用水力旋流器细胞保留装置生产生物分子的系统和方法与流程

本文公开了用于生产感兴趣的生物分子的系统和方法，这些系统和方法包括至少一个用作细胞保留装置的水力旋流器。在某些实施方案中，所述系统和方法提供用于产生蛋白质(例如抗体)的两级、连接的灌注生物反应器系统。

背景技术：

1、在过去的十年里，生物药物在治疗人类疾病方面的重要性越来越大。然而，生物制剂的生产过程与传统小分子药物的生产过程有很大不同，即生物制剂通常由工程细胞或微生物生产，而不是通过化学反应合成。因此，生物制剂的生产通常比小分子的生产更复杂、更昂贵。

2、连续生物过程提供了一种提高生物制剂生产的品质和降低成本的方法。生物过程可以是端对端连续的，或者对于某些过程(例如细胞培养)是连续的。与上游运行相关的连续生物过程通常指灌注技术。灌注细胞培养过程包括恒定或半恒定地供给新鲜培养基以及在保留大量的活细胞的同时恒定或半恒定地去除废培养基和产物。

3、在保持细胞培养的同时去除废培养基可以以多种方式进行，包括基于过滤、沉积或离心的技术。本领域已知的细胞保留装置包括旋转过滤器、倾斜沉降器、连续离心、膜过滤装置或超声波分离器。然而，众所周知，每一种方法都有一定的局限性和/或复杂性。

4、例如，几乎任何使用膜的细胞保留装置(就像目前大规模使用的许多装置一样)最终都会被细胞碎片堵塞。通常与高产灌注过程相关的高细胞密度和低活性进一步加速了膜污染。此外，当膜被细胞碎片堵塞时，它们也开始有效地起到超滤装置的作用，以不容易预测或再现的方式将高分子量产物蛋白质保留在生物反应器内。这是一个缺点，因为在连续灌注生物反应器系统中，使感兴趣的产物在无细胞收获中连续地从生物反应器中去除并以一致的方式输送到下游运行是有利的。本领域已知的细胞保留装置的其他问题包括过热、分离效率低和在装置中停留时间长。

5、因此，常规的连续灌注细胞培养系统通常的工作体积低于2,000l，并且如果在生产率最高的条件(例如，高活细胞密度和高灌注速率)下运行，则由于堵塞和产物保留，需要频繁更换基于膜的细胞保留装置。此外，能够处理非常大体积的无细胞培养物收获的细胞保留装置可能非常复杂(例如许多移动组件)、昂贵、通过过度的剪切力对细胞造成损害，并且容易发生故障。由于细胞保留装置通常位于生物反应器的外部，因此在大规模情况下，有效的清洁和消毒也可能具有挑战性。此外，无论规模如何，分批和补料分批仍然是哺乳动物细胞培养中最常见的类型。

6、众所周知，灌注n-1(种子)生物反应器(其使用与约5倍至约20倍大的连续流动搅拌釜式反应器(cstr或恒化器)连接的基于膜的细胞保留装置)可以提高生产率(参见，例如，boehringer ingelheim international gmbh的美国专利公开第2019/0031997号)。

7、仍然需要克服与当前常规灌注培养系统(特别是用于大规模生物处理的)相关的限制的替代细胞培养方法或系统。

技术实现思路

1、本文公开了生物过程系统和方法，更具体地，用于生产感兴趣的生物分子(例如，抗体)的系统和方法，其包括用作细胞保留装置的至少一个水力旋流器。

2、在第一方面中，本文公开了用于连续生产至少一种感兴趣的生物分子的系统，所述系统包括：(i)至少一个培养生物反应器(例如，n-1生物反应器或n-1灌注生物反应器)；(ii)至少一个水力旋流器；和(iii)至少一个生产生物反应器(例如，n生物反应器或连续搅拌釜式反应器(continuously stirred tank reactor，cstr)生产生物反应器)；其中培养生物反应器和生产生物反应器通过水力旋流器连接，水力旋流器用作培养生物反应器的细胞保留装置，其中水力旋流器产生包含浓缩的细胞培养物的下溢流和部分无细胞的上溢流，并且其中将包含浓缩的细胞培养物的下溢流返回到培养生物反应器，以及将部分无细胞的上溢流引导到生产生物反应器。

3、在一个实施方案中，系统可以在高产稳态下运行超过六周、超过八周、超过三个月、超过六个月或超过一年。“高产”稳态被认为是至少约0.80g/l/天或约0.84g/l/天的计算的稳态体积生产率。

4、在一个特定实施方案中，通过用较低世代数的细胞重新启动培养生物反应器，系统可以无限期地在高产稳态下运行。

5、在第二方面中，本文公开了用于连续生产至少一种感兴趣的生物分子的系统，该系统包括：(i)至少一个连续(例如，灌注)培养生物反应器(例如，n-1生物反应器或n-1灌注生物反应器)；(ii)至少一个水力旋流器；(iii)至少一个生产生物反应器(例如，n生物反应器或连续搅拌釜式反应器(cstr)生产生物反应器)；和(iv)至少一个下游组件(例如，捕获组件或纯化组件)；其中培养生物反应器和生产生物反应器通过水力旋流器连接，所述水力旋流器用作培养生物反应器的细胞保留装置，其中水力旋流器产生包含浓缩的细胞培养物的下溢流和部分无细胞的上溢流，并且其中将包含浓缩的细胞培养物的下溢流返回到培养生物反应器，以及将部分无细胞的上溢流引导到生产生物反应器。

6、在第三方面中，本文公开了用于连续生产感兴趣的生物分子(例如，抗体)的方法，包括(i)在至少一个培养生物反应器(例如，n-1生物反应器或n-1灌注生物反应器)中培养能够产生感兴趣的生物学分子(例如抗体)的多个宿主细胞；(ii)用从步骤(i)获得的细胞接种一个或更多个生产生物反应器(例如，n生物反应器或连续搅拌釜式反应器(cstr)生产生物反应器)；以及(iii)在允许生产所述感兴趣的生物分子(例如，抗体)的条件下，在至少一个生产生物反应器中培养细胞，其中培养生物反应器和生产生物反应器通过水力旋流器连接，所述水力旋流器用作培养生物反应器的细胞保留装置，培养生物反应器接收来自水力旋流器的下溢，而生产生物反应器接收上溢，从而对生产生物反应器接种。

7、在一个实施方案中，所述方法还包括(v)从生产生物反应器收获一部分培养的宿主细胞。在某些实施方案中，从生产生物反应器收获一部分培养的宿主细胞的步骤连续进行。在某些实施方案中，从生产生物反应器收获一部分培养的宿主细胞的步骤周期性地发生，例如每天一次、每天两次、每天三次或每两天一次。任选地，可以进行一个或更多个额外步骤来进一步处理感兴趣的生物分子。在一个实施方案中，一个或更多个步骤选自澄清、捕获步骤、纯化步骤、抛光步骤、配制步骤、包装步骤或其组合。这些一个或更多个额外步骤在本质上可以是连续的或非连续的，从而提供混合的或连续的端对端过程。

8、与使用含膜宿主细胞保留装置而不是水力旋流器来提供培养生物反应器和生产生物反应器之间的连接的系统和/或方法相比，本文公开的系统和/或方法提供了一个或更多个改进的特性，特别是当应用于大规模系统时。例如，在生产生物反应器的工作体积超过1000l的系统中，利用水力旋流器来提供培养生物反应器和生产生物反应器之间的连接的本文所述的系统和/或方法可以提供某些改进，包括提高总分离效率、减少培养基使用和/或增加的至少一种感兴趣的生物分子的生产。在某些实施方案中，在高活细胞密度(vcd)和或高灌注率(pf)下存在改进的特性。在系统规模非常大的某些实施方案中，利用含膜宿主细胞保留装置而不是水力旋流器来提供培养生物反应器和生产生物反应器之间的连接的系统可能受到膜面积不足的阻碍，与水力旋流器连接的生物反应器系统相比，这将导致较低的总生产率。

9、根据以下附图和详细描述，本领域技术人员将很容易理解本主题技术的另外的优点。附图和说明应被视为本质上是说明性的，而不是限制性的。

10、附图详述

11、图1是示例性水力旋流器中的流体动力学图。培养物通过装置顶部的两个切向入口进入水力旋流器旋流室。离心场产生初级涡流，该初级涡流将细胞推向旋流室的壁，而锥形接续器(conical taper)向下引导细胞，直到它们在装置底部的下溢流中离开。同时，部分无细胞的物质反转方向，进入次级涡流，该次级涡流向上行进，并通过装置顶部的上溢流离开。

12、图2是示出示例性生物反应器配置的示意图。在该配置中，使用水力旋流器作为细胞保留装置的n-1灌注生物反应器将部分无细胞的上溢流连续供应到作为n级生产生物反应器运行的第二连续流搅拌釜式反应器(cstr)。将n-1灌注生物反应器保持在恒定体积下，并用灌注培养基供给。600系列watson marlow蠕动泵以3l/分钟将n-1培养物供应到水力旋流器中，以达到2.4巴的运行压力。将包含浓缩的细胞培养物的下溢流再循环回n-1生物反应器，同时用第二蠕动泵(500系列watson marlow)以370ml/分钟的流量将部分无细胞的上溢流添加到生产cstr中。浓缩的营养饲料也被直接添加到生产cstr中。生产cstr不使用细胞保留装置，并且从生物反应器中取出全细胞收获物以将生产cstr维持在恒定体积。

13、图3是用作示例性n-1灌注生物反应器的细胞保留装置的示例性水力旋流器的图。图上所示的尺寸在本文进行说明。

14、图4a是示出了对于使用水力旋流器作为细胞保留装置的示例性n-1灌注生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度(vcd)和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心菱形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心菱形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

15、图4b是示出了对于在使用水力旋流器的连接的生物反应器实验中模拟1:5体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心正方形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心正方形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

16、图4c是示出了对于在使用水力旋流器的连接的生物反应器实验中模拟1:10体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心三角形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心三角形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

17、图4d是示出了对于在使用水力旋流器的连接的生物反应器实验中模拟1:20体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心圆形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心圆形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

18、图5a是示出实施例1中使用的n-1灌注生物反应器中残留葡萄糖(实心菱形)和乳酸盐(空心菱形)浓度的曲线图。

19、图5b是示出在使用水力旋流器的连接的生物反应器系统中模拟1:5体积比的示例性生产cstr生物反应器中残留葡萄糖(实心正方形)和乳酸盐(空心正方形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(high-end ph delivery of glucose，hipdog)控制暂停的时间点。

20、图5c是示出在使用水力旋流器的连接的生物反应器系统中模拟1:10体积比的示例性生产cstr生物反应器中残留葡萄糖(实心三角形)和乳酸盐(空心三角形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(hipdog)控制暂停的时间点。

21、图5d是示出在使用水力旋流器的连接的生物反应器系统中模拟1:20体积比的示例性生产cstr生物反应器中残留葡萄糖(实心圆形)和乳酸盐(空心圆形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(hipdog)控制暂停的时间点。

22、图6是示出由在n-1灌注生物反应器中用作细胞保留装置的示例性水力旋流器实现的总分离效率(实心菱形)和降低的分离效率(空心菱形)的图。在本文的实验部分中描述了计算。

23、图7是示出n-1灌注生物反应器中的灌注速率(实心菱形)和示例性水力旋流器上溢流的计算的有效细胞放流物(空心菱形)的曲线图。灌注速率以每天的反应器体积(rv/天)为单位列出，并且它通过将每天添加到n-1生物反应器的灌注培养基的体积除以n-1生物器的工作体积来计算。计算的细胞放流物也以rv/天为单位列出，并且它通过将灌注速率乘以上溢流活细胞密度与生物反应器活细胞密度的比率来计算。垂直虚线表示稳态的边界。

24、图8是示出1:5生产cstr(实心正方形)、1:10生产cstr(实心三角形)和1:20生产cstr(实心圆形)的稀释速率的曲线图。稀释速率以rv/天为单位列出，并且它通过将每天从生物反应器中取出的全细胞收获物的体积除以生物反应器的工作体积来计算。垂直虚线表示稳态的边界。

25、图9是示出在使用水力旋流器的示例性连接的生物反应器系统中，在稳态条件下，每体积产生的抗体产物的总质量相对于时间绘制的曲线图。作为独立单元运行的n-1灌注显示为实心菱形，1:5生产cstr显示为空心正方形，1:10生产cstr显示为空心三角形，1:20生产cstr显示为空心圆形。在本技术的实验部分中描述了物质平衡计算的细节。当生物反应器在灌注速率或稀释速率、活细胞密度和代谢物方面处于接近稳态条件时，对相对于时间绘制的以克/升(g/l)为单位的总生产的产物进行线性回归。所得线的斜率是稳态体积生产率，单位为克/升/天(g/l/天)。这两个稳态用虚线圈出。

26、图10是生物反应器中抗体产物浓度或滴度的曲线图。n-1灌注显示为实心菱形，1:5生产cstr显示为空心正方形，1:10生产cstr显示为空心三角形，1:20生产cstr显示为空心圆形。

27、图11为示出示例性级联cstr生物反应器配置的图。在这种配置中，n-1生物反应器作为cstr以恒定体积运行。将灌注培养基添加到n-1cstr中，作为全细胞放流物从生物反应器中半连续地取除，并供给到比n-1cstr大2.5至10倍的n级生产cstr。该生产cstr也直接用浓缩的进料供给，同时从生物反应器中连续取出全细胞收获物以将生产cstr保持恒定体积。n-1cstr和生产cstr都没有在这种配置中使用细胞保留装置。

28、图12a是示出了对于示例性n-1cstr，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度(vcd)和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心菱形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心菱形，并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

29、图12b是示出了对于在级联cstr实验中模拟1:2.5体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心正方形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心正方形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界以及生产cstr与n-1cstr断开连接并作为独立生产cstr运行的时间点。

30、图12c是示出了对于在级联cstr实验中模拟1:5体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心三角形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心三角形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界以及生产cstr与n-1cstr断开连接并作为独立生产cstr运行的时间点。

31、图12d是示出了对于在级联cstr实验中模拟1:10体积比的示例性生产cstr生物反应器，通过台盼蓝排除法测量的活细胞密度和细胞活力百分比的曲线图。活细胞密度显示为实心圆形并对应于左侧y轴。细胞活力百分比显示为空心圆形并对应于右侧y轴。垂直虚线表示稳态的边界。

32、图13示出了在实施例1的级联cstr实验中，每天反应器体积的稀释速率(rv/天)。该曲线图示出了n-1cstr(实心菱形)、1:2.5生产cstr(空心正方形)、1:5生产cstr(空心三角形)和1:10生产cstr(空心圆形)。稀释速率计算为每天从cstr中取出的全细胞收获物的体积除以生物反应器的工作体积。垂直虚线表示稳态的边界。

33、图14a是示出实施例1的级联cstr实验中n-1cstr中残留葡萄糖(实心菱形)和乳酸盐(空心菱形)浓度的曲线图。

34、图14b是示出在级联cstr过程中模拟1:2.5体积比的示例性生产cstr中残留葡萄糖(实心正方形)和乳酸盐(空心正方形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(high-end ph delivery of glucose，hipdog)控制暂停的时间点。

35、图14c是示出在级联cstr过程中模拟1:5体积比的示例性生产cstr中残留葡萄糖(实心三角形)和乳酸盐(空心三角形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(hipdog)控制暂停的时间点。

36、图14d是示出在级联cstr过程中模拟1:10体积比的示例性生产cstr中残留葡萄糖(实心圆形)和乳酸盐(空心圆形)浓度的曲线图。垂直虚线表示葡萄糖的高端ph输送(hipdog)控制暂停的时间点。

37、图15是示出在实施例1的级联cstr实验中，在稳态条件下，每体积产生的抗体产物的总质量相对于时间绘制的曲线图。作为独立单元运行的n-1cstr显示为实心菱形，1:2.5生产cstr显示为空心正方形，1:5生产cstr显示为空心三角形，1:10生产cstr显示为空心圆形。在本技术的实验部分中描述了这种物质平衡的细节。当生物反应器在稀释速率、活细胞密度和代谢物方面处于接近稳态条件时，对相对于时间绘制的以克/升(g/l)为单位的总生产的产物进行线性回归。所得线的斜率是稳态体积生产率，单位为克/升/天(g/l/天)。

38、图16是示出对于实施例1的级联cstr实验，生物反应器中抗体产物浓度或滴度的曲线图。n-1cstr显示为实心菱形，1:2.5cstr显示为空心正方形，1:5cstr显示为空心三角形，1:10cstr显示为空心圆形。