组氨酸导致的反馈抑制得到减少的ATP-PRT变体及表达该变体的组氨酸生产菌株的制作方法

本发明涉及组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株。

背景技术：

1、atp-磷酸核糖基转移酶(atp-phosphoribsyltransferase，以下可以称为atp-prt)在细菌、真菌或植物中催化组氨酸的生物合成的第一步。

2、在存在一定浓度以上的l-组氨酸的环境下，atp-磷酸核糖基转移酶(atp-phosphoribsyltransferase)的活性因组氨酸而受到反馈抑制，因此难以将组氨酸生产量增加到一定水平以上。

3、因此，为了增加微生物的组氨酸生产量，需要组氨酸抗性得到增加的atp-prt变体。但是，没有已知的可以减少大肠杆菌的hisg基因中表达的atp-prt的组氨酸反馈抑制的变体。

4、现有技术文献

5、专利文献

6、(专利文献1)韩国公开公报第10-2017-0098205号(2017.08.02)

技术实现思路

1、根据一具体例，提供一种组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-磷酸核糖基转移酶变体。

2、在一个方式中，提供一种atp-磷酸核糖基转移酶变体，是由seq id no:1的氨基酸序列组成的，其中，位于第250号的精氨酸被置换为组氨酸。

3、上述seq id no:1的氨基酸序列是由大肠杆菌的野生型hisg表达的atp-磷酸核糖基转移酶的序列。atp-磷酸核糖基转移酶可以称为atp-prt。atp-prt催化组氨酸生物合成的第一步即1-(5-磷酸-d-核糖基)(1-(5-phospho-d-ribosyl))-atp+二磷酸(diphosphate)atp+5-磷酸-阿尔法-d-核糖1-二磷酸(5-phospho-alpha-d-ribose 1-diphosphate)的反应。在本申请中，上述atp-磷酸核糖基转移酶可以与“hisg”混用。

4、根据一具体例，上述atp-磷酸核糖基转移酶可以是由大肠杆菌(e.coli)的hisg基因表达的。

5、根据一具体例，上述变体可以减少组氨酸导致的反馈抑制。根据一实施例，导入了包含r250h突变的atp-prt的菌株与野生型相比，组氨酸生产量增加。

6、根据一具体例，上述变体还可以包含以下置换中的一种以上：(a)位于第232号的组氨酸(histidine，h)被置换为赖氨酸(lysine，k)或苏氨酸(threonine，t)；(b)位于第252号的苏氨酸被置换为丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；(c)位于第271号的谷氨酸被置换为赖氨酸；(d)位于第288号的丝氨酸被置换为脯氨酸。根据一实施例，确认了除了第250号精氨酸突变以外还包含上述(a)至(d)的突变时，组氨酸生产量增加。

7、上述变体即使在组氨酸浓度5mm至25mm下也可以具有活性。

8、在另一方式中，提供编码上述atp-磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸或包含其的载体。上述载体可以为质粒或噬菌体(phage)。

9、在另一方式中，提供表达上述atp-磷酸核糖基转移酶变体的转化菌株。上述转化菌株可以为导入了编码atp-磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸或包含其的载体的菌株。上述菌株即使组氨酸的浓度增加也维持atp-磷酸核糖基转移酶的活性，因此可以增加组氨酸生产量。

10、表达上述atp-磷酸核糖基转移酶变体的菌株可以使组氨酸的生产增加约22至92％。

11、上述转化可以通过公知的方法实施，例如，可以通过电穿孔方法(van der restet al.,appl.microbiol.biotechnol.,52,541-545,1999)等实施。

12、根据一具体例，上述菌株可以为埃希氏菌(escherichia)属菌株，具体而言，可以为大肠埃希氏菌(escherichia coli)、艾伯特埃希氏菌(escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(escherichia blattae)、弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(escherichia hermannii)或伤口埃希氏菌(escherichia vulneris)菌株。

13、在另一方式中，提供包括培养上述转化菌株的步骤的组氨酸的生产方法。上述组氨酸的生产方法可以包括以下步骤：在培养基中培养上述转化菌株的步骤；从上述菌株或培养基中回收组氨酸的步骤。

14、上述培养基可以包含碳源、氮源和无机盐类。上述碳源例如可以包括葡萄糖、蔗糖、枸橼酸盐、果糖、乳糖、麦芽糖或糖蜜之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸，但并不特别限定，可以单独使用或以混合物的形式使用。优选地，在上述大肠杆菌突变株的培养基中可以包含葡萄糖。上述氮源例如可以使用蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、干燥的酵母、玉米浆、豆粕、尿素、硫脲、铵盐、硝酸盐及其它包含有机或无机氮的化合物，但并不特别限定。此外，上述无机盐类可以使用镁、锰、钾、钙、铁、锌、钴等，并且不限定于此。

15、另外，为了调节培养基的ph，可以通过适当的方式使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨之类的基础化合物或者磷酸或硫酸之类的酸化合物。此外，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生，为了维持有氧状态，可以向培养基内注入氧气或者含有氧气的气体(例如空气)。

16、上述培养是指使微生物在人工调节的环境下生长，可以通过本领域中众所周知的培养方法实施。培养时温度可以为20至45℃，可以培养10至200小时，但并不限定于此。

17、上述回收组氨酸的步骤可以使用本领域中众所周知的各种方法。例如，可以使用离心分离、过滤、阴离子交换色谱、结晶化或hplc，但并不限定于此。

18、根据一具体例的atp-磷酸核糖基转移酶变体即使在高浓度的组氨酸环境下也可以维持活性。

19、根据一具体例的表达atp-磷酸核糖基转移酶变体的菌株可以增加组氨酸生产量。

1.一种atp-磷酸核糖基转移酶变体，是由seq id no:1的氨基酸序列组成的，

2.根据权利要求1所述的变体，其中，所述atp-磷酸核糖基转移酶是由大肠杆菌即e.coli的hisg基因表达的。

3.根据权利要求1所述的变体，其中，所述变体的组氨酸导致的反馈抑制得到减少。

4.根据权利要求1所述的变体，其中，还包含下述氨基酸置换中的一种以上：

5.一种转化菌株，其表达权利要求1所述的atp-磷酸核糖基转移酶变体。

6.根据权利要求5所述的转化菌株，其中，所述菌株为大肠杆菌。

7.一种组氨酸的生产方法，包括培养权利要求5所述的菌株的步骤。