一种具有抗肿瘤活性积雪草酸化学修饰物及其制备方法

1.本发明涉及一种天然积雪草酸结构改造物及其制备方法，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性积雪草酸化学修饰物及其制备方法。


背景技术：

2.积雪草酸(asiatic acid，aa)，又被称为亚细亚酸，是一种常见的五环三萜类化合物，具有乌苏烷型骨架，其分子式为c
48h78
o5，主要来源于植物积雪草(centellaasiatica)，积雪草是一种药用植物，其有效成份为五环三萜类衍生物（积雪草酸和积雪草总苷）。从古至今，积雪草一直是各种实验和临床研究的对象，目前，临床研究主要针对积雪草酸的抗肿瘤、抗抑郁、保肝、护肤和免疫调节等生物活性，部分作用机制也已被证实。因为其良好的生物活性，积雪草酸具有较好的发展前景。其化学结构如下式所示：


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性积雪草酸化学修饰物及其制备方法。该方法以积雪草酸为先导化合物，设计出一系列积雪草酸化学修饰物。经过药理活性测试证明它们对人宫颈癌细胞（hela），人肝癌细胞（hepg2），人胃癌细胞（bgc-823）等具有较好的抑制活性。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种具有抗肿瘤活性的积雪草酸化学修饰物，对积雪草酸a环、c环和c-28位的化学修饰，分别得到积雪草酸a环骈合1,3-二氧六环、氢化吡嗪环、喹喔琳环以及a环羟基全乙酰化的c-28位羧酸酯类或酰胺类积雪草酸化学修饰物，所述积雪草酸化学修饰物包括以下四类：
ꢀꢀꢀꢀ
（1）在积雪草酸结构基础上进行修饰与改造，将c-2、c-3、c-23位羟基全乙酰化，c-11位亚甲基氧化成羰基，c-28位羧基与胺反应成酰胺，得到一系列化合物，其结构如下表所示：
（2）在积雪草酸结构基础上进行修饰与改造，将a环c-3、c-23位羟基缩合成2,2-二甲基-1,3-二氧六环；将c-2位羟基氧化成羰基，进一步与盐酸羟胺反应成肟，再与乙酸酐反应成乙酰氧亚氨基；将c-28位羧基与卤代烷或胺反应成酯或酰胺，得到一系列化合物，其结构如下表所示：（3）在积雪草酸结构的基础上进行修饰与改造，将a环c-2、c-3位羟基并合氢化吡嗪环或骈合喹喔琳环，c-23位羟基氧化成羰基，c-28位羧酸与卤代烷反应成酯，得到一系列化合物，化合物结构如下表所示：
一种具有抗肿瘤活性的积雪草酸化学修饰物制备方法，其所述方法包括以下步骤：（1）积雪草酸（aa）以4-二甲氨基吡啶（dmap）为催化剂，少量吡啶为缚酸剂，a环c-2、c-3、c-23位羟基与乙酸酐反应得到2α，3β，23-三乙酰氧基-乌苏烷型-12-烯
‑ꢀ
28-羧酸( aa-1) 。
4.（2）将aa-1与草酰氯反应后，进一步与相应的胺类化合物反应制得n-[2α，3β，23-三乙酰氧基-乌苏烷型-12-烯-28-酰基]-胺类化合物i
1~4
。
[0005]
（3）aa-1经重铬酸钾（k2cr2o7）氧化，生成2α，3β，23-三乙酰氧基-11-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-2）。
[0006]
（4）将aa-2与草酰氯反应后，进一步与相应的胺类化合物反应制得n-[2α，3β，23-三乙酰氧基-11-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰基]-胺类化合物i
5~8
。
[0007]
（5）积雪草酸（aa）以对甲基苯磺酸为催化剂，与2,2-二甲氧基丙烷反应将c-3、c-23位羟基缩合成2,2-二甲基-1,3-二氧六环，生成2α-羟基-3β, 23-o-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-3）。
[0008] （6）aa-3经pdc氧化，生成2-羰基-3β，23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-4）。
[0009]
（7）将aa-4与盐酸羟胺反应生成2-肟基-3β, 23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-5）。
[0010]
（8）将aa-5与草酰氯反应后，进一步与相应的胺反应生成n-[ 2-肟基-3，23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)]-胺类化合物ii
1~4
。
[0011]
（9）aa-5与乙酸酐反应生成2-乙酰氧亚氨基-3β,23-o-异亚丙基-12-烯-28-羧酸（aa-6）。
[0012]
（10）aa-6在碳酸钾碱性条件下与相应的卤代烷反应制得2-乙酰氧亚氨基-3β,23-o-异亚丙基-12-烯-28-羧酸酯类化合物ii
5~10
。
[0013]
（11）将积雪草酸（aa）溶于二氯甲烷，经负载硅胶的pdc氧化，反应生成2, 3, 23-三羰基-乌苏烷-12-烯-28羧酸（aa-7）。
[0014] （12）aa-7与乙二胺反应生成2, 3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-8）。
[0015]
（13）aa-8在碳酸钾碱性条件下与相应的卤代烷反应生成2, 3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸酯类化合物iii
1~4
。
[0016] （14）aa-7与邻苯二胺反应生成2, 3-并喹喔啉环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-9）。
[0017]
（15）aa-9在碳酸钾碱性条件下与相应的卤代烷反应生成 2, 3-并喹喔啉环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸酯类化合物iv
1~4
。
[0018]
本发明的优点与效果是：本发明对天然产物积雪草酸进行化学结构修饰，得到一系列积雪草酸的化学修饰物，经过药理活性测试证明它们对人宫颈癌细胞（hela），人肝癌细胞（hepg2）和人胃癌细胞（bgc-823）等具有较好的抑制作用，且优于母体化合物积雪草酸。
具体实施方式
[0019]
下面结合实施例对本发明做进一步详述： 1、积雪草酸（aa）以4-二甲氨基吡啶（dmap）为催化剂，与乙酸酐室温下反应，将a环c-2、c-3、c-23位羟基乙酰化得到2α，3β，23-三乙酰氧基-乌苏烷型-12-烯
‑ꢀ
28-羧酸( aa-1) 。在合成路线的基础上，c-28羧酸与草酰氯反应后，进一步与胺类化合物反应生成n-[2α，3β，23-三乙酰氧基-乌苏烷型-12-烯-28-酰基]-胺类化合物i
1~4
。
[0020]
其中r2为：，，，。
[0021]
2、aa-1经重铬酸钾氧化，将c-11位亚甲基氧化为羰基得到2α，3β，23-三乙酰氧基-11-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-2），在此合成基础上，将aa-2与草酰氯反应后，进一步与相应胺反应生成目标化合物n-[2α，3β，23-三乙酰氧基-11-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰基]-胺类化合物i
5~8
。
[0022]
其中r2为：，，，。
[0023]
3、积雪草酸（aa）以对甲苯磺酸为催化剂，将a环c-3、c-23位羟基与2,2-二甲基丙烷进行缩环反应生成2,2-二甲基-1,3-二氧六环化合物，即2α-羟基-3β, 23-o-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-3），aa-3经负载硅胶的pdc氧化，将c-2位羟基氧化为羰基，反应生成2-羰基-3β，23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-4），aa-4与盐酸羟胺在吡啶中加热回流，反应生成2-肟基-3β，23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸（aa-5），将aa-5与草酰氯反应后，进一步与相应的胺反应得到目标化合物n-[ 2-肟基-3，23-o-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)]-胺类化合物ii
1~4
。
[0024]
其中r4为：，，，。
[0025] 4、将aa-5溶于四氢呋喃中，以dmap为催化剂，吡啶为缚酸剂，与乙酸酐反应生成2-乙酰氧亚氨基-3β,23-o-异亚丙基-12-烯-28-羧酸（aa-6），在碳酸钾作碱性条件下，将aa-6与相应卤代烷反应，将c-28位羧酸成酯得到2-乙酰氧亚氨基-3β,23-o-异亚丙基-12-烯-28-羧酸酯类化合物ii
5~10
。
[0026]
其中r4为：，，，，，。
[0027]
5、积雪草酸（aa）经负载硅胶的pdc氧化，将a环c-2、c-3、c-23位羟基氧化为羰基，反应生成2, 3, 23-三羰基-乌苏烷-12-烯-28羧酸（aa-7），将aa-7以无水mgso4为干燥剂，缓慢滴加乙二胺，将c-2、c-3位骈合氢化吡嗪环，生成2, 3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-8），在此基础上，以碳酸钾为缚酸剂将aa-8与相应的卤代烷反应制得化合物2, 3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸酯类化合物iii
1~4
。
[0028]
其中r5为：，，，。
[0029]
6、aa-7以无水mgso4为催化剂，在无水乙醇中缓慢滴加邻苯二胺，将c-2、c-3位骈合喹喔啉环，制得2, 3-并喹喔啉环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸（aa-9），在碳酸钾碱性条件下将aa-9与相应卤代烷反应，将c-28位羧基成酯得到2, 3-并喹喔啉环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸酯类化合物iv
1~4
。
[0030]
其中r6为：，，，以吉非替尼（gefitinib），依托泊苷（vp-16）为阳性对照，采取mtt法，对积雪草酸及其所合成i类化合物进行初步的体外抗肿瘤活性检测。研究表明所合成的化合物对人宫颈癌细胞（hela）人肝癌细胞（hepg2）和人胃癌细胞（bcg-823）具有一定的抑制作用，化合物结构以及体外实验结果如下表：结构以及体外实验结果如下表：注：化合物浓度为 10-5 mol /l，经过72 h处理后的细胞抑制率。 nt：未测。
[0031]
以人宫颈癌细胞（hela），人肝癌细胞（hepg2）和人胃癌细胞（bcg-823）为靶细胞，采用mtt法，对合成的积雪草酸衍生物进行药理活性测试，结果表明，合成的化合物对三种癌细胞均具有一定的抑制作用，且明显优于母体化合物积雪草酸，其中i4、i6、i7具有较好的抑制活性，优于吉非替尼和vp-16。这表明c-28位引入酰胺基团，c-2、c-3、c-23位羟基乙酰化，c-11位亚甲基氧化成羰基，能够提高积雪草酸的抗肿瘤活性。
[0032]
以紫杉醇（paclitaxe），阿霉素（adriamycin）为阳性对照，采取mtt法，对积雪草酸及其所合成ii类化合物进行初步的体外抗肿瘤活性检测。研究表明所合成的化合物对人胃
癌细胞（sgc7901）和人肺癌细胞（a549）具有一定的抑制作用，化合物结构以及体外实验结果如下表：果如下表：注：化合物浓度为 50 μg
·
ml
－1
，经过 72 h 处理后的细胞抑制率。
[0033]
以人胃癌细胞（sgc7901）和人肺癌细胞（a549）为靶细胞，采用mtt法，对合成的积雪草酸衍生物进行生物活性测试，结果表明，合成的化合物对这两种癌细胞均具有一定的抑制作用，且明显优于母体化合物积雪草酸，其中化合物ii3、ii4对sgc7901和a549细胞表现出较好的抑制活性。因此，将积雪草酸的c-28位羧酸成胺，c-2位羟基成肟，c-3、c-23位羟基成环可以提高其抗肿瘤活性。
[0034]
以吉非替尼（gefitinib）和阿霉素（adriamycin）为阳性对照，采取mtt法，对积雪草酸及其所合成ii类化合物进行初步的体外抗肿瘤活性检测。研究表明所合成的化合物对人胃癌细胞（sgc7901）和肺癌细胞（a549）具有一定的抑制作用，化合物结构以及体外实验结果如下表：
注：化合物浓度为10
µ
g/ml,经过48小时处理后的细胞抑制率。
[0035]
以人胃癌细胞（sgc7901）和人肺癌细胞（a549）为靶细胞，采用mtt法，对合成的积雪草酸衍生物进行生物活性测试，结果表明，合成的化合物对这两种癌细胞均具有一定的抑制作用，且明显优于母体化合物积雪草酸，其中化合物抗肿瘤活性ii
10
》ii8》ii9》ii7》ii6》ii5，在实验范围内，酯链越长，抗肿瘤活性越高，这说明c-28位羧酸成酯对其抗肿瘤活性有一定影响；化合物ii8和ii
10
对肿瘤细胞抑制活性较好，且优于阳性对照药吉非替尼，这表明将c-2位肟基改造为乙酰氧亚氨基，同时c-3、c-23位羟基成环可以提高积雪草酸的抗肿瘤活性。
[0036]
以吉非替尼（gefitinib）和阿霉素（adriamycin）为阳性对照，采取mtt法，对积雪草酸及其所合成iii、iv类化合物进行初步的体外抗肿瘤活性检测。研究表明所合成的化合物对人肝癌细胞（hepg2），人胃癌细胞（sgc7901）具有一定的抑制作用，化合物结构以及体外实验结果如下表：
注：化合物浓度为10
µ
g/ml,经过48小时处理后的细胞抑制率。
[0037]
以人肝癌细胞（hepg2）和人胃癌细胞（sgc7901）为靶细胞，采用mtt法，对合成的积雪草酸衍生物进行生物活性测试，结果表明，合成的化合物对这两种癌细胞均具有一定的抑制作用，且优于母体化合物积雪草酸，其中化合物iv4表现出良好的抗肿瘤活性，显著优于阳性对照药物吉非替尼，与阿霉素相当；对其构效关系研究发现，iii
1~4
，iv
1~4
系列中化合物的活性iii4》iii3》iii2》iii1，iv4》iv3》iv2》iv1，表明随着c-28位酯链增长抗肿瘤活性也随之增强，并且当积雪草酸a环骈入含氮杂环，同时对c-28羧基成酯，均可以提高积雪草酸的抗肿瘤活性。
[0038]
实施例1n-[2α,3β,23-三乙酰氧基-11-羰基-12-烯-28-酰基]-1-氨基-4-甲基哌嗪（i5）的制备将起始原料aa（100mg，0.20mmol）溶于10ml四氢呋喃中，加入吡啶2ml，乙酸酐（613mg，6.0mmol），n，n-二甲氨基吡啶(dmap)(15.0mg，0.12mmol)，室温下搅拌12h，tlc监测反应终点。反应结束后，减压回收溶剂，加水分散固体，加稀盐酸（1mol/l）调ph至3~4，静置析晶，抽滤，滤饼水洗至中性，自然干燥，得白色固体120mg。粗品采用湿法上柱，经硅胶柱色
谱纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，得白色粉末状固体（aa-1）105mg，产率:83.7%。
[0039]
将aa-1(50.0mg，0.080mmol)溶于6ml冰醋酸中，滴加k2cr2o7（75.0mg0.25mmol)，60℃加热回流2h，tlc检测反应终点。反应完成后冷却至室温，加入二氯甲烷稀释，用饱和nahco3水溶液洗涤（50ml
×
3）。合并有机相，无水mgso4干燥，抽滤，减压回收溶剂，粗品采用干法上柱，经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，得白色晶体（aa-2）41.6mg，产率:81.4%。
[0040]
将100mg(0.16mmol)aa-2溶于5ml二氯甲烷中，缓慢滴加0.64ml草酰氯，室温搅拌24h，tlc检测反应终点，反应结束后，减压回收溶剂，得到化合物aa-3。将aa-3溶于3ml二氯甲烷中，滴加三乙胺，调至ph至8～9，加入740mg(0.64mmol)1-氨基-4-甲基哌嗪，室温搅拌12h，tlc检测反应终点。反应完毕后，加乙酸乙酯稀释，用2mol/l稀盐酸调ph至3～4，饱和氯化钠水溶液洗涤（50ml
×
3），合并有机相，无水mgso4干燥，过滤，减压回收溶剂，粗品采用干法上柱，经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1，得白色粉末状固体（i5）72.0mg，产率62.0%。m.p.230.0～231.2℃。1h-nmr(600mhz,dmso-d6),7.62(s,1h,nh),5.65(s,1h,h-12),5.25～5.03(m,2h,h-2/3),3.87(d,j=11.7hz,1h,h-23a),3.83(d,j=11.7hz,1h,h-23b),3.60(t,j=12.0hz,4h,ncha2×
2),3.25(t,j=12.0hz,4h,nchb2×
2),2.38(s,3h,nch3),2.10,2.02,1.95(s,9h,ch3co
×
3),0.98(d,j=5.7hz,3h,ch3),0.96,0.91,0.87(s,each3h,-ch3)。
[0041]
实施例2 2-乙酰氧亚氨基-3β,23-o-异亚丙基-12-烯-28-乙酯（ii5）的制备将aa（100mg，0.19mmol）溶于20ml dmf中，加入对甲基苯磺酸（17.0mg，0.10mmol），滴加2，2-二甲氧基丙烷（0.5ml，2.0mmol），25℃下反应6h，tlc检测反应终点，加5%naoh溶液调节ph至中性，加二氯甲烷稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），合并有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压回收溶剂，得白色固体(aa-3)75.2mg，收率为75.2%。
[0042]
将pdc（432mg）和1g的柱层析硅胶充分溶解在二氯甲烷溶液中，用磁力搅拌器搅拌2h，得到负载硅胶的pdc悬浊液。将aa-3（100mg，0.19mmol）溶于二氯甲烷中，缓慢滴加到负载硅胶的pdc悬浊液中，25℃下反应2h，tlc检测终点。反应完成后，抽滤，所得滤液用硅藻土吸附直至变为淡黄色溶液，减压回收二氯甲烷，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），合并有机层，无水硫酸钠干燥，抽滤，回收溶剂，得淡黄色粉末(aa-4)73.4mg，收率为73.4%。
[0043]
将化合物aa-4(100mg，0.19mmol)溶于吡啶中，加入盐酸羟胺(15mg，0.22mmol)，升温至115℃回流，tlc检测终点。反应完成后，加入20ml冰水，搅拌至析出白色晶体，放入冰箱冷却过夜，抽滤，用水洗涤滤饼至中性，干燥滤饼得白色固体(aa-5)80.3mg，收率为80.3%。
[0044]
将aa-5(100mg，0.18mmol）溶于四氢呋喃中，加入dmap（0.01g），缓慢滴加乙酸酐（0.340g，3.3mmol），25℃下反应6h，tcl检测反应终点。反应完成后，减压回收溶剂，加入3ml蒸馏水，产生白色固体，加2m盐酸调节ph值至3~4，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，得白色固体(aa-6)82.3mg，收率为82.3%。
[0045]
将aa-6(100mg，0.17mmol）溶于（50ml）dmf中，加入无水碳酸钾（70mg），溴乙烷（0.2ml），25℃下反应6h，tlc检测反应终点。加乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），合并有机层，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压回收溶剂，粗品采用干法上柱，经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为pe:etoac=30:1（v:v），得白色固体（ii5）26.1mg，收率为26.1%，m.p.203.4~
206.1℃。1h-nmr(400mhz,cdcl3),δ:5.24(t,1h,h-12),4.05(m,2h,cooch2),3.75(d,2h,j=11.3hz,h-23),3.30(d,1h,j=9.5hz,h-23),2.06(s,3h,coch3),1.71-1.64(m,3h,cooch2ch3),1.07(d,6h,j=8.9hz,ch3×
2),0.94(d,3h,ch3),0.89(s,3h,ch3),0.84(s,3h,ch3),0.78(s,3h,ch3)。
[0046]
实施例32, 3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-乙酯(iv1)的制备将aa（100mg，0.2mmol）溶于dcm（10ml）中，缓慢加入负载硅胶的pdc（450mg，1.2mmol），室温下反应2h，tlc监测反应终点，反应完成后，减压抽滤除去硅胶，滤液用乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），合并有机相，无水mgso4干燥，抽滤，减压回收溶剂，粗品采用干法上柱，经硅胶柱色谱纯化（洗脱剂：pe:etoac=10：1），得到白色粉末状固体（aa-7）75.3mg，产率71.5%，m.p.242.1-243.4
°
c。
[0047]
将aa-7（100mg，0.2mmol）溶于10ml乙醚中，加入少量无水mgso4，缓慢滴加乙二胺（0.04ml），60
°
c下回流反应8h，tlc检测反应终点，反应结束后，减压回收溶剂，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压回收溶剂，粗品采用干法上柱，经硅胶柱色谱纯化(洗脱剂:pe:etoac=10：1)，得到白色粉末状固体（aa-8）65.3mg，产率69.2%，m.p.182.4~184.7℃。
[0048]
将化合物aa-8(100mg，0.19mmol)溶于dmf（10ml）中，加入无水k2co3（70mg）和溴乙烷（0.15ml），室温下搅拌6h，tlc监测反应终点，加乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤（50ml
×
3），收集有机层，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压回收溶剂，粗品采用湿法上柱，经硅胶柱色谱纯化（洗脱剂：pe:etoac=10:1），得到白色粉末状固体（iv1）32.2mg，产率为53.2%，m.p.186.0-187.9
˚
c。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ:9.75(s,1h,h-23),5.33(s,1h,h-12),4.04(t,j=7.4hz,3h,cooch2ch3),2.35~1.45(m,4h,nc2h4n),1.72-1.50(m,2h,cooch2ch3),1.15(s,3h,ch3),1.02(s,3h,ch3),0.93(s,3h,ch3),0.91(s,3h,ch3),0.73(d,j=9.0hz,6h,ch3×
2)。