具有产肠毒素性大肠杆菌特异性杀菌作用的新噬菌体及包含其的抗菌组合物的制作方法

本发明涉及一种对产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic escherichia coli)具有特异性杀菌活性的新型噬菌体，以及包含该噬菌体的抗菌组合物。

背景技术：

1、大肠杆菌(escherichia coli，以下简称“大肠杆菌(e.coli)”)是一种革兰氏阴性短杆状细菌，属于肠杆菌科(enterobacteriaceae)埃希氏菌属(escherichia)，是存在于各种动物(包括哺乳动物)的肠道中的正常菌群之一。大肠杆菌大多是非致病性的，可以引起机会性感染，但已知一些高致病性菌株引起包括人类在内的动物的各种肠道疾病和败血症等。

2、特别是，根据牲畜(例如猪、家禽、牛等)的群体饲养，大肠杆菌病(colibacillosis)正在成为畜牧场中最常见和最有问题的疾病，并且随着大肠杆菌病发病率的增加，这是一种给畜牧场造成重大经济损失的情况，例如牲畜由于腹泻而生长迟缓和死亡等。为了预防和治疗大肠杆菌病，已经使用了多种抗生素，但随着抗生素滥用的耐药性问题，或可能残留在动物体内的问题的出现，目前世界范围内对抗生素的施用设置了许多限制。

3、因此，近年来，由于噬菌体是感染特定细菌并抑制细菌生长的细菌特异性病毒，具有比抗生素更强的宿主特异性，因此已将噬菌体作为新抗生素的替代品进行研究，但目前该噬菌体的数量完全不足。因此，为了预防和治疗成为畜牧业(包括猪)的重要问题的产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病，一直要求开发一种新噬菌体，该噬菌体由于具有广谱的溶菌作用和优异的耐酸性和耐热性而具有很高的工业实用性。

4、[现有技术]

5、[专利文献]

6、(专利文献1)美国专利us 6,942,858 b1

技术实现思路

1、技术问题

2、本技术的一个目的是提供噬菌体cj_eco_20-4，该噬菌体cj_eco_20-4对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀菌活性并且保藏编号为kccm12936p；包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物、抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或洗涤剂；或包含该饲料添加剂的饲料；或包含该饮用水添加剂的饮用水。

3、本发明的另一个目的是提供一种使用噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物来预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，该组合物用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病。

4、本发明的又一目的是提供一种噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物在制备由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的预防剂或治疗剂中的用途，该组合物用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病。

5、技术方案

6、本发明中每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。换句话说，本技术中公开的各种元素的所有组合都落入本技术的范围内。另外，本技术的范围不应被解释为受到下文描述的具体描述的限制。此外，本领域技术人员仅使用常规实验就可以认识或确认本技术中描述的特定方面的许多等同物。此外，这些等同物旨在包括在本技术中。

7、一方面提供噬菌体cj_eco_20-4，该噬菌体cj_eco_20-4对产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic escherichia coli：etec)具有特异性杀菌活性，并且保藏编号为kccm12936p。

8、本文使用的术语“产肠毒素性大肠杆菌(etec)”是致病性大肠杆菌之一，并且对应于在动物(例如猪等)中引起感染性疾病的致病细菌。

9、本文使用的术语“噬菌体(bacteriophage)”是感染特定细菌并抑制相应细菌生长的细菌特异性病毒，并且是指包含单链或双链dna或rna作为遗传物质的病毒。

10、另一方面提供了一种用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，该组合物包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。

11、噬菌体cj_eco_20-4如上文所述。

12、噬菌体cj_eco_20-4对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀菌活性，因此当在产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病出现之前施用于受试者时，该噬菌体cj_eco_20-4可以通过杀死进入受试者的产肠毒素性大肠杆菌并抑制由此引起的感染，而预防由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病。另外，当将噬菌体cj_eco_20-4施用于患有由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的受试者时，通过杀死受试者中存在的产肠毒素性大肠杆菌，该噬菌体cj_eco_20-4可以减轻或消除由此显示的症状，并因此可以治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病。

13、本文使用的术语“预防”可以指通过施用噬菌体或组合物来抑制或延迟受试者中疾病的发生的所有行为，并且术语“治疗”可以指通过施用噬菌体或组合物来改善、减轻或消除受试者中的疾病症状的所有行为。

14、由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病可以是，例如大肠杆菌病，但不限于此。

15、本文所用的术语“大肠杆菌病”是指因致病性大肠杆菌感染家畜而发生的疾病，其可能会出现的症状为败血症、腹泻(新生儿腹泻和断奶后腹泻)、毒血症(水肿病和脑脊髓血管病)等。其中，败血症是频繁发生于出生后2～3天内的新生儿期的急性全身感染性疾病，死亡率较高。腹泻是肠道感染性疾病，频繁发生于哺乳期和断奶后1～2周龄内即刻发生，并且引起死亡或发育障碍。毒血症主要发生在断奶后8～12周的仔猪等，并且全身肿胀，出现神经症状，经常导致突然死亡。

16、用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，可以包含1×102pfu/ml～1×1020pfu/ml或1×102pfu/g～1×1020pfu/g的噬菌体cj_eco_20-4，并且例如，该组合物可以包含1×102pfu/ml～1×1012pfu/ml或1×105pfu/g～1×1010pfu/g的噬菌体cj_eco_20-4。

17、用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且该组合物可以与该载体配制在一起作为食品、药物、饲料添加剂或饮用水添加剂等提供。

18、本文使用的术语“药学上可接受的载体”可以指不刺激生物体并且不抑制所施用的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。

19、要在组合物中包含的载体的种类没有特别限制，并且可以使用本领域常用的任何药学上可接受的载体。载体的非限制性实例可以包括盐水溶液、无菌水、林格氏溶液(ringer’s solution)、缓冲盐水溶液、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油等。它们可以单独使用，也可以两种以上混合并使用，并且根据需要，该载体可以配制成溶液剂、混悬剂、乳剂等注射剂，通过另外添加稀释剂、分散剂、粘合剂和润滑剂而制成丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

20、用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物可以通过口服给药或肠胃外给药来施用，并且可以采用向患病区域应用或喷雾的方法来施用。在肠胃外给药的情况下，可以采用静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、皮下给药或局部给药来施用。该组合物的应用、喷雾和给药的量根据例如配制方法、给药方法、目标动物和患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、食物、给药时间、给药途径、排泄速率和反应敏感性等因素而变化，并且普通熟练的医生或兽医可以容易地确定和开药用于所需治疗的有效剂量。

21、作为用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的口服给药制剂，例如，可以将其配制为片剂、锭剂(troche)、锭剂(lozenge)、水或油混悬剂、制备的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、糖浆剂或酏剂。为了将其配制为制剂，例如片剂或胶囊剂等，可以包含粘合剂例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶，赋形剂例如磷酸二钙，崩解剂例如玉米淀粉或红薯淀粉，或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡，以及在胶囊制剂的情况下，除上述材料外还可以进一步包含液体载体例如饱和油。

22、作为用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的肠胃外给药制剂，可以将其配制为注射剂形式，例如皮下注射、静脉内注射或肌肉内注射等，或喷雾剂等形式，例如允许通过栓剂注射方法或呼吸器吸入的气雾剂。为了将其配制为注射制剂，可以通过与稳定剂或缓冲剂在水中混合来将本发明的组合物制备为溶液剂或混悬剂，并且可以将该组合物配制用于大剂量或小瓶的单位给药。当其被配制成喷雾剂例如气雾剂等时，可以将推进剂等与添加剂混合，从而形成水分散的浓缩物或潮湿粉末。

23、用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物可以包含防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、冷冻保护剂或赋形剂等。

24、组合物中可以包含足以减少组合物变质的有效剂量的防腐剂、稳定剂或赋形剂。

25、本文使用的术语“恶化”可以包括组合物等中包含的噬菌体cj_eco_20-4的细菌数量减少、活性降低，或其组合。

26、例如，由于组合物包含足以减少组合物恶化的有效剂量的防腐剂、稳定剂或赋形剂，与自然界中存在的噬菌体不同，噬菌体cj_eco_20-4可以在组合物中较长时间存活或维持活性。

27、作为防腐剂、稳定剂或赋形剂，可以不受限制地使用本领域常用的那些，只要它们可以减少组合物的恶化即可。例如，所述稳定剂可以是选自由海藻酸盐、海藻酸钠、酪蛋白、酪蛋白钠、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、果胶、明胶、阿拉伯胶、黄原胶、葡聚糖、环糊精和淀粉所组成的组中的任意一种或多种。

28、当组合物被冷冻干燥时，冷冻保护剂可以以足以减少组合物恶化的有效剂量包含在组合物中。例如，与自然界中存在的具有降低活性或不能在冷冻干燥组合物中存活的噬菌体不同，即使在冷冻干燥组合物中噬菌体活性也可以维持或者该噬菌体可以存活，因为该组合物包含有效剂量的冷冻保护剂，足以减少冷冻干燥状态下组合物的恶化。

29、至于冷冻保护剂，可以不受限制地使用本领域常用的那些，只要其能够减少组合物在冷冻干燥状态下的恶化即可。例如，冷冻保护剂可以是选自由甘油、乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜(dmso)、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖糊精、糊精、脱脂牛奶和淀粉所组成的组中的任意一种或多种。

30、另一方面提供了一种抗生素，该抗生素包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。

31、噬菌体cj_eco_20-4如上文所述。

32、本文使用的术语“抗生素”可以指能够杀死细菌或抑制细菌生长的试剂，并且可以统称为防腐剂、杀菌剂和抗菌剂。

33、包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的抗生素与常规抗生素相比，对产肠毒素性大肠杆菌具有非常高的特异性，因此该抗生素不能杀灭有益的细菌，只可以杀灭特定的致病菌，并且不会导致药物耐受性，因此，与常规抗生素相比，该抗生素可以表现出延长产品有效期的效果。

34、抗生素可以通过本领域常用的制备方法来制备。

35、抗生素可以包含足以减少抗生素恶化的有效剂量的添加剂，并且添加剂可包括防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂等。由于抗生素包含添加剂，因此与自然界中存在的噬菌体不同，噬菌体cj_eco_20-4可以在抗生素中更长时间存活或维持活性。作为防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂，可以不受限制地使用本领域常用的那些，只要其能够减少抗生素的恶化即可。

36、另一方面提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。另一方面提供了一种饲料，该饲料包含该饲料添加剂。另一方面提供了一种饮用水添加剂，该饮用水添加剂包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。另一方面提供了一种饮用水，该饮用水包含该饮用水添加剂。

37、噬菌体cj_eco_20-4如上文所述。

38、以包含噬菌体cj_eco_20-4的组合物形式制备的饲料添加剂或饮用水添加剂可以通过在饲料或饮用水中混合的方法来使用，或者在饲料或饮用水的制备过程中，直接添加噬菌体cj_eco_20-4。

39、饲料添加剂或饮用水添加剂中包含的噬菌体cj_eco_20-4可以是液体状态或干燥的固体状态，并且具体地，可以是干燥的粉末形式。噬菌体cj_eco_20-4的干燥方法可以是空气干燥、自然干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，但不限于此。噬菌体cj_eco_20-4可以以干燥的粉末形式，以占饲料添加剂或饮用水添加剂重量的0.05重量％～10重量％，具体地0.1重量％～2重量％的量混合。

40、如果需要，包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂还可以包含其他添加剂。可用添加剂的非限制性实例包括，加入以防止饲料或饮用水恶化的粘合剂、乳化剂、防腐剂等；以及氨基酸剂、维生素剂、酶剂、益生菌、调味剂、非蛋白氮化合物(npn)、硅酸盐剂、缓冲剂、着色剂、提取剂或寡糖等，它们可以单独加入或两种以上一起加入。

41、饲料或饮用水中包含的除了噬菌体cj_eco_20-4之外的原料可以不受限制地使用本领域常用的那些。饲料的非限制性实例可以包括蔬菜饲料，例如谷物、根茎类水果、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、油和脂肪、淀粉、粗粉或谷物副产品等；以及动物饲料，例如蛋白质、无机材料、油和脂肪、矿物质、油和脂肪、单核细胞蛋白、浮游动物或食品等。它们可以单独使用或两种以上混合使用。

42、基于100重量份的饲料，饲料添加剂的含量可以为0.05重量份～10重量份，例如0.1重量份～2重量份。基于100重量份的饮用水，饮用水添加剂的含量可为0.0001重量份～0.01重量份，例如0.001重量份～0.005重量份。

43、饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂或饮用水可以通过本领域常用的制备方法来制备。

44、饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂或饮用水可以包含足以减少其恶化的有效剂量的添加剂，并且该添加剂可以是防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂等。通过包含添加剂，饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂或饮用水可以比饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂或饮用水中的噬菌体cj_eco_20-4(与自然界中存在的噬菌体不同)存活或保持活性更长时间。只要防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂可以减少饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂或饮用水的恶化，就可以不受限制地使用本领域常用的那些。

45、另一方面提供了一种消毒剂，该消毒剂包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。另一方面提供了一种洗涤剂，该洗涤剂包含噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分。

46、噬菌体cj_eco_20-4如上文所述。

47、消毒剂或洗涤剂的制剂没有特别地限制，并且可以将其制备为本领域公知的制剂并使用。消毒剂或洗涤剂可以通过本领域常用的制备方法来制备。

48、消毒剂可以喷洒以去除产肠毒素性大肠杆菌，并且可以喷洒在动物活动区域、屠宰场、死亡区域、烹饪场所或烹饪设施等，但不限于此。

49、洗涤剂可用于清洗暴露于或可能暴露于产肠毒素性大肠杆菌的动物皮肤表面或各个身体部位等的用途，但不限于此。

50、消毒剂或洗涤剂可以包含足以减少其恶化的有效剂量的添加剂，并且该添加剂可以是防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂等。通过包含添加剂，消毒剂或洗涤剂可以比消毒剂或洗涤剂中的噬菌体cj_eco_20-4(与自然界中存在的噬菌体不同)存在或保持活性更长时间。只要防腐剂、稳定剂、赋形剂或冷冻保护剂可以减少消毒剂或洗涤剂的恶化，就可以使用本领域常用的那些，而没有限制。

51、另一方面，提供一种用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，该方法包括将噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物施用于除人类以外的动物。

52、噬菌体cj_eco_20-4、包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物、以及由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病如上文所述。具体地，由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病可以是，例如大肠杆菌病。

53、用于预防或治疗方法，具体地包括将药学有效剂量的噬菌体cj_eco_20-4，或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物施用于除人类之外的动物体内，所述动物感染产肠毒素性大肠杆菌或有感染产肠毒素性大肠杆菌的风险。噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物可以以药物制剂的形式施用于动物，或者可以通过以饲料添加剂或饮用水添加剂的形式混合到动物的饲料或饮用水中并喂养该饲料或饮用水的方法施用。

54、噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物的给药途径可以是各种口服途径或肠胃外途径，只要其能够到达靶组织即可，具体地，可以通过口服给药、直肠给药、局部给药、静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、动脉内给药、经皮给药、鼻内给药、吸入给药等常规方法施用。

55、噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物的合适的每日总用量可以由治疗医生在正确医学判断的范围内确定，这对于本领域技术人员来说是显而易见的事情。

56、噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物对于特定动物的具体药学有效剂量可以考虑要实现的反应类型和程度，相应受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别或饮食，以及噬菌体cj_eco_20-4或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的组合物的给药时间和给药途径，以及组合物的分泌速率、治疗周期等来确定，并且该有效剂量可以根据多种因素而变化，包括药物和同时或在不同时间一起使用的组合物的其他组分，以及医学领域中公知的类似因素。

57、作为除人以外的动物，可以是被产肠毒素性大肠杆菌感染的任何动物，没有特别限定。例如，该动物可以是鸟类或哺乳动物，具体地，可以包括鸡、鸭、猪等，但不限于此。

58、另一方面，提供了一种噬菌体cj_eco_20-4的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，或包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，用于制备由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的预防剂或治疗剂的用途。

59、噬菌体cj_eco_20-4、包含该噬菌体cj_eco_20-4作为活性成分的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物、以及由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病如上文所述。具体地，由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病可以是，例如大肠杆菌病。

60、有益效果

61、新型噬菌体cj_eco_20-4具有特异性杀灭产肠毒素性大肠杆菌的作用，并且具有优异的耐酸性和耐热性，因此可广泛应用于抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或洗涤剂等，作为用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的感染性疾病的用途。