检测牛呼吸系统疾病综合征相关病原体的测定工具、试剂盒和方法与流程

背景技术：

1、牛呼吸系统疾病综合征(brd)是牛呼吸系统疾病的总称，是造成经济损失的主要原因。事实上，brd是影响北美肉牛、肉用小牛、断奶小奶牛和肉犊牛的最常见和成本最高的疾病，其发病率约为15％。

2、brd是由呼吸道感染引起的一系列呼吸系统疾病的总称。患有brd的牛很可能出现肺炎，其生理症状包括体温升高、流鼻涕、精神萎靡和食欲下降。虽然brd是可以治疗的，但不加管理的brd病例会导致诊断/治疗费用高昂、高发病率，以及整体肉质下降的后果。许多致病原与brd相关，包括病毒(例如牛呼吸道合胞病毒或副流感病毒)和细菌(最常见的包括多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌和牛支原体(mycoplasma bovis))合并感染。据报道，由于生产损失、劳动开支增加、医药费用和死亡，北美饲养产业的经济损失每年高达9亿美元。

3、由于与brd相关的临床症状可能是非特异性的、不易察觉的，并表现出快速发病的特点，快速准确地诊断brd对北美养牛业来说是一个重大挑战。药物治疗(例如抗生素处方)因受牵涉到的病原体而异，因此，在尽可能早的阶段进行诊断很重要。然而，通常情况下，患有brd的牛在疾病过程中很晚才被发现，或者根本就未被发现。

4、检测和/或诊断brd致病原因的常规方法包括观察牛的生理症状，例如食欲不振、体温升高和精神萎靡，以及对所收集的生物材料进行实验室测定(例如血清学测定、细胞培养测定、免疫组织化学测定和原位杂交测定)。目前这些检测方法存在的缺点，使有效诊断和治疗brd变得困难。

5、物理指示剂不能确定致病的病原体，因此，不足以指导适当的治疗。此外，评估牛的生理症状以确定brd疾病状态，往往会出现不一致的结果。

6、为了解决这些问题，已经开发了越来越多的诊断性检测，以检测brd病原体。虽然一些检测测定已经有近三十年的发展和标准化，但它们仍然存在着明显的缺点。传统的诊断不能现场进行，因此，需要花费额外的时间和金钱将所述样品从农场运到实验室进行处理。这样，基于实验室的检测需要很长的处理时间，特别是当提交了大量牲畜样品以进行检测时。这种检测延迟或检测和诊断之间的瓶颈，会使得饲养场经营者或兽医等待时间过长并造成宝贵牲畜的损失。

7、此外，传统的诊断检测需要通过培养、特殊的技术技能和专业设备进行分离。培养以对临床材料中的brd病原体进行检测往往耗时，而且传统方法的灵敏度较低。传统的培养方法耗时，需要几天才能获得细菌分离株，而且一些物种，如牛支原体和睡眠嗜组织菌生长不良——这一特点可能导致这些病原体在brd中的作用表现不足。

8、聚合酶链式反应(pcr)测定工具提供了一种替代方法，通过扩增致病菌株特有的靶向dna序列来检测样品中存在brd。然而，由于与之前所述大部分相同的原因，这些pcr测定工具仅限于实验室环境，在现场无法使用。

9、解决设备限制的可能方案是重组酶聚合酶扩增(rpa)，以检测深鼻咽拭子中brd病原体的存在。这种技术可以在37-42℃的温度下用重组酶和dna结合蛋白结合并扩增靶向dna序列，但迄今为止还没有在现场环境中得到验证。

10、环介导等温扩增(lamp)可以以类似于rpa的方式使用，并有可能检测多种生物源的致病原。与pcr类似，lamp可以检测感染性病原体中发现的dna部分。lamp克服了其他诊断方法的限制，具有以下四个优点：i)在～65℃的单一温度培育下扩增dna，ii)由于使用四到六个dna引物(可使用免费提供的primerexplorer软件设计)而具有测定工具特异性，iii)达到与传统pcr相似的检测限，以及iv)与复杂的热循环仪相比，测定工具操作仅需要简单的加热元件。

11、虽然lamp确实显示出作为有效现场诊断工具的前景，但将lamp作为病原体筛查的主流测定工具的主要限制是出现假阳性——由于试剂处理不当或以前实验遗留的污染。此外，lamp的准确度在很大程度上取决于所使用的引物，而在本公开之前，最佳的引物组尚未确定。事实上，设计lamp引物已被证明具有挑战性。

12、仍然需要提供具有成本效益、快速和准确的诊断测定工具来检测brd。虽然一些传统的测定工具可能显示出作为诊断brd工具的前景，但需要能够进行现场检测的便携式分子诊断测定工具来检测牛样品中brd主要细菌性病原体的存在。

技术实现思路

1、本公开提供了环介导等温扩增(lamp)测定工具。在至少一个实施方案中，这种测定工具可以包含至少一个lamp引物组，其靶向样品(例如，牛鼻腔样品或从牛喝水的水槽中提取的牛水样品)中与牛呼吸系统疾病(brd)相关病原体的脱氧核糖核酸(dna)片段，其中所述测定工具能够对所述病原体进行一步鉴定。所述与brd相关病原体可以是，例如，细菌(例如，细菌或细菌性支原体)、真菌、病毒或任何其他与brd相关的致病原。在某些实施方案中，所述与brd相关病原体选自由以下组成的组：多杀性巴氏杆菌(p.multocida)、溶血性曼氏杆菌(m.haemolytica)和睡眠嗜组织菌(h.somni)。在某些实施方案中，所述至少一个lamp引物组是表2和表3中引物组a-aaaa中一个或更多个。

2、在某些实施方案中，所述病原体是多杀性巴氏杆菌，所述靶向dna片段包含选自由以下组成的组的基团：kmt1、ompp1和omp16。在某些实施方案中，所述病原体是溶血性曼氏杆菌，所述靶向dna片段包含选自由以下组成的组的基因：rsml、rsmc和lkta。在某些实施方案下，所述病原体是睡眠嗜组织菌，所述靶向dna片段包含选自由以下组成的组的基因：lola、lolb和lppb。每种测定工具还可以包括针对上述基因任何组合的各种引物组。在某些实施方案中，每个lamp引物组对所述靶向dna片段具有至少约98％的特异性。

3、在示例性实施方案中，所述至少一个lamp引物组包含靶向多杀性巴氏杆菌kmt1片段的引物组，所述至少一个lamp引物组包含靶向睡眠嗜组织菌lolb片段的引物组，和/或所述至少一个lamp引物组包含靶向溶血性曼氏杆菌rsml片段的引物组。

4、所述测定工具的实施方案可在60分钟或更短时间内处理并提供视觉结果。例如，所述视觉结果可以指示所述样品(例如，检测的样品)中是否存在brd的病原体。在某些实施方案中，所述lamp引物组每一个的检测限(lod)为至少103拷贝数/反应。

5、所述视觉结果可以，例如，鉴定所述样品中存在的病原体类型。在某些实施方案中，所述视觉结果是颜色编码结果或比色结果。

6、所述靶向dna片段可以包含与抗生素抗性相关的基因。

7、在某些实施方案中，所述测定工具包含一种或更多种指示剂。例如，此类指示剂可以包含对ph或镁灵敏的指示剂。在一些实施方案中，所述指示剂包含基于镁的指示剂。在一些实施方案中，所述指示剂是荧光指示剂。

8、在某些实施方案中，每个lamp引物组与比色试剂偶联。例如，所述比色试剂可以是对ph灵敏或对镁灵敏的比色试剂。在某些实施方案中，所述比色试剂是酚红。

9、在至少一个实施方案中，每个lamp引物组包含seq id no:1-6、25-30、55-62、99-110和147-158的一个或更多个引物，或由此实现的引物组。

10、在某些实施方案中，每个lamp引物组包含4至6个引物。

11、还提供了用于鉴定样品中与brd相关病原体的方法，以及在某些实施方案中，其治疗方法。在至少一个实施方案中，所述方法包含：提供至少一个lamp引物组，其靶向样品中与牛呼吸系统疾病(brd)相关的靶向病原体的脱氧核糖核酸(dna)片段；从受试者获得样品；将所述样品和所述至少一个lamp引物组组合成混合物；加热组合以启动所述靶向dna片段的扩增；以及检测所述经加热组合中指示所述样品中是否存在brd靶向病原体的视觉结果。此时，所述至少一个lamp引物组可以是例如，表2和表3中引物组a-aaaa中的一个或更多个。

12、在一些情况下，所述方法可以在启动加热步骤的60分钟或更短的时间内提供视觉结果，并且所述样品是牛鼻腔样品(或牛水样品)。

13、检测视觉结果的步骤还可以包含使用浊度仪测量所述经加热组合的相对净度；以及使用荧光读取器、紫外线读取器或照相机中的一种或更多种分析所述视觉结果中的比色数据。所述视觉结果可以指示所述靶向病原体是否存在。在某些实施方案中，如果所述视觉结果指示存在靶向病原体，则所述方法还包含针对所述靶向病原体治疗所述受试者(或群组(例如，畜群))。

14、在所述方法的某些实施方案中，所述至少一个lamp引物组与对ph灵敏或对镁灵敏的比色试剂偶联。例如，所述比色试剂可以是酚红。

15、在所述方法的某些实施方案中，所述至少一个lamp引物组靶向多杀性巴氏杆菌kmt1片段或睡眠嗜组织菌lolb片段。此外，所述至少一个lamp引物组可以包含靶向多杀性巴氏杆菌kmt1片段的第一引物组和靶向睡眠嗜组织菌lolb片段的第二引物组，或本文所鉴定引物组的任何组合。

16、本发明的某些实施方案包含试剂盒(例如，便携式试剂盒)。这种试剂盒的非限制性实例可以包含至少一个lamp引物组，其靶向样品中与brd相关病原体的dna片段；至少一个用于获得所述样品的拭子；以及加热元件以当所述至少一个lamp引物组和所述样品组合时启动所述靶向dna片段的扩增。

17、在至少一个实施方案中，所述试剂盒可还包含荧光指示剂，以及荧光读取器、紫外线读取器或照相机以提供指示所述样品中是否存在靶向病原体的比色结果数据。在至少一个实施方案中，所述至少一个引物组与对ph灵敏或对镁灵敏的比色试剂相偶联。在某些实施方案中，所述比色试剂是酚红。

18、在某些实施方案中，所述至少一个拭子包含鼻拭子，并且所述试剂盒还包含其中有运送培养基的可密封容器。在某些实施方案中，所述加热元件是水浴器。

19、本发明所述的试剂盒可以是便携式的，并且能够在非实验室环境(例如，现场)中使用。

20、所述试剂盒的lamp引物组可以是本文所述lamp引物组(或其组合)的任一种。例如，所述至少一个lamp引物组可以靶向多杀性巴氏杆菌kmt1片段或睡眠嗜组织菌lolb片段。此外，或者说，所述至少一个lamp引物组可以包含靶向多杀性巴氏杆菌kmt1片段的第一引物组和靶向睡眠嗜组织菌lolb片段的第二引物组。