瓜蒌斑驳花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种烟草花叶病毒属新病毒，瓜蒌斑驳花叶病毒(trichosanthes mottle mosaic virus，trmmv)及其侵染性克隆载体、构建和应用。


背景技术：

2.瓜蒌是我国重要的中药材，瓜蒌的果实、果皮、种子和根等几乎所有部位都具有药理活性。在临床治疗中，瓜蒌在胸腔梗阻、心绞痛、心力衰竭、心肌梗死、肺心病、脑缺血等疾病的治疗中具有重要作用。此外，现代药理试验也证实了其在抗肿瘤、抗氧化、神经保护、降血脂、减轻肾脏损伤等方面的药理作用。随着栽培规模的扩大，瓜蒌易受到多种病虫害的危害，前期研究表明瓜蒌可受瓜类温和花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)和瓜蒌相关弹状病毒(trichosanthes associated rhabdovirus 1，trarv1)的侵染。
3.植物病毒的侵染性cdna克隆是研究rna病毒致病性极为有力的工具，也是研究这些病原的反向遗传学基础。植物病毒的侵染性克隆易于操作，被广泛用于病毒的侵染机理、基因功能，以及病毒与宿主的相互作用等研究。目前已有一系列植物病毒侵染性克隆的方法，受植物病毒特性影响，所选择的构建策略也有所差异。在构建策略方面，有体外转录法(利用t3，t7或sp6启动子(噬菌体的rna聚合酶)体外转录)和体内转录法(通过花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子实现体内转录)的构建方法；部分病毒具有保守的表达特性，需要准确、完整的序列才能实现表达；而在序列扩增、重组转化过程中的碱基突变、片段缺失等都会对结果造成影响。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供一种瓜蒌斑驳花叶病毒。发明人研究团队通过小rna测序，从产生花叶、斑驳症状的瓜蒌叶片中鉴定出一种烟草花叶病毒属的新病毒，结合病毒的全基因组特征，将其暂命名为瓜蒌斑驳花叶病毒(trichosanthes mottle mosaic virus，trmmv)，由于该新病毒的未知性和其对瓜蒌的潜在威胁，需要加强对该病毒的研究。
5.本发明的第二目的是提供一种瓜蒌斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本发明基于对一个侵染瓜蒌的全新病毒进行基因组获得，在基因重组、片段插入、质粒转化等方面进行了优化，最终获得在植物中高效表达的病毒侵染性克隆载体。
6.本发明在获得瓜蒌斑驳花叶病毒基因组全序列的基础上，构建了该病毒的侵染性克隆，瓜蒌斑驳花叶病毒的全长cdna序列插入到含有35s启动子的植物双元表达载体pcb301中，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
8.一种瓜蒌斑驳花叶病毒，其微生物保藏编号为cgmcc no：21930。其序列如seq id no:15所示。
9.基于上述瓜蒌斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体，由瓜蒌斑驳花叶病毒trmmv全序列融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。
10.该瓜蒌斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，包括以下的步骤：
11.(1)获得瓜蒌斑驳花叶病毒trmmv全基因组序列﹔
12.(2)设计引物trmmv-insert1f、trmmv-insert1r、trmmv-insert2f、trmmv-insert2r；以受病毒侵染的瓜蒌cdna为模板，分别以引物对trmmv-insert1f/trmmv-insert1r和引物对trmmv-insert2f/trmmv-insert2r分两段扩增trmmv核苷酸全序列(trmmv-insert1和trmmv-insert2)；
13.所述引物trmmv-insert1f、trmmv-insert1r、trmmv-insert2f、trmmv-insert2r的基因序列分别如seq id no：1-4所示；
14.(3)选用stui和bamhi双酶切pcb301载体，产物与步骤(2)获得的扩增片段trmmv-insert1和trmmv-insert2进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选插入目的片段的阳性单克隆，进一步测序验证从而获得具有正确trmmv基因组核苷酸全序列插入的克隆；
15.(4)提取包含trmmv全长质粒的克隆，获得瓜蒌斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体pcb301-trmmv。
16.其中，所述步骤(1)具体包括：
17.1.1)对产生花叶、斑驳、褪绿等疑似受病毒侵染的瓜蒌植物病叶提取总rna，将样品进行小rna测序；
18.1.2)trmmv近全长序列的扩增：根据小rna测序结果组装的contigs，结合近缘病毒zgmmv的保守序列，设计具有重叠区域的三对引物gl1f/gl1r，gl2f/gl2r，gl3f/gl3r(如seq id no：5-10所示)，以瓜蒌病叶rna反转录的cdna为模板进行pcr扩增，扩增产物经胶回收纯化，连接到peasy-blunt载体，转化到大肠杆菌细胞中提取质粒测序，序列拼接后获得trmmv的近全长核苷酸序列。其对应的是全长序列第39到第6524个核苷酸的位置。
19.1.3)race：根据获得的trmmv近全长核苷酸序列，设计引物5’race-gsp1、3’race-gsp2、5’race-ngsp3、3’race-ngsp4，如seq id no：11-14所示；通过5’和3’race反应扩增后，产物连接到prace载体，进而转化到大肠杆菌细胞中提取质粒测序，5’和3’测序结果与步骤1.2)所得序列拼接获得trmmv全序列。
20.其中，所述步骤1.2)中的pcr扩增体系为：10μl 5
×
transstart fastpfu buffer、4μl 2.5mm dntps、上下游引物10μm各1μl、1μl cdna模板、1μl transstart fastpfu dna polymerase，32μl ddh2o，总反应体系为50μl；各片段的反应条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，35个循环；72℃8min。
21.其中，所述步骤(3)中提取的pcb301载体质粒为50ng/μl，pcb301载体的双酶切体系为：pcb301质粒40μl,10
×
fastdigest buffer 5μl,fastdigest stui和bamhi各2μl，ddh2o1μl；酶切反应条件为37℃30min，85℃5s：
22.其中，所述步骤(3)中重组反应采用20μl反应体系，其中经stui和bamhi双酶切线性化克隆载体pcb301 50ng左右，片段trmmv-insert1和片段trmmv-insert2各70ng左右，5
×
ceⅱbuffer 4μl，exnaseⅱ2μl，ddh2o补足体系至20μl。重组反应条件为37℃30min。
23.其中，所述步骤(4)中插入pcb301-trmmv质粒大肠杆菌的培养条件为，37℃
240rpm、避光培养16h。
24.一种携带瓜蒌斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，由上述的瓜蒌斑驳花叶病毒侵染性克隆载体经电击转化法导入到农杆菌菌株eha105获得。
25.本发明上述的侵染性克隆载体及农杆菌菌株可以用于瓜蒌斑驳花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
26.同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
27.(1)本发明获得了一种烟草花叶病毒属的新病毒——瓜蒌斑驳花叶病毒，并准确获得了瓜蒌斑驳花叶病毒的全基因组，将瓜蒌斑驳花叶病毒的全长cdna转入高效植物表达载体pcb301上，避免插入突变和碱基缺失，获得的重组载体经电击高效转化到农杆菌中，使其具备了有效的侵染能力。本发明为研究瓜蒌斑驳花叶病毒的基因组结构、功能、侵染机理及植物与病毒的相互作用等研究提供了成熟的体系。
28.(2)本发明提供的农杆菌菌株可以大量产生瓜蒌斑驳花叶病毒的侵染性克隆。
29.(3)采用本发明提供的侵染性克隆载体能高效侵染模式植物本氏烟、药用植物瓜蒌和多种葫芦科作物，易于操作、重复性好。
30.(4)利用本发明提供的侵染性克隆载体可有效用于瓜蒌斑驳花叶病毒的致病性分析。
31.下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的瓜蒌斑驳花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
32.图1为侵染性克隆载体pcb301-trmmv构建示意图；
33.图2为trmmv农杆菌接种本氏烟、瓜蒌的症状表现及病毒检测结果；
34.其中，a：pcb301空载体模拟接种的健康本氏烟对照；a：pcb301-trmmv接种本氏烟14天后症状；
35.b：trmmv及对照接种本氏烟的rt-pcr检测结果，其中，m：dna marker；
36.c:pcb301空载体模拟接种的瓜蒌无毒苗对照；c：pcb301-trmmv接种瓜蒌17天的症状；
37.d：trmmv及对照接种瓜蒌的rt-pcr检测结果，其中，m：dna marker。
38.生物保藏说明
39.瓜蒌斑驳花叶病毒(trmmv)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏机构简称：cgmcc，保藏日期为2021年11月25日，生物保藏编号为cgmcc no：21930，命名：trmmv-qs-1。
具体实施方式
40.本发明所提供的实施例如无特殊说明，则均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。
41.表1 trmmv全序列扩增及载体构建引物
race-ngsp4，通过5’和3’race反应扩增后，产物连接到prace载体，进而转化到大肠杆菌细胞中提取质粒测序，5’和3’测序结果与病毒近全长序列拼接获得长度为6524nt的trmmv全基因组序列。
49.实施例2瓜蒌斑驳花叶病毒侵染性克隆pcb301-trmmv的构建
50.根据实施例1获得的全序列，设计引物trmmv-insert1f、trmmv-insert1r、trmmv-insert2f、trmmv-insert2r；以实施例1中合成的cdna为模板，分别以引物对trmmv-insert1f/trmmv-insert1r和引物对trmmv-insert2f/trmmv-insert2r进行扩增，获得片段trmmv-insert1和trmmv-insert2。采用ii one step cloning kit重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)将纯化的扩增目的片段与经stui和bamhi双酶切的pcb301载体进行重组，采用20μl体系反应，其中5
×
ceⅱbuffer 4μl，stui和bamhi双酶切线性化克隆载体pcb301 50ng，trmmv-insert1和片段trmmv-insert2各70ng，5
×
ceⅱbuffer 4μl，exnaseⅱ2μl，ddh2o补足体系至20μl。重组反应条件为37℃30min。将连接产物转入大肠杆菌，用trmmv-insert1f/trmmv-insert1r和trmmv-insert2f/trmmv-insert2r引物对克隆进行检测，筛选两个插入片段都为阳性的克隆进行测序，验证插入正确的克隆(命名为pcb301-trmmv)在摇床培养16h，培养条件为37℃240rpm。提取pcb301-trmmv质粒，取200ng pcb301-trmmv质粒加入100ul eha105农杆菌感受态中，通过电击转化法将质粒转入到农杆菌菌株eha105中，获得具有侵染能力的pcb301-trmmv(eha105)菌株。
51.实施例3pcb301-trmmv侵染性克隆接种
52.挑取电击转化的pcb301-trmmv(eha105)单菌落接种于含有卡那霉素(50mg/l)和利福平(50mg/l)抗性的lb培养基中28℃240rpm振荡培养至od600为0.5-0.7；然后经4000rpm离心10min收集菌体；用浸润buffer(终浓度为10mm mgcl2，10mm mes(ph 5.6)，200μm乙酰丁香酮(ace))重悬，调整菌液浓度至od600为1.0；在室温下避光放置2～3小时。用无针头的1ml注射器将约400μl的菌悬液浸润到生长三周的瓜蒌上部两叶背面。以4周龄本氏烟为试材，将3片完全展开的上部叶片进行浸润。对于5种葫芦科植物(甜瓜、黄瓜、西瓜、丝瓜和西葫芦)，用无针注射器浸透完全膨大的子叶。将植株置于25℃的生长室内进行培养，光周期为14:10h。
53.实施例4pcb301-trmmv侵染性克隆的侵染性测定
54.对接种后的本氏烟和瓜蒌进行症状观察。症状观察表明，pcb301-trmmv农杆菌浸润接种本氏烟10天后新生叶出现明显顶叶下卷、褪绿、斑驳等症状(图2a)，rt-pcr结果证明了症状样品中trmmv的存在(图2b)。接种17天后瓜蒌新生叶出现花叶、斑驳、褪绿等症状(图2c)；rt-pcr结果表明症状样品中trmmv的存在(图2d)。
55.上述结果表明：构建的pcb301-trmmv侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染本氏烟、和瓜蒌。
56.以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。