结合PSMA和CD3的异二聚体双特异性抗体的制作方法

本公开涉及特异性结合至肿瘤相关抗原(taa)(例如psma、her2和bcma)和/或cd3的抗体，包括结合至taa(例如psma、her2和bcma)和cd3的双特异性抗体，以及包含它们的组合物。这些抗体可用于增强免疫反应以及治疗疾病，包括实体瘤癌症。

背景技术：

1、用抗cd3单克隆抗体靶向人t细胞上的t细胞受体(tcr)复合物已被用于或建议用于治疗自身免疫性疾病和相关病症，例如器官同种异体移植排斥反应的治疗。对人cd3具有特异性的小鼠单克隆抗体，例如okt3(kung等人(1979)science 206:347-9)是此类治疗的第一代。尽管okt3具有强大的免疫抑制效力，但其临床应用受到与其免疫原性和促有丝分裂潜能相关的严重副作用的阻碍(chatenoud(2003)nature reviews 3:123-132)。它诱导抗球蛋白反应，促进其自身的快速清除和中和(chatenoud等人(1982)eur.j.immunol.137:830-8)。此外，okt3在体外诱导t细胞增殖和细胞因子产生，并引起体内细胞因子的大规模释放(hirsch等人(1989)j.immunol 142:737-43,1989)。细胞因子释放(也称为“细胞因子风暴”)又导致“流感样”综合征，以发烧、发冷、头痛、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、脓毒性脑膜炎和低血压为特征(chatenoud,2003)。如此严重的副作用限制了okt3在移植中更广泛的应用，也限制了其用途向自身免疫等其它临床领域的扩展。同上文。

2、为了减少抗cd3单克隆抗体的副作用，不仅通过将鼠抗cd3单克隆抗体的互补决定区(cdr)移植到人igg序列中，还通过将非fcr结合突变引入fc中以减少细胞因子风暴的发生，开发出新一代经历基因工程改造的抗cd3单克隆抗体(cole等人(1999)transplantation 68:563；cole等人(1997)j.immunol.159:3613)。另参见pct公布号wo2010/042904，该案以引用的方式整体并入本文中。尽管抗cd3抗体和双特异性抗体的开发取得了进展，但细胞因子释放综合征仍然是接合cd3的治疗剂的开发中的关键问题。

3、除了靶向cd3的单特异性治疗剂外，选择性结合至t细胞和肿瘤细胞的多特异性多肽也可以提供一种将t细胞的细胞毒性重定向至肿瘤细胞以及癌症治疗的机制。然而，设计双特异性或多特异性t细胞募集抗体的一个问题是维持特异性，同时通过多个调控路径覆盖对t细胞活化的调控。此外，由于cd3存在于血液淋巴细胞中，故需要产生一种抗cd3单特异性或多特异性分子，该分子不仅会结合至淋巴细胞中的cd3，而且还会到达实体瘤并结合实体瘤附近的cd3。

4、因此，结合至肿瘤相关抗原(taa)和cd3的双特异性抗体难以在临床上实现治疗实体瘤的功效。据推测，难题可能是由双特异性抗体的cd3结合结构域对cd3具有高结合亲和力引起的。由于存在这种亲和力，大多数双特异性抗体在施用给患者时会与血液中循环t细胞上的cd3结合。这可能会导致到达实体瘤的双特异性抗体的量不足。

5、已经开发出靶向cd3以及taa前列腺特异性膜抗原(psma)的双特异性构建体。psma又称为谷氨酸羧肽酶ii和n-乙酰化α连接的酸性二肽酶1。它是一种二聚体ii型跨膜糖蛋白，属于m28肽酶家族，由叶酸水解酶1(folh1)基因编码。这一蛋白质作为谷氨酸羧肽酶作用于包括养分叶酸和神经肽n-乙酰-l-天冬氨酰基-l-谷氨酸在内的不同替代性底物，并在许多组织如前列腺中表达，并且在较低程度上，在小肠、中枢和周围神经系统以及肾脏中有表达。编码psma的基因经历替代性剪接而产生至少三种变体。这一基因中的突变可能与膳食叶酸的肠吸收受损有关，导致血液叶酸水平低以及由此引起的高同型半胱氨酸血症。这种蛋白质在脑中的表达可能涉及与谷氨酸兴奋性毒性相关的多种病理状况。

6、psma是一种充分确定的、高度限制性前列腺癌相关细胞膜抗原。在前列腺癌细胞中，psma的表达量比正常前列腺上皮高1000倍(su等人,cancer res.1995 44:1441-1443)。psma的表达量随前列腺癌的进展而增加，并且在转移性疾病、激素难治性病例和更高级病变中最高(israeli等人,cancer res.1994,54:1807-1811；wright等人,urologiconcology:seminars and original investigations 1995 1:18-28；wright等人,urology1996 48:326-332；sweat等人,urology1998 52:637-a6a)。此外，psma在包括膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌和肾癌在内的多种其它实体瘤的新血管系统中大量表达，但在正常新血管系统中不表达(chang等人,urology 2001 57:801-805；divgi等人,clin.cancer res.1998 4:2729-3279)。

7、经显示，psma是免疫学方法的重要靶标，例如疫苗或利用单克隆抗体的定向疗法。与其它作为分泌蛋白(psa，前列腺酸性磷酸酶)的前列腺限制性分子不同，psma是一种非分泌性整合型细胞表面膜蛋白，这使其成为抗体疗法的理想靶标。(卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide))是一种111in标记的抗psma鼠单克隆抗体，被fda批准用于新诊断的和复发性前列腺癌患者的成像和分期(hinkle等人,cancer 1998,83:739-747)。然而，卡罗单抗结合至psma的细胞内表位，需要内化或暴露psma的内部结构域，因此优先结合凋亡或坏死的细胞(troyer等人,urologic oncology:seminars and originalinvestigations 1995 1:29-37；troyer等人,prostate 1997 30:232-242)。因此，卡罗单抗可能没有治疗益处(liu等人,cancer res.1997 57:3629-3634)。

8、已经开发出靶向psma外部结构域的其它单克隆抗体(例如j591、j415、j533和e99)(liu等人,cancer res.1997 57:3629-3634)。然而，有证据表明，psma可以充当受体介导推定配体的内化。psma经历组成型内化，并且psma特异性抗体可诱导和/或增加内化速率，然后使抗体在内体中积累(liu等人,cancer res.199858:4055-4060)。虽然psma特异性内化抗体可能有助于开发将毒素、药物或放射性同位素靶向递送至前列腺癌细胞内部的治疗剂(tagawa等人,cancer 2010 116(s4):1075)，但由于psma特异性抗体在被效应细胞识别之前可能会被内化，故利用天然或工程改造的效应子机制(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)或重定向t细胞的细胞毒性(rtcc))的psma特异性抗体可能会出现问题。

9、因此，仍然需要能够有效治疗包括前列腺癌在内的实体瘤癌症，而且不会在患者体内引发有害的全身性细胞因子释放的taa x cd3双特异性抗体(例如psma x cd3双特异性抗体)。

技术实现思路

1、本文提供了结合至cd3和肿瘤相关抗原(taa)如psma的抗体。此类抗体可以“失调(detuned)”而对cd3具有降低的或较低的结合亲和力，同时维持对taa的强结合亲和力。此类失调的抗体被设计成保留对cd3的足够结合亲和力以诱导cd8 t细胞活化和增殖。与其它基于抗cd3的治疗剂相比，本文提供的失调抗体具有强效杀灭实体瘤细胞和低细胞因子释放的益处。

2、双特异性抗体的降低的cd3结合亲和力可以如本文所解释的那样实现，例如，通过处理cd3结合结构域的序列、通过将cd3结合结构域放于双特异性抗体的c末端(例如通过连接至免疫球蛋白恒定区的c末端)，和/或通过使双特异性抗体对cd3呈单价来实现。例如，本文提供了被设计成对于taa呈二价并且对于cd3呈单价的抗体。此外，本文提供的taa x cd3抗体可包含修饰的fc区，它防止或降低cdc和/或adcc活性。

3、降低cd3结合结构域的结合亲和力可以减少血液中循环t细胞所结合的抗体量，并使taa x cd3双特异性抗体能够到达实体瘤，在此情况下，t细胞的细胞毒性可以在肿瘤处发生。与对cd3不具有降低的结合亲和力的对照taa x cd3抗体相比，此类taa x cd3抗体可以对表达taa的实体瘤细胞展现出提高的杀伤作用。

4、与对cd3具有高亲和力的taa x cd3抗体相比，本文提供的taa x cd3抗体引起降低的炎性细胞因子(例如ifn-γ、il-2、tnf-α和/或il-6)水平。与对cd3具有高亲和力的taax cd3抗体相比，本文提供的taa x cd3抗体引起降低的炎性细胞因子(例如颗粒酶b、il-10和/或gm-csf)水平。本文所公开的taa x cd3双特异性抗体在患者体内引起不可检测的水平的细胞因子释放或降低的水平的细胞因子释放。降低taa x cd3抗体的cd3结合结构域对cd3的结合亲和力可以降低用包含taa x cd3的药物组合物治疗的患者患细胞因子释放综合征的可能性。

5、taa(例如psma)结合结构域与psma的结合强度、结合效力和/或亲合力可高于cd3结合结构域对cd3所具有的结合强度、结合效力和/或亲合力。在jurkat细胞测定中，与tsc266和/或psma01110相比较，cd3结合结构域对cd3可具有降低的结合强度、结合效力和/或亲合力。

6、在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：(a)第一多肽，该第一多肽从n末端到c末端包含(i)结合至肿瘤相关抗原(taa)的第一单链可变片段(scfv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至cd3的scfv；以及(b)第二多肽，该第二多肽从n末端到c末端包含(i)结合至taa的第二scfv和(ii)免疫球蛋白恒定区，

7、其中所述双特异性抗体不含第二cd3结合结构域。

8、在某些方面，taa是psma、her2或bcma。在某些方面中，taa是psma。

9、在某些方面，第一多肽与第二多肽通过至少一个二硫键接合。

10、在某些方面，结合至taa的第一scfv呈vh-vl取向。在某些方面，结合至taa的第一scfv呈vl-vh取向。

11、在某些方面，结合至taa的第二scfv呈vh-vl取向。在某些方面，结合至taa的第二scfv呈vl-vh取向。

12、在某些方面，结合至taa的第一scfv与结合至taa的第二scfv是相同的。

13、在某些方面，结合至cd3的scfv呈vh-vl取向。在某些方面，结合至cd3的scfv呈vl-vh取向。

14、在某些方面，第一多肽中的免疫球蛋白恒定区包含结突变(knob mutation)和/或第二多肽中的免疫球蛋白恒定区包含孔突变(hole mutation)。在某些方面，第一多肽中的免疫球蛋白恒定区包含孔突变和/或第二多肽中的免疫球蛋白恒定区包含结突变。

15、在某些方面，包含结突变的免疫球蛋白恒定区包含seq id no:66的氨基酸序列和/或包含孔突变的免疫球蛋白恒定区包含seq id no:68的氨基酸序列。

16、在某些方面，与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止fcγr1和/或fcγriiib的结合。在某些方面，与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止或降低cdc活性。

17、在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含igg1 ch2结构域，根据eu编号系统，该结构域包含e233p、l234a、l235a、g237a和k322a取代以及g236缺失。

18、在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白igg1的ch2和ch3结构域。

19、在某些方面，双特异性抗体不含ch1结构域。

20、在某些方面，双特异性抗体包含结合至taa的第一scfv、结合至cd3的scfv和/或结合至taa的第二scfv包含甘氨酸-丝氨酸接头。

21、在某些方面，结合至taa的第一scfv、结合至cd3的scfv和/或结合至taa的第二scfv包括含氨基酸序列(gly4ser)n的甘氨酸-丝氨酸接头，其中n＝1-5。在某些方面，n＝4。

22、在某些方面，第一多肽和/或第二多肽还在scfv与免疫球蛋白恒定结构域之间包含至少一个接头。在某些方面，接头包含铰链区。在某些方面，铰链是igg1铰链区。在某些方面，铰链包含seq id no:156的氨基酸序列。

23、在某些方面，结合至psma的第一scfv和/或结合至psma的第二scfv能够结合食蟹猴psma。在某些方面，结合至psma的第一scfv和/或结合至食蟹猴psma的第二scfv具有比结合至人psma的ec50高不超过5倍的ec50。

24、在某些方面，双特异性抗体能够同时结合至taa和cd3。

25、在某些方面，结合至cd3的scfv结合至cd3ε。

26、在某些方面，结合至psma的第一scfv包含可变重链(vh)互补决定区(cdr)1、vhcdr2和vh cdr3，所述vh cdr 1、vh cdr2和vh cdr3分别包含seq id no:70、72和74的氨基酸序列，并且包含可变轻链(vl)cdr1、vl cdr2和vl cdr3，所述vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3分别包含seq id no:76、78和80的氨基酸序列。

27、在某些方面，结合至psma的第一scfv包含vh结构域，该结构域包含seq id no:82的氨基酸序列，并且包含vl结构域，该结构域包含seq id no:84的氨基酸序列。

28、在某些方面，结合至psma的第一scfv包含seq id no:86的氨基酸序列。

29、在某些方面，结合至cd3的scfv包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，所述vh cdr1、vhcdr2和vh cdr3分别包含seq id no:88、90和92的氨基酸序列，并且包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，所述vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3分别包含seq id no:94、96和98的氨基酸序列。

30、在某些方面，结合至cd3的scfv包含vh结构域，该结构域包含seq id no:100的氨基酸序列，并且包含vl结构域，该结构域包含seq id no:102的氨基酸序列。

31、在某些方面，结合至cd3的scfv包含seq id no:104或110的氨基酸序列。

32、在某些方面，结合至psma的第二scfv包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，所述vhcdr1、vh cdr2和vh cdr3分别包含seq id no:70、72和74的氨基酸序列，并且包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，所述vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3分别包含seq id no:76、78和80的氨基酸序列。

33、在某些方面，结合至psma的第二scfv包含vh结构域，该结构域包含seq id no:82的氨基酸序列，并且包含vl结构域，该结构域包含seq id no:84的氨基酸序列。

34、在某些方面，结合至psma的第二scfv包含seq id no:86的氨基酸序列。

35、在某些方面，第一多肽包含seq id no:106、178或112的氨基酸序列。

36、在某些方面，第二多肽包含seq id no:108的氨基酸序列。

37、在某些方面，双特异性抗体能够促进cd8+t细胞和/或cd4+t细胞的扩增。在某些方面，双特异性抗体能够活化cd8+t细胞和/或cd4+t细胞。在某些方面，双特异性抗体能够增加中央记忆t细胞(tcm)和/或效应记忆t细胞(tem)。在某些方面，双特异性抗体能够减少原始t细胞和/或终末分化t细胞(teff)。

38、在某些方面，双特异性抗体能够减少ifn-γ、il-2、il-6和/或tnf-α的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够减少颗粒酶b、il-10和/或gm-csf的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够增加nfκb、nfat和/或erk信号传导路径的信号传导。

39、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含psma结合结构域，其中psma结合结构域包含vh和vl，其中vh包含seq id no:82的氨基酸序列。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含psma结合结构域，其中psma结合结构域包含vh和vl，其中vl包含seq id no:84的氨基酸序列。在某些方面，vh包含seq id no:82的氨基酸序列，并且vl包含seq id no:84的氨基酸序列。

40、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含cd3抗原结合结构域，其中cd3抗原结合结构域包含vh和vl，其中vh包含seq id no:100的氨基酸序列。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含cd3抗原结合结构域，其中cd3抗原结合结构域包含vh和vl，其中vl包含seq id no:102的氨基酸序列。在某些方面，vh包含seq id no:100的氨基酸序列，并且vl包含seq id no:102的氨基酸序列。

41、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是igg抗体，任选地其中igg抗体是igg1抗体。

42、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区，任选地其中重链恒定区是人igg1重链恒定区，和/或任选地其中轻链恒定区是人iggκ轻链恒定区。

43、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含fab、fab'、f(ab')2、scfv、二硫键连接的fv或scfv-fc。

44、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含scfv。

45、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含seq id no:86的氨基酸序列。

46、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含seq id no:104的氨基酸序列。

47、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。

48、在某些方面，双特异性抗体或片段包含特异性结合psma的抗原结合结构域和特异性结合cd3的抗原结合结构域。

49、在某些方面，(i)特异性结合psma的抗原结合结构域包含seq id no:82和84的氨基酸序列，和/或(ii)特异性结合cd3的抗原结合结构域包含seq id no:100和102的氨基酸序列。

50、在某些方面，特异性结合psma的抗原结合结构域包含呈vh-vl取向的vh和vl。在某些方面，特异性结合psma的抗原结合结构域包含呈vl-vh取向的vh和vl。

51、在某些方面，特异性结合cd3的抗原结合结构域包含呈vh-vl取向的vh和vl。在某些方面，特异性结合cd3的抗原结合结构域包含呈vl-vh取向的vh和vl。

52、在某些方面，特异性结合psma的抗原结合结构域包含scfv，该scfv包含seq idno:86的氨基酸序列。

53、在某些方面，特异性结合至cd3的抗原结合结构域包含scfv，该scfv包含seq idno:104的氨基酸序列。

54、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于cd3是单价的。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于cd3是二价的。

55、在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于psma是二价的。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于psma是单价的。

56、在某些方面，抗体或片段包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含(i)第一单链可变片段(scfv)；(ii)接头，任选地其中所述接头是铰链区；(iii)免疫球蛋白恒定区；以及(iv)第二scfv，其中(a)第一scfv包含人cd3抗原结合结构域，并且第二scfv包含人psma抗原结合结构域，或者(b)第一scfv包含人psma抗原结合结构域并且第二scfv包含人cd3抗原结合结构域。

57、在某些方面，抗体或片段包含结突变和孔突变。

58、在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：(a)第一多肽，该第一多肽从n末端到c末端包含(i)结合至psma的第一单链可变片段(scfv)，该scfv包含seq id no:86的氨基酸序列；(ii)包含seq id no:156的氨基酸序列的接头；(iii)包含seq id no:66的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区；和(iv)结合至cd3的scfv，该scfv包含seq id no:104的氨基酸序列；以及(b)第二多肽，该第二多肽从n末端到c末端包含(i)结合至psma的第二scfv，该第二scfv包含seq id no:86的氨基酸序列；(ii)包含seq id no:156的氨基酸序列的接头；和(iii)包含seq id no:68的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区，其中双特异性抗体不含第二cd3结合结构域。

59、在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：第一多肽，该第一多肽包含seq idno:106、178或112的氨基酸序列；以及第二多肽，该第二多肽包含seq id no:108的氨基酸序列，其中双特异性抗体仅含一个cd3结合结构域。

60、在某些方面，本文提供的双特异性抗体由包含seq id no:106、178或112的氨基酸序列的第一多肽和包含seq id no:108的氨基酸序列的第二多肽组成。

61、在某些方面，本文提供的多核苷酸编码本文提供的双特异性抗体。

62、在某些方面，本文提供的载体或表达载体包含编码本文提供的双特异性抗体的多核苷酸。

63、在某些方面，本文提供的宿主细胞包含编码双特异性抗体的多核苷酸或编码本文提供的双特异性抗体的载体。

64、在某些方面，本文提供的宿主细胞包含编码本文提供的双特异性抗体的多核苷酸的组合。在某些方面，所述多核苷酸在单一载体上编码。在某些方面，所述多核苷酸在多个载体上编码。

65、在某些方面，宿主细胞选自由cho、hek293或cos细胞组成的组。

66、在某些方面，产生如本文提供的特异性结合至人psma和人cd3的双特异性抗体的方法包括培养宿主细胞以产生抗体，并且任选地还包括回收抗体。

67、在某些方面，用于检测样品中的psma和cd3的方法包括使样品与本文提供的双特异性抗体接触，任选地其中样品包含细胞。

68、在某些方面，本文提供的药物组合物包含本文提供的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。

69、在某些方面，本文提供的用于增加t细胞增殖的方法包括使t细胞与本文提供的双特异性抗体或本文提供的药物组合物接触。在某些方面，t细胞是cd4+t细胞。在某些方面，t细胞是cd8+t细胞。

70、在某些方面，细胞在受试者体内，并且接触包括向受试者施用抗体或药物组合物。

71、在某些方面，用于增强受试者的免疫反应的方法包括向受试者施用有效量的本文提供的双特异性抗体或本文提供的药物组合物。

72、在某些方面，用于诱导针对表达前列腺特异性膜抗原(psma)的细胞的重定向t细胞的细胞毒性(rtcc)的方法包括使表达psma的细胞与本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物接触，其中所述接触处于诱导针对表达psma的细胞的rtcc的条件下。

73、在某些方面，用于治疗受试者的以前列腺特异性膜抗原(psma)过表达为特征的病症的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物。

74、在某些方面，本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物在受试者体内诱导重定向t细胞的细胞毒性(rtcc)。

75、在某些方面，双特异性抗体促进cd8+和/或cd4+t细胞的扩增或增殖。在某些方面，双特异性抗体活化cd8+和/或cd4+t细胞。在某些方面，双特异性抗体增加中央记忆t细胞(tcm)和/或效应记忆t细胞(tem)。在某些方面，双特异性抗体减少原始t细胞和/或终末分化t细胞(teff)。

76、在某些方面，双特异性抗体减少ifn-γ、il-2、il-6和/或tnf-α的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够减少颗粒酶b、il-10和/或gm-csf的分泌。在某些方面，双特异性抗体增加nfκb、nfat和/或erk信号传导路径的信号传导。

77、在其它方面，病症是癌症。在某些方面，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、psma(+)癌症、转移性前列腺癌、透明细胞肾癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌和胃癌。在某些方面中，癌症是前列腺癌。在某些方面中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。在某些方面，病症是前列腺病症。在某些方面，前列腺病症选自由前列腺癌和良性前列腺增生组成的组。