酸表示的轻链可变区构成。
11、为了实现再一目的，本发明提供编码上述与gpc3特异性结合的抗体的多核苷酸。
12、并且，本发明提供包含编码上述与gpc3特异性结合的抗体的多核苷酸的载体。
13、并且，本发明提供用于生产由上述载体转化的与gpc3特异性结合的抗体或其片段的重组细胞。
14、为了实现还有一目的，本发明提供一种嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor：car)，包含：gpc3-结合结构域；跨膜结构域(transmembrane domain)；共刺激域(costimulatory domain)；以及细胞内信号转导结构域(intracellular signaltransduction domain)，上述gpc3-结合结构域可以选自本发明的可以与gpc3特异性结合的抗体或其片段。
15、在本发明的一优选实施例中，上述跨膜结构域可以源自选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152及pd1组成的组中的蛋白质。
16、在本发明的还有一优选实施例中，上述共刺激域可以源自选自由cd28、4-1bb、ox-40及icos组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可以源自cd3ζ。
17、在本发明的另一优选实施例中，还可以包含位于上述gpc3-结合结构域的c末端与跨膜结构域的n末端之间的铰链区(hinge region)，上述铰链区可以源自cd8α。
18、为了实现另一目的，本发明提供编码上述嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。
19、并且，本发明提供包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的载体。
20、在本发明的一优选实施例中，上述载体可以为质粒(plasmid)、反转录病毒(retroviral)载体或慢病毒(lentiviral)载体。
21、并且，本发明提供包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸且表达上述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
22、在本发明的一优选实施例中，上述免疫效应细胞可以为t细胞。
23、为了实现又一目的，本发明提供用于预防或治疗表达gpc3的癌症或肿瘤的药物组合物，包含：表达靶向gpc3的嵌合抗原受体的免疫效应细胞；或者与gpc3特异性结合的抗体或其片段。
24、在本发明中，表达gpc3的癌症或肿瘤可以选自由肝癌、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、大肠癌、结肠癌、胰脏癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食管癌、胆管癌、睾丸癌、直肠癌、头颈部癌、颈椎癌、尿道癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤及神经胶质瘤组成的组中。
25、本发明的又一目的在于，提供包含上述抗体的用于诊断或监控由表达gpc3的细胞介导的疾病的组合物。
26、发明的效果
27、在本发明中，通过筛选更为特异性地与gpc3结合的抗体来确立6种新型抗体(10e9、8b2、7c6、7b9、5e11、1a8)，确认到上述新型抗体与gpc3抗原特异性结合。
28、并且，确认到本发明中制备的gpc3-car-t细胞(gpc3-嵌合抗原受体t细胞)通过有效识别gpc3抗原来诱导car-t细胞的激活，有效杀灭表达gpc3的细胞，因此本发明的对gpc3具有特异性的抗体、利用其制备的嵌合抗原受体及car-t细胞可以应用于表达gpc3的癌症或肿瘤的预防或治疗中。