新型昆虫抑制性蛋白质的制作方法

本发明整体涉及昆虫抑制性蛋白质领域。公开了一类新型蛋白质，所述蛋白质表现出针对作物植株和种子的农业相关害虫，尤其是鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制性活性。提供了植物、植物部分和种子，包括植物和微生物细胞，以及含有编码所公开的毒素蛋白中的一种或多种的重组多核苷酸构建体的载体。

背景技术：

1、提高具有重要农业意义的植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等等)的作物产量变得越来越重要。除了越来越需要农产品来为不断增长的人口提供食物、衣服以及提供能量之外，气候相关的影响以及不断增长的人口对将土地用于农业实践以外的用途带来的压力预计会减少可用于耕作的可耕地的数量。这些因素产生了对粮食安全的严峻预测，尤其是在植物生物技术和农艺实践无重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续性改进是在有限的可用于耕作的可耕地上扩大作物生产的重要工具。

2、昆虫，尤其是鳞翅目昆虫，被认为是损害大田作物，从而降低受侵染区域的作物产量的主要原因。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于：豆芽蛾(豆茎蛾)、黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎)、玉米穗虫(玉米耳虫)、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、小菜蛾(小菜蛾)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)(包括cry1ab、cry1ac和cry1fa耐受性草地贪夜蛾)、旧大陆棉铃虫(owb，棉铃虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、斑点棉铃虫(棉斑实蛾)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾(rachiplusia nu))、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、烟草地老虎(斜纹夜蛾，也称为集群毛虫)、西部豆地老虎(西部豆角夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。

3、从历史上看，合成化学杀昆虫剂的密集应用依赖于在农业中作为害虫防治剂。对此类杀昆虫剂的无差别毒性作用的担忧、对环境和人类健康的担忧以及新出现的耐受性问题，都刺激了生物杀害虫剂的研究和开发。这项研究工作的结果是各种昆虫病原性微生物物种(包括细菌)的逐步发现和使用。

4、当昆虫病原性细菌，尤其是属于芽孢杆菌属(bacillus)的细菌的潜力被发现并且开发为生物害虫防治剂时，生物防治模式发生了变化。自从分子生物学诞生以来，苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)细菌菌株就被用作杀害虫性蛋白质的来源，并且发现某些bt菌株针对特定昆虫表现出高水平的毒性。已知bt菌株产生δ-内毒素，所述δ-内毒素在孢子形成开始时和稳定生长期期间定位于伴孢结晶包涵体(例如，cry蛋白)中，并且还已知bt菌株产生分泌型杀昆虫性蛋白质。在被易感昆虫摄取时，δ-内毒素以及分泌型毒素可以在中肠上皮细胞表面发挥作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫性蛋白质的基因也在除bt之外的细菌菌种中得以鉴定，这些细菌菌种包括其他芽孢杆菌和多种另外的细菌菌种，诸如假单胞菌属(pseudomonas)、沙雷氏菌属(serratia)、致病杆菌属(xenorhabdus)和光杆状菌属(photorhabdus)物种，以及其他芽孢杆菌，包括但不限于侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillussphaericus)(―ls”，此前称为球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus))、日本甲虫类芽孢杆菌(paenibacillus popilliae)和缓病类芽孢杆菌(paenibacillus lentimorbus)。此外，杀昆虫性毒素还从多种非细菌来源(包括蕨类植物和其他植物相关物种以及蛛形纲动物毒液)得以鉴定，并且在一些害虫物种的饮食中输送dsrna已经被鉴定为有效的害虫管理策略。

5、用于本发明的目的的优选的结晶和分泌型可溶性杀昆虫毒素对目标害虫物种具有高度特异性，并且作为化学杀昆虫剂的替代品已经获得全世界的认可。例如，杀昆虫性毒素蛋白已经被用于各种农业应用，以保护具有重要农业意义的植物免受昆虫侵扰、减少对化学杀害虫剂施用的需要并且提高产量。杀昆虫性毒素蛋白可用于通过机械方法来防治作物植物的农业相关害虫，所述机械方法诸如喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面，或者通过使用遗传转化技术来产生表达杀昆虫性毒素蛋白的转基因植株和种子。

6、表达杀昆虫性毒素蛋白的转基因植物的使用已经在全球范围内得到认可。例如，在2016年，种植了2310万公顷表达bt毒素的转基因作物，并且种植了7540万公顷表达复合有除草剂耐受性状的bt毒素的转基因作物(isaaa.2016.global status ofcommercialized biotech/gm crops:2016.isaaa brief no.52.isaaa:ithaca,ny)。转基因防昆虫作物的全球使用以及可在这些作物中使用的杀昆虫性毒素蛋白的有限数量，已经对现有的昆虫等位基因产生了选择压力，所述等位基因赋予目前使用的杀昆虫性蛋白质以耐受性。

7、目标害虫对杀昆虫性毒素蛋白的耐受性发展产生了对新型杀昆虫性毒素蛋白的发现和开发的持续需求，所述新型杀昆虫性毒素蛋白可用于管理害虫种群，包括具有耐受性等位基因的那些。具有管理功效并且表现出对更广谱的易感昆虫物种的防治的新型蛋白毒素将减少可以产生耐受性等位基因的存活昆虫的数量。此外，对同一种昆虫害虫具有毒性并且显示出不同的作用模式或者两种或更多种不同的毒性作用模式(例如，编码靶向用于抑制的必需基因的dsrna的转基因与编码肽或蛋白毒素的转基因相结合，这两种转基因均对同一昆虫物种具有毒性)的两种或更多种转基因杀昆虫性毒素蛋白在一种植物中的使用，降低了在任何单一目标昆虫物种中产生耐受性的概率。另外，自限性技术(诸如oxitecltd提供的那些)的使用，当与本发明的蛋白质一起使用时，可以改善赋予表达本发明的蛋白质的转基因作物的性状的持久性(zhou等人2018.combining the high-dose/refugestrategy and self-limiting transgenic insects in resistance management—atestin experimental mesocosms.evol appl 11(5):727–738；alphey等人2009.combiningpest control and resistance management:synergy of engineered insects with btcrops.journal of economic entomology,102:717-732)。

8、因此，本发明人在本文中公开了一种来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白质和示例性重组蛋白质，它们各自表现出针对目标鳞翅目物种的杀昆虫活性，尤其是针对以下物种的杀昆虫活性：黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎)、玉米穗虫(玉米耳虫)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。

技术实现思路

1、本文公开了一种具有昆虫抑制性活性的新型杀害虫性蛋白质tic4029及其截短变体，所述蛋白质及其截短变体显示表现出针对作物植物的一种或多种害虫的抑制性活性。tic4029蛋白毒素类中的tic4029蛋白和变体蛋白可以单独使用或者与其他杀昆虫性蛋白质和毒剂组合用于制剂和植物体，从而为目前在农业系统中使用的杀昆虫性蛋白质和杀昆虫剂化学物质提供替代品。

2、在一个实施方案中，本技术公开了一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含异源性启动子，所述异源性启动子可操作地连接至编码杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段的多核苷酸区段，其中所述杀害虫性蛋白质包含seq id no:2、seq id no:4或seq id no:10的氨基酸序列；或者所述杀害虫性蛋白质包含与seq id no:2、seq id no:4或seq id no:10中所示的氨基酸序列具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％同一性的氨基酸序列；或者所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9中所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。所述重组核酸分子可以包含功能是在植物中表达所述杀害虫性蛋白质的序列，并且所述序列在植物细胞中表达时产生杀害虫有效量的杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段。

3、在本技术的另一个实施方案中，所述重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。所设想的细菌宿主细胞包括至少以下属：农杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)、芽孢杆菌属(bacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、泛菌属(pantoea)和欧文氏菌属(erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属(bacillus)是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属(brevibacillus)是侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，或者所述埃希氏菌属(escherichia)物种是大肠杆菌(escherichia coli)。所设想的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所设想的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(gossypiumsp.)、葫芦、黄瓜、道格拉斯冷杉、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦(squash)、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香树(sweet gum)、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。

4、在另一个实施方案中，所述杀害虫性蛋白质表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫包括至少豆芽蛾(豆茎蛾)、黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎(agrotisipsilon))、玉米穗虫(玉米耳虫)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。

5、本技术还设想了包含重组核酸分子的植物或植物部分，所述重组核酸分子编码所述tic4029毒素蛋白类的杀害虫性蛋白质或其片段。设想了双子叶植物和单子叶植物二者。在另一个实施方案中，所述植物还选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、道格拉斯冷杉、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香树、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。

6、在某些实施方案中，公开了包含所述重组核酸分子的种子。

7、在又一个实施方案中，设想了一种昆虫抑制性组合物，所述昆虫抑制性组合物包含本技术中公开的重组核酸分子。所述昆虫抑制性组合物可以另外包含编码不同于所述杀害虫性蛋白质的至少一种其他杀害虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述至少一种其他杀害虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制性蛋白质、昆虫抑制性dsrna分子和辅助蛋白。还设想了，所述昆虫抑制性组合物中的所述至少一种其他杀害虫剂表现出针对鳞翅目(lepidoptera)、鞘翅目(coleoptera)或半翅目(hemiptera)的一种或多种害虫物种的活性。所述昆虫抑制性组合物中的所述至少一种其他杀害虫剂在一个实施方案中选自由以下组成的组：cry1a、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b、cry1c、cry1c变体、cry1d、cry1e、cry1f、cry1a/f嵌合体、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry2a、cry2ab、cry2ae、cry3、cry3a变体、cry3b、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry34、cry35、cry43a、cry43b、cry51aa1、et29、et33、et34、et35、et66、et70、tic400、tic407、tic417、tic431、tic800、tic807、tic834、tic853、tic900、tic901、tic1201、tic1415、tic2160、tic3131、tic836、tic860、tic867、tic869、tic1100、vip3a、vip3b、vip3ab、axmi-axmi-、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100、axmi-115、axmi-113和axmi-005、axmi134、axmi-150、axmi-171、axmi-184、axmi-196、axmi-204、axmi-207、axmi-209、axmi-205、axmi-218、axmi-220、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z和axmi-225z、axmi-238、axmi-270、axmi-279、axmi-345、axmi-335、axmi-r1及其变体、ip3及其变体、dig-3、dig-5、dig-10、dig-657、dig-11蛋白、ipd102aa及其同源物、ipd110aa及其同源物、tic868、cry1da1_7、bcw003、tic1100、tic867、tic867_23、tic6757、tic7941、idp072aa、tic5290、tic3668、tic3669、tic3670、ipd103及其同源物、pip-50和pip-65以及它们的同源物、pip-83及其同源物以及cry1b.34。

8、还设想了商品性产品，所述商品性产品包含可检测量的本技术中公开的重组核酸分子和毒素蛋白。此类商品性产品包括通过谷物装卸运输机装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米粕、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮料、玉米淀粉、玉米谷物等等，以及对应的大豆、水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜以及蔬菜商品性产品，在适用的情况下包括汁、浓缩物、果酱、胶冻、柑橘酱(marmalade)以及含有可检测量的本技术的此类多核苷酸和/或多肽的此类商品性产品的其他可食用形式，全棉籽或加工棉籽、棉油、皮棉、针对饲料或食品加工的种子和植株部分、纤维、纸张、生物质以及燃料产品，诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的颗粒燃料，全大豆籽或加工大豆籽、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、大豆麸、大豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸张、包含大豆的乳膏、大豆生物质以及使用大豆植株和大豆植株部分产生的燃料产品。

9、本技术还设想了一种产生种子的方法，所述种子包含所述重组核酸分子和来自所述tic4029蛋白毒素类的蛋白毒素。所述方法包括种植至少一种包含本技术中公开的重组核酸分子的种子；从所述种子培植植株；以及从所述植株收获种子，其中所述收获的种子包含参考重组核酸分子。

10、在另一个示例性实施方案中，提供了一种对鳞翅目昆虫侵扰具有耐受性的植物，其中所述植物的细胞包含本文公开的重组核酸分子。

11、本技术还公开了用于防治鳞翅目物种害虫和防治植物，尤其是作物植物的鳞翅目物种害虫侵染的方法。所述方法包括，在一个实施方案中，首先使所述害虫与杀昆虫有效量的seq id no:2、seq id no:4或seq id no:10中所示的杀害虫性蛋白质接触；或者使所述害虫与杀昆虫有效量的一种或多种这样的杀害虫性蛋白质接触，所述杀害虫性蛋白质包含与seq id no:2、seq id no:4或seq id no:10中所示的氨基酸序列具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％同一性的氨基酸序列。

12、本文还提供了一种检测tic4029类的重组核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自一种植物的基因组dna杂交，所述基因组dna包含编码本文提供的杀害虫性蛋白质或其片段的多核苷酸区段，并且在此类杂交条件下不与来自另一种同基因植物的不包含所述区段的基因组dna杂交，其中所述探针与seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9，或者编码这样的杀害虫性蛋白质的序列同源或互补，所述杀害虫性蛋白质包含与seq idno:2、seq id no:4或seq id no:10具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及检测所述探针与所述样品的dna的杂交。在一些实施方案中，检测所述tic4029毒素蛋白类的成员的存在的步骤可以包括elisa或蛋白质印迹。

13、本文还提供了检测来自所述tic4029类的杀害虫性蛋白质或其片段的存在的方法，其中所述方法包括使样品与向tic4029类毒素蛋白的结合具有特异性免疫反应性抗体接触；以及检测所述抗体与所述tic4029类蛋白的结合，从而确认所述蛋白质在所述样品中的存在。在一些实施方案中，所述检测的步骤包括elisa或蛋白质印迹。

14、本技术还设想了一种用于在表达tic4029类毒素蛋白的转基因作物田地中防治鳞翅目害虫物种或害虫侵扰的方法，其中所述方法包括培植表达杀昆虫有效量的杀害虫性蛋白质的作物植物，所述杀害虫性蛋白质具有seq id no:8、seq id no:10、seq id no:4、seqid no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seqid no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32中所示的氨基酸序列；或者培植表达杀昆虫有效量的一种或多种杀害虫性蛋白质的作物植物，所述杀害虫性蛋白质包含与seq id no:7、seq id no:9、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31中所示的氨基酸序列具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或99.5％、或约100％同一性的氨基酸序列；以及任选地将各自携带自限性基因的一种或多种转基因鳞翅目害虫物种释放至含有编码本发明的毒素蛋白的基因的作物田地，以防止或延迟所述一种或多种鳞翅目害虫物种对所述毒素蛋白的耐受性的产生。在一个实施方案中，所述作物植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在另一个实施方案中，所述单子叶作物植物可以是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或小米。在又一个实施方案中，所述双子叶作物植物可以是大豆、棉花或芥花。这种包含自限性基因的鳞翅目物种的组合在转基因作物田地的适当附近处释放，将防止或延迟缺乏(或不具有)所述自限性基因的所述鳞翅目害虫物种对本发明的毒素蛋白的耐受性的产生。