用于治疗杜氏肌营养不良的抗FLT-1抗体的制作方法

用于治疗杜氏肌营养不良的抗flt-1抗体
1.本技术是申请号为201680032814.0、申请日为2016年4月7日、 发明名称为“用于治疗杜氏肌营养不良的抗flt-1抗体”的中国发明专 利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/us2016/026352的 pct国际申请的中国国家阶段申请，该pct国际申请分别要求2015 年4月7日、2016年3月14日提交的美国临时申请序列号62/144,251 和62/307,645的优先权。
2.相关申请
3.本技术要求2015年4月7日提交的美国临时申请序列号 62/144,251和2016年3月14日提交的美国临时申请序列号62/307,645 的优先权，所述临时申请各自的公开内容特此以引用的方式并入。
4.背景
5.杜氏肌营养不良(dmd)是一种x连锁隐性病症，其影响估计 1:3600男性出生者，估计全世界有50,000名受影响的个体。所述病 症的特征是肌肉的进行性消耗，并且受影响的儿童到他们13岁时依 赖轮椅。受影响的个体通常在3岁时出现症状，其中此类个体的中值 存活期介于25与30岁之间。由于膈肌无力和心肌病所致的呼吸衰竭 是死亡的常见原因。
6.dmd是由肌营养不良蛋白基因中的突变引起的。肌营养不良蛋 白基因位于x染色体上并且编码蛋白质肌营养不良蛋白。肌营养不 良蛋白负责通过肌营养不良蛋白聚糖复合物将肌肉纤维的收缩机制 (肌动蛋白-肌球蛋白复合物)连接至周围的细胞外基质。肌营养不良蛋 白基因的突变导致肌营养不良蛋白的改变或不存在以及异常肌膜(sarcolemal membrane)功能。虽然男性和女性均可携带肌营养不良蛋 白基因的突变，但女性很少受dmd的影响。
7.dmd的一个特征是受影响组织的局部缺血。局部缺血是对组织 或器官的供血的限制或减少，从而导致用于细胞代谢的氧和营养物需 要的不足。局部缺血通常由血管的收缩或阻塞引起，从而导致对组织 或器官的损伤或组织或器官的功能障碍。局部缺血的治疗旨在增加到 受影响的组织或器官的血流量。
8.目前，尚无法治愈dmd。已经研究了若干治疗途径，包括基因 疗法和皮质类固醇施用，然而仍然需要用于dmd患者的替代物。
9.发明概述
10.本发明尤其提供了用于基于抗flt-1抗体疗法治疗肌营养不良、 具体地说杜氏肌营养不良(dmd)和/或贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy)的改进的方法和组合物。如下文实施例中所描述， 本发明部分基于以下发现：抗flt-1抗体或其抗原结合片段能够抑制 vegf和其他配体结合至flt-1受体，从而增加可用于结合至vegf 受体的vegf和/或其他配体的量。增加vegf的可用性促进血管生 成，伴随到肌肉的血流量增加以对抗功能性局部缺血并产生dmd的 结构和功能特征的改善。实际上，如本发明实施例中所示，本发明人 已经证明，施用抗flt-1抗体改善了肌肉病理的测量值(例如，改善的 血管生成、减少的纤维化、减少的坏死)。因此，本发明提供用于治 疗dmd的安全且有效的基于抗体的治疗剂。
11.一方面，本发明提供特异性地结合至人flt-1的抗体或其抗原结 合片段，所述抗
id no:9和seq id no:17的 氨基酸序列定义的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在一个具体 实施方案中，所述vh链包含分别由seq id no:3、seq id no:12 和seq id no:17的氨基酸序列定义的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3。
15.另一方面，本发明提供特异性地结合至人flt-1的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)轻链可变(vl)区，其 包含与seq id no:49至seq id no:61中的任一个具有至少80％同 一性的氨基酸序列；和/或(ii)重链可变(vh)区，其包含与seq idno:35至seq id no:48中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序 列。在一个具体实施方案中，所述vl区包含seq id no:60的氨基 酸序列，并且所述vh区包含seq id no:45的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定 区包含与seq id no:87至seq id no:89中的任一个具有至少80％ 同一性的氨基酸序列。
17.另一方面，本发明提供特异性地结合至人flt-1的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)轻链，其包含与seqid no:75至seq id no:86中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸 序列；和/或(ii)重链，其包含与seq id no:62至seq id no:74中的 任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中， 所述轻链包含seq id no:76的氨基酸序列，并且所述重链包含seqid no:71的氨基酸序列。
18.在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组 成的组：igg、f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、scfv、双抗体(diabody)、 三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。在一个实施方案中，所述抗体 或其抗原结合片段是igg。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原 结合片段是igg1。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片 段是单克隆抗体。在一个具体实施方案中，所述抗体是人源化单克隆 抗体。在另一个实施方案中，所述人源化单克隆抗体含有人fc区。 在一些实施方案中，fc区含有增强fc区与fcrn受体之间的结合亲 和力以使得抗体的体内半衰期延长的一个或多个突变。在另一个实施 方案中，所述fc区含有在对应于人igg1的leu 234、leu 235和/或 gly 237的位置处的一个或多个突变。
19.在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不结合至vegfr2和/或vegf r3。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片 段不结合至小鼠或猴flt-1。
20.另一方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其识 别包含以下氨基酸序列的肽或其片段，所述氨基酸序列对应于seqid no:90的位置139至148、位置139至153、位置178至206、位 置199至204以及位置128至138。在一个实施方案中，所述肽由以 下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于seq id no:90的位置130 至138、位置141至148、位置141至153和位置193至206。
21.另一方面，本发明提供一种与任何抗flt-1抗体或其抗原结合片 段竞争的分离的抗体或其抗原结合片段。
22.另一方面，本发明提供包含抗flt-1抗体或其抗原结合片段和药 学上可接受的载体的药物组合物。
23.另一方面，本发明提供编码本发明的抗体或其抗原结合片段的 cdr、vl区、vh区、轻链和/或重链的多核苷酸。在一个实施方案 中，本发明提供包含所述多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案中， 本发明提供一种包含所述多核苷酸或所述表达载体的宿主细
胞。在一 个具体实施方案中，本发明提供制备特异性地结合至人flt-1的抗体 或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。在另一 个实施方案中，杂交瘤细胞产生所述抗体或其抗原结合片段。
24.另一方面，本发明提供用于治疗flt-1介导的疾病、病症或病状 的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用抗flt-1抗体或其抗 原结合片段。在一个具体实施方案中，所述flt-1介导的疾病、病症 或病状是杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、支气管肺发育不良、先 兆子痫或慢性肾病。
25.另一方面，所述方法提供治疗杜氏肌营养不良(dmd)的方法，所 述方法包括向患有或易患dmd的受试者施用有效量的抗flt-1抗体 或其抗原结合片段，以使得dmd的至少一种症状或特征在强度、严 重程度或频率方面降低或延迟发作。在一个实施方案中，所述方法还 包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一个具体实施方 案中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：泼尼松(prednisone)、 地夫可特(deflazacort)、卵泡抑素、rna调节治疗剂、外显子跳跃治 疗剂(exon-skippingtherapeutic)和基因疗法。
26.在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段经胃肠外施用。 在一些实施方案中，胃肠外施用选自静脉内、皮内、鞘内、吸入、经 皮(局部)、眼内、肌内、皮下和/或经粘膜施用。在一个具体实施方案 中，所述胃肠外施用是静脉内施用。在另一个实施方案中，所述胃肠 外施用是皮下施用。
27.在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段每日一次、每周 两次、每周一次或每月一次施用。在一个具体实施方案中，抗体或其 抗原结合片段每周两次施用。
28.在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的有效量是大 约1mg/kg至50mg/kg的剂量。在一个具体实施方案中，所述剂量是 大约1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg。
29.在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的施用产生相对 于对照，减少的纤维化和/或坏死。在另一个实施方案中，所述抗体 或其抗原结合片段的施用产生相对于对照，受试者的肌肉中的改善的 血管生成。在另一个实施方案中，所述改善的血管生成由肌肉病理上 的血流量增加、血清中的vegf水平增加、血清中的肌酸激酶(ck) 水平降低、通过ihc测得的增加的cd31分数和/或血清中的sflt-1 水平降低反映。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的 施用产生相对于对照改善的肌肉功能。在另一个实施方案中，所述改 善的肌肉功能由改善的肌力和/或抗疲劳性反映。
30.另一方面，本发明提供一种治疗组织纤维化的方法，所述方法包 括向需要治疗的受试者施用有效量的抗flt-1抗体或其抗原结合片 段。
31.附图简述
32.当连同附图一起阅读时，将从各个说明性实施方案的以下描述更 全面地理解本文所述的本教义。应理解，下文描述的附图仅是出于说 明目的，并且不意图以任何方式限制本教义的范围。
33.图1a示出描绘在以10mg/kg的剂量向小鼠静脉内施用抗flt-1 抗体13b4后所述抗体的清除的示例性结果。
34.图1b示出描绘在以10mg/kg的剂量向小鼠静脉内施用抗flt-1 抗体10g12后所述抗体的清除的示例性结果。
35.图2a示出描绘峰值血清抗flt-1抗体水平的示例性结果。图2b 示出描绘谷值血清
抗flt-1抗体水平的示例性结果。
36.图3示出描绘在向mdx小鼠施用抗flt-1抗体(13b4或10g12)、 同种型对照抗体、商业抗体(angio)或单独媒介物后，血清中的游离可 溶性flt-1(sflt-1)水平降低的示例性结果。
37.图4示出描绘在向mdx小鼠施用抗flt-1抗体(13b4或10g12)、 同种型对照抗体、商业抗体(angio)或单独媒介物后，血清vegf水 平增加的示例性结果。
38.图5a-5d示出从施用抗flt-1抗体(13b4或10g12)、同种型对照 抗体或商业抗体(angio)的mdx小鼠的膈肌获得的组织切片的cd31 染色的示例性结果。
39.图6a示出作为从膈肌获得的组织切片中的总染色面积的百分比 的cd31阳性面积的定量的示例性结果。图6b示出作为从胫骨前肌 (ta)肌肉获得的组织切片中的总染色面积的百分比的cd31阳性面积 的定量的示例性结果。
40.图6b示出作为从施用抗flt-1抗体的mdx小鼠的胫骨前肌(ta) 肌肉获得的组织切片中的总染色面积的百分比的cd31阳性面积的定 量的示例性结果。
41.图7示出描绘通过elisa测定抗flt-1抗体与重组sflt-1的结合 的示例性结果。
42.图8示出描绘在竞争elisa测定中通过抗flt-1抗体抑制sflt-1 与vegf的结合的示例性结果。
43.图9示出描绘通过抗flt-1抗体挽救vegf r2的磷酸化的示例性 结果。在sflt-1和抗flt-1抗体存在下用vegf处理人原代静脉内皮 细胞(huvec)并测定vegf r2磷酸化水平。挽救百分比指示相对于 用vegf和单独sflt-1(即，无抗flt-1抗体)处理huvec时的vegf r2 的磷酸化水平的vegf r2的磷酸化水平。
44.图10示出描绘在竞争elisa测定中通过抗flt-1抗体抑制可溶 性flt-1与vegf的结合的示例性结果。
45.图11示出在以10mg/kg的剂量向小鼠静脉内施用抗flt-1抗体 后的672小时内来自血清的抗flt-1抗体的清除的示例性结果。
46.图12a-12c示出来自膈肌的组织切片的cd31染色的示例性结 果。图12d-12f示出从胫骨前肌获得的组织切片的cd31染色的示例 性结果。
47.图13a-13c示出在施用抗flt-1抗体27h9、13b4和21b3后的 256小时的时间过程中，所述抗体在小鼠的膈肌、胫骨肌和腓肠肌中 的示例性生物分布。
48.图14a示出描绘在峰值暴露时的峰值抗flt-1抗体21b3水平的 示例性结果。图14b示出描绘谷值抗flt-1抗体21b3水平的示例性 结果。
49.图15示出描绘在向mdx小鼠施用抗flt-1抗体21b3后游离sflt-1 的示例性结果。
50.图16示出描绘在向mdx小鼠施用抗flt-1抗体21b3后vegf水 平的示例性结果。
51.图17a-17e示出从施用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体的 mdx小鼠的膈肌获得的组织切片的cd31染色的示例性结果。
52.图18示出从施用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体的mdx小 鼠的膈肌获得的组织切片中标准化的cd31阳性百分比的定量的示例 性结果。
53.图19a-19e示出从施用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体的 mdx小鼠的胫骨前肌获得的组织切片的cd31染色的示例性结果。
54.图20示出从施用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体的mdx小 鼠的胫骨前肌获得
的组织切片中标准化的cd31阳性百分比的定量的 示例性结果。
55.图21a示出用于测定去糖基化的21b3抗体的分子量的反相液相 色谱/质谱(rp-lc/ms)分析的示例性结果。图21b示出重链的糖基化 模式的分析的示例性结果。
56.图22a和22b示出描绘通过抗flt-1抗体挽救vegf r2的磷酸 化的示例性结果。在sflt-1和抗flt-1抗体存在下用vegf处理人原 代静脉内皮细胞(huvec)并测定vegf r2磷酸化水平。挽救百分比 指示相对于用vegf和单独sflt-1(即，无抗flt-1抗体)处理huvec 时的vegf r2的磷酸化水平的vegf r2的磷酸化水平。
57.图23示出描绘通过elisa测定抗flt-1抗体与重组sflt-1的结合 的示例性结果。
58.图24示出描绘mdx小鼠中游离抗flt-1抗体21b3和同种型对照 抗体的血清水平的示例性结果。
59.图25示出描绘用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体处理的mdx 小鼠中游离sflt-1的血清水平的示例性结果。
60.图26示出描绘用抗flt-1抗体21b3或同种型对照抗体处理的mdx 小鼠中vegf的血清水平的示例性结果。
61.图27a-27h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 (27a-27d)或12(27e-27h)周的mdx小鼠的膈肌获得的组织切片的 cd31染色的示例性结果。
62.图28a-28h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 周(28a-28d)或12周(28e-28h)的mdx小鼠的腓肠肌获得的组织切片 的cd31染色的示例性结果。
63.图29a-29h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 周(29a-29d)或12周(29e-29h)的mdx小鼠的胫骨肌获得的组织切片 的cd31染色的示例性结果。
64.图30a-30c示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照抗体持 续6周或12周的mdx小鼠的膈肌、腓肠肌和胫骨肌获得的组织切片 中cd31染色的阳性百分比的定量的示例性结果。
65.图31a-31h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 周(31a-31d)或12周(31e-31h)的mdx小鼠的膈肌获得的组织切片的 i型胶原蛋白免疫组织化学染色的示例性结果。
66.图32a-32h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 周(32a-32d)或12周(32e-32h)的mdx小鼠的腓肠肌获得的组织切片 的i型胶原蛋白免疫组织化学染色的示例性结果。
67.图33a-33h示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照持续6 周(33a-33d)或12周(33e-33h)的mdx小鼠的胫骨肌获得的组织切片 的i型胶原蛋白免疫组织化学染色的示例性结果。
68.图34a-34c示出从施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照抗体持 续6周或12周的mdx小鼠的膈肌、腓肠肌和胫骨肌获得的组织切片 中i型胶原蛋白染色的阳性百分比的定量的示例性结果。
69.图35a和35b示出施用抗flt-1抗体21b3或媒介物对照抗体持 续6周或12周的mdx小鼠的腓肠肌的坏死百分比的示例性结果。
70.图36示出描绘比较单独人sflt-1的氢/氘交换与人sflt-1和抗 flt-1抗体(21b3)混合物的氢/氘交换的差示热图的示例性结果。灰色： 无氘保护；蓝色：在fab结合后的氘保
护。
71.图37示出描绘比较单独人sflt-1的氢/氘交换与人sflt-1和抗 flt-1抗体(21c6)混合物的氢/氘交换的差示热图的示例性结果。灰色： 无氘保护；蓝色：在fab结合后的氘保护。
72.图38a-38e示出描绘含有来自表位区域的氨基酸残基的鉴定的 肽的ms/ms光谱的示例性结果。
73.定义
74.为了更容易地理解本公开，以下首先对某些术语进行定义。对于 以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中列出。
75.亲和力：如本领域中所已知，“亲和力”是特定配体结合至其配偶 体的紧密性的度量。在一些实施方案中，所述配体或配偶体是flt-1。 在一些实施方案中，所述配体或配偶体是可溶性flt-1。在一些实施 方案中，所述配体或配偶体是重组flt-1。在一个具体实施方案中， 所述配体或配偶体是人sflt-1。在一个具体实施方案中，所述配体或 配偶体是重组sflt-1。在其他实施方案中，所述配体或配偶体是抗flt-1 抗体。亲和力可以不同方式来测量。在一些实施方案中，亲和力通过 定量测定来测量。在一些此类实施方案中，结合配偶体浓度可以被固 定为超过配体浓度，以便模拟生理条件。或者或另外，在一些实施方 案中，结合配偶体浓度和/或配体浓度可以改变。在一些此类实施方 案中，可以将亲和力与可比较条件(例如浓度)下的参考进行比较。
76.亲和力成熟(或亲和力成熟抗体)：如本文所用，术语“亲和力成熟
”ꢀ
或“亲和力成熟抗体”是指在其一个或多个cdr中具有一个或多个变 化的抗体，所述变化引起与不具有那些变化的亲本抗体相比，所述抗 体对抗原的亲和力提高。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体将对靶 抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟抗体可通过本领域 中已知的多种程序中的任一种产生。mark等，biotechnology 10:779-783(1992)描述通过vh和v
l
结构域改组进行亲和力成熟。对 cdr和/或框架残基的随机诱变由以下文献描述:barbas等，proc.nat. acad.sci.u.s.a.91:3809-3813(1994)；schier等，gene 169:147-155 (1995)；yelton等，j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等，j. immunol.154(7):3310-9(1995)；以及hawkins等，j.mol.biol. 226:889-896(1992)。
77.改善：如本文所用，术语“改善”是指预防、减轻或缓解受试者的 状态或所述状态的改善。改善包括但不要求疾病病状的完全恢复或完 全预防。
78.动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些 实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，
ꢀ“
动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人 动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、 绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不 限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。 在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和 /或克隆。
79.抗体：如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，不论天然 的或全部或部分合成产生的。维持特异性结合能力的其所有衍生物也 包括在所述术语中。所述术语也涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同 源或大部分同源的结合结构域的任何蛋白质。此类蛋白质可源于天然 来源或部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可 以是
任何免疫球蛋白同种型的成员，包括任何人同种型：igg、igm、 iga、igd和ige。在某些实施方案中，抗体可以是igg免疫球蛋白类 别的成员(例如，igg1、igg2、igg3等)。在一些实施方案中，抗体可 以是人抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人源化抗体。
80.如本领域普通技术人员所已知，在自然界中产生的抗体通常包含 四条多肽链，通过二硫键互连的两条重(h)链和两条轻链(l)链。每条 重链和轻链由可变区(分别在本文中缩写为hcvr、vh或vh和 lcvr、vl或v
l
)和恒定区组成。重链的恒定区包含ch1、ch2和ch3 结构域(以及任选地在igm和ige的情况下，ch4结构域)。轻链的恒 定区包含一个结构域，c
l
。vh和v
l
区还含有称为互补决定区(cdr) 的高变区，其间散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和 v
l
由三个cdr和四个fr组成，其按以下列顺序从氨基端排列至羧 基端：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链 的结合区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导 免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例 如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(c1q)。
81.抗原结合部分：如本文所用，术语“抗原结合部分”或“抗原结合 片段”是指抗体的保留特异性地结合至抗原(例如，flt-1)的能力的一个 或多个片段或部分。抗原结合部分的实例包括(i)fab片段，一种由 vh、v
l
、ch1和c
l
结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，一种包 含由二硫桥在铰链区连接的两个fab片段的双价片段；(iii)由vh和 ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vh和v
l
结构域组成的 fv片段；(v)包含单个可变结构域的dab片段(ward等，(1989)nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；(vii)fab'片段，其基本 上是具有铰链区的一部分的fab；(viii)纳米抗体，含有单个可变结构 域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构 域(vh和v
l
)由单独基因编码，但它们可使用重组方法由合成接头接 合，所述接头能够使它们制成其中vh和v
l
区配对以形成单价分子的 单一蛋白质链(称为单链fv(scfv)；参见例如bird等，(1988)science 242:423-426；和huston等，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85: 5879-5883)。抗体的抗原结合片段可任选地包括单链抗体片段。或者 或另外，抗体的抗原结合片段可包括例如通过二硫键连接在一起的多 个链。抗体的抗原结合片段可任选地包括多分子复合物。功能性抗体 片段通常包含至少约50个氨基酸，并且更通常包含至少约200个氨 基酸。
82.在一些实施方案中，抗体片段含有亲本抗体的足够序列，在所述 亲本抗体中所述抗体片段是与所述亲本抗体结合至相同抗原的片段； 在一些实施方案中，片段以与亲本抗体可比较的亲和力结合至所述抗 原和/或与亲本抗体竞争结合至所述抗原。
83.本领域技术人员将理解，术语“抗体片段”并不意味着并且不限于 任何特定的产生模式。可通过使用任何适当的方法产生抗体片段，包 括但不限于完整抗体的裂解、化学合成和重组产生。以与完整抗体相 同的方式筛选片段的效用。
84.大约或约:如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大 约”或“约”是指类似于所阐述的参考值的值。在某些实施方案中，术 语“大约”或“约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小 于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、 11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范 围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除 了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
85.与
……
关联：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另 一个事件或实体
的存在、水平和/或形式相关，则两个事件或实体彼 此“关联”，如所述术语在本文中所用。例如，如果特定实体(例如， 多肽)的存在、水平和/或形式与特定疾病、病症或/或病状的发生率和/或易感性相关(例如，跨相关群体)，则认为所述特定实体与所述疾病、 病症或病状关联。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或 间接地相互作用，则它们是彼此物理上“关联的”，以使得它们为且保 持彼此物理接近。在一些实施方案中，彼此物理上关联的两个或更多 个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此物理上关联的两个或 更多个实体不是彼此共价连接的，而是例如通过氢键、范德华相互作 用、疏水相互作用、磁性及其组合非共价缔合的。
86.载体或稀释剂:如本文所用，术语“载体”和“稀释剂”是指对制备 药物制剂有用的药学上可接受的(例如，对于向人施用来说安全且非 毒性的)载体或稀释性物质。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌注射用 水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林 格氏溶液或葡萄糖溶液。
87.cdr：如本文所用，是指抗体可变区内的互补决定区。在重链和 轻链的各可变区中存在三个cdr，其被指定为各可变区的cdr1、 cdr2和cdr3。“一组cdr”或“cdr组”是指在能够结合抗原的单个 可变区中存在的三个或六个cdr的组或能够结合抗原的同源重链和 轻链可变区的cdr。本领域中已经确立了用于限定cdr边界的某些 系统(例如，kabat、chothia等)；本领域的技术人员了解这些系统之 间的差异，并且能够在理解和实践所要求保护的发明所需的程度上理 解cdr边界。
88.嵌合抗体：如本文所用，是指其氨基酸序列包含在第一物种中发 现的vh和v
l
区序列以及在与第一物种不同的第二物种中发现的恒 定区序列的抗体。在许多实施方案中，嵌合抗体具有与人恒定区连接 的鼠vh和v
l
区。在一些实施方案中，具有与非人恒定区(例如，小 鼠恒定区)连接的人vh和v
l
区的抗体被称为“逆嵌合抗体”。
89.剂型：如本文所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患 者的治疗性蛋白(例如，抗体)的物理离散单位。每个单位含有经计算 产生所需治疗作用的预定量的活性物质。然而，将理解的是，组合物 的总剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。
90.功能障碍：如本文所用，术语“功能障碍”是指异常功能。分子(例 如，蛋白质)的功能障碍可由与这种分子相关的活性的增加或减少引 起。分子的功能障碍可由与分子本身或与与分子直接或间接相互作用 或调节分子的其他分子相关的缺陷引起。
91.表位：如本文所用，包括由免疫球蛋白(例如抗体、其抗体片段、 受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由 抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采用 相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施 方案中，当抗原采用这种构象时，此类化学原子或基团在空间中物理 上彼此接近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，线性 化)时，至少一些此类化学原子或基团彼此物理上分离。
92.fc区：如本文所用，术语“fc区”是指两个“fc多肽”的二聚体， 每个“fc多肽”包含抗体中排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的恒定 区。在一些实施方案中，“fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接 头或肽接头连接的两个fc多肽。“fc多肽”是指iga、igd和igg的 最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及ige和igm的最后三个恒定 区免疫球蛋白结构域，并且还可包含这些结构域的n末端的柔性铰 链的部分或全部。对于igg，“fc多肽”包含免疫
球蛋白结构域 cgamma2(cγ2)和cgamma3(cγ3)，以及cgamma1(cγ1)与cγ2之间 的铰链的下部。虽然fc多肽的边界可变化，但人igg重链fc多肽通 常被定义为包含起始于t223或c226或p230至其羧基末端的残基， 其中编号是根据kabat等，(1991,nih publication 91-3242,nationaltechnical information services,springfield,va)中的eu索引。对于 iga，fc多肽包含免疫球蛋白结构域calpha2(cα2)和calpha3(cα3)， 以及calpha1)(cα1)与cα2之间的铰链的下部。fc区可以是合成的、 重组的、或产生自天然来源如ivig。
93.框架或框架区：如本文所用，是指可变区减去cdr的序列。因 为cdr序列可通过不同的系统确定，所以框架序列同样受到相应的 不同解释。六个cdr也将重链和轻链上的框架区分成各链上的四个 子区域(fr1、fr2、fr3和fr4)，其中cdrl位于fr1与fr2之间， cdr2位于fr2与fr3之间，并且cdr3位于fr3与fr4之间。在 不将特定子区域指定为fr1、fr2、fr3或fr4的情况下，如其他所 提及的框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合 fr。如本文所用，fr表示四个子区域中的一个，fr1例如表示最靠 近可变区域的氨基末端和相对于cdr1的5'的第一框架区域，并且 frs表示构成框架区域的两个或更多个子区域。
94.半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如蛋白质浓度或活性的 量下降至其在一段时间开始时测量的值的一半所需的时间。
95.高亲和力：如本文所用，当提及igg型抗体时，术语“高亲和力
”ꢀ
是指对flt-1的结构域具有10-8
m或更小、更优选10-9
m或更小且甚 至更优选10-10
m或更小的kd的抗体。然而，对于其他抗体同种型，
ꢀ“
高亲和力”结合可发生变化。例如，对于igm同种型，“高亲和力
”ꢀ
结合是指具有10-7
m或更小、更优选10-8
m或更小、甚至更优选10-9 m或更小的kd的抗体。
96.人抗体:如本文所用，意图包括具有自人免疫球蛋白序列产生(或 组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，尽管抗体(或抗 体组分)的氨基酸序列包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或 元件(例如，包含例如可能(最初)已经通过体外随机或位点特异性诱变 或体内体细胞突变引入的序列变异)，例如在一个或多个cdr中且特 别是cdr3中，但是所述抗体(或抗体组分)可被认为是“人的”。
97.人单克隆抗体：如本文所用，意图是指具有可变区、展示单一结 合特异性的抗体，其中框架区和cdr区两者均来源于人种系免疫球 蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂 交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞，所述细 胞具有融合至永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
98.人源化：如本领域中所已知，术语“人源化”通常用于指其氨基酸 序列包含来自在非人物种(例如，小鼠、美洲驼)中产生的参考抗体的 vh和v
l
区序列的抗体(或抗体组分)，而且包括相对于参考抗体的那 些序列中的修饰，意图使它们更“类似于人”，即更类似于人种系可变 序列。在一些实施方案中，“人源化”抗体(或抗体组分)是免疫特异性 地结合至目标抗原并且拥有具有基本上如人抗体的氨基酸序列的氨 基酸序列的框架(fr)区和具有基本上如非人抗体(例如，小鼠、美洲 驼)的氨基酸序列的氨基酸序列的互补决定区(cdr)的抗体(或抗体组 分)。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域(fab、fab’、 f(ab’)2、fabc、fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有cdr区对 应于非人免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的那些cdr区且所有或 基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。在一些实 施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部
分， 通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化 抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包含重链恒定区 的ch1、铰链、ch2、ch3以及任选地ch4区。在一些实施方案中， 人源化抗体仅含有人源化v
l
区。在一些实施方案中，人源化抗体仅 含有人源化vh区。在一些特定实施方案中，人源化抗体含有人源化 vh和v
l
区。
99.肥大：如本文所用，术语“肥大”是指由于其组分细胞的增大所致 的器官或组织的体积增加。
100.改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少
”ꢀ
或语法等效物指示相对于基线测量值，如在开始本文所述治疗之前的 同一个体中的测量值，或不存在本文所述治疗时的对照个体(或多个 对照个体)中的测量值的值。“对照个体”是罹患与所治疗的个体相同 形式的疾病的个体，其与所治疗的个体年龄大致相同(以确保治疗的 个体的疾病阶段与对照个体相当)。
101.抑制：如本文所用，术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”和“抑 制(inhibiting)”是指减少或降低目标蛋白质或基因的活性和/或表达的 过程或方法。通常，抑制蛋白质或基因是指使蛋白质或基因的表达或 相关活性降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、 70％、80％、90％或更多，或表达或相关活性降低大于1倍、2倍、3 倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多，如通过本文描述或本 领域公认的一种或多种方法所测量。
102.体外：如本文所用，术语“体外”是指发生在人工环境中，例如试 管或反应容器中、细胞培养物等中、而不是多细胞生物体内的事件。
103.体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体，如人和非 人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的背景下，所述术语可用于 指在活细胞(与例如体外系统相反)内发生的事件。
104.分离的抗体：如本文所用，术语“分离的抗体”意图指基本上不含 具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性地结合至flt-1 的分离的抗体)。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或 化学品。
105.ka：如本文所用，是指具体抗体-抗原相互作用的缔合速率；而 如本文所用的术语“k
d”意图指具体抗体-抗原相互作用的解离速率。 如本文所用，术语“k
d”意图指解离常数，其获自kd与ka的比值(即， kd/ka)并且被表示为摩尔浓度(m)。抗体的kd值可使用本领域完善建 立的方法来确定。用于确定抗体的kd的优选方法是通过使用表面等 离子体共振，优选地使用生物传感器系统，如系统。
106.轻链改组：如本文所用，术语“轻链改组”意图指重链序列保持恒 定并产生轻链序列的文库的亲和力成熟步骤。针对重链筛选轻链文库 以鉴定具有提高的结合亲和力的抗体。提高的结合亲和力可在纳摩尔 或皮摩尔范围内。
107.单克隆抗体：如本文所用，术语“单克隆抗体”意图指单一分子组 成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位展现出单一结合 特异性和亲和力。
108.药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合 理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺 激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的物 质。
109.多肽：如本文所用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基 酸的连续链。所
述术语用来指具有任何长度的氨基酸链，但是本领域 普通技术人员将理解所述术语不限于冗长的链并且可指包含经由肽 键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所已知，多 肽可经加工和/或修饰。
110.预防：如本文所用，术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”在 与疾病、病症和/或病状的发生结合使用时是指降低发展所述疾病、 病症和/或病状的风险。参见“风险”的定义。
111.蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指充当离散单元的一个或 多个多肽。如果单个多肽为离散的功能单元并且不要求与其他多肽永 久性或暂时性的物理缔合以便形成离散的功能单元，则术语“多肽”和
ꢀ“
蛋白质”可以可互换地使用。如果离散的功能单元包含多于一个彼此 物理缔合的多肽，则术语“蛋白质”是指物理连接并且一起充当离散单 元的多个多肽。
112.风险：如将从上下文所理解，疾病、病症和/或病状的“风险”包括 特定个体将发展疾病、病症和/或病状(例如dmd)的可能性。在一些 实施方案中，风险被表示为百分比。在一些实施方案中，风险是从 0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％直至100％。在一些实施方案中， 风险被表示为相对于与参考样品或一组参考样品相关的风险的一种 风险。在一些实施方案中，参考样品或一组参考样品具有疾病、病症、 病状和/或事件(例如，dmd)的已知风险。在一些实施方案中，参考 样品或一组参考样品来自与具体个体可比较的个体。在一些实施方案 中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
113.选择性结合：如本文所用，“选择性结合”、“选择性地结合”、“特 异性结合”或“特异性地结合”是指关于结合部分和靶标，结合部分与 靶标而不是与不为靶标的实体的优先结合。结合部分和非靶标之间可 能发生一定程度的非特异性结合。在一些实施方案中，如果与结合部 分与非靶标的结合相比，所述结合部分与靶标之间的结合大于2倍、 大于5倍、大于10倍或大于100倍，则所述结合部分选择性地结合 所述靶标。在一些实施方案中，如果结合亲和力小于约10-5
m、小于 约10-6
m、小于约10-7
m、小于约10-8
m或小于约10-9
m，则结合部 分选择性地结合靶标。
114.横纹肌：如本文所用，术语“横纹肌”是指具有其细胞内收缩单元 肌小节的规则排列、从而导致使用显微镜并在自主控制下出现条纹的 多核肌肉组织。通常，横纹肌可以是心肌、骨骼肌和鳃节肌。
115.平滑肌：如本文所用，术语“平滑肌”是指非自主控制的无纹肌， 包括单一和多单元肌肉。
116.受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例 如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。 人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受 试者可以是患者，其是指送至医疗服务提供者以诊断或治疗疾病的 人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可 罹患或易患疾病或病症但是可显示或可不显示所述疾病或病症的症 状。
117.基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范 围或程度的目标特征或特性的定性情况。生物领域的普通技术人员将 了解生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或 达成或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来获
得在许多生 物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
118.基本同源性：短语“基本同源性”在本文用于指氨基酸序列或核酸 序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解，如果两个序列在对 应位置含有同源残基，则所述两个序列通常被认为是“基本上同源 的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是将具有适 当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域普通 技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨 基酸，和/或为具有“极性”或“非极性”侧链。用一个氨基酸取代同一类 型的另一个氨基酸通常可被认为是“同源”取代。
119.如本领域所熟知的，氨基酸序列或核酸序列可使用各种算法中的 任一种进行比较，所述算法包括在商业计算机程序中可用的那些算 法，如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、 空位blast和psi-blast。示例性此类程序描述于altschul等，basiclocal alignment search tool,j.mol.biol.,215(3):403-410,1990； altschul等，methods inenzymology；altschul等，"gappedblast andpsi-blast:a new generation of protein database search programs", nucleicacidsres.25:3389-3402,1997；baxevanis等，bioinformatics: apractical guide to theanalysis ofgenes andproteins,wiley,1998；以 及misener等(编)，bioinformatics methods andprotocols(methods inmolecularbiology,第132卷),humanapress,1999。除了鉴定同源序 列之外，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施方案中， 如果两个序列的对应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或更多在相关段残基上同源，则所述两个序列被认为是基本上同 源的。在一些实施方案中，所述相关段是完整序列。在一些实施方案 中，所述相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更 多个残基。
120.基本同一性：短语“基本同一性”在本文用于指氨基酸序列或核酸 序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解，如果两个序列在对 应位置含有相同残基，则所述两个序列通常被认为是“基本上相同 的”。如本领域所熟知的，氨基酸序列或核酸序列可使用各种算法中 的任一种进行比较，所述算法包括在商业计算机程序中可用的那些算 法，如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、 空位blast和psi-blast。示例性此类程序描述于altschul等，basiclocal alignment search tool,j.mol.biol.,215(3):403-410,1990； altschul等，methods in enzymology；altschul等，nucleicacids res. 25:3389-3402,1997；baxevanis等，bioinformatics:a practical guide totheanalysis ofgenes andproteins,wiley,1998；以及misener等(编)， bioinformatics methods and protocols(methods in molecular biology, 第132卷),humanapress,1999。除了鉴定相同序列之外，上述程序通 常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应 残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相 关段残基上相同，则所述两个序列被认为是基本上相同的。在一些实 施方案中，所述相关段是完整序列。在一些实施方案中，所述相关段 是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。
121.表面等离子体共振：如本文所用，是指允许例如通过使用biacore 系统
(pharmaciabiosensorab,uppsala,sweden and piscataway,n.j.)检 测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来实时分析特异性结合相 互作用的光学现象。关于进一步描述，参见jonsson,u.等，(1993)ann. biol.clin.51:19-26；jonsson,u.等，(1991)biotechniques 11:620-627； johnsson,b.等，(1995)j.mol.recognit.8:125-131；以及johnnson,b., 等，(1991)anal.biochem.198:268-277。
122.患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断具有或展现所 述疾病、病症和/或病状(例如像dmd)的一种或多种症状。
123.易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断患有所述疾 病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状 的个体可不表现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案 中，易患疾病、病症、病状或事件(例如，dmd)的个体可具有以下中 的一个或多个特征:(1)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的基因突 变；(2)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与所 述疾病、病症和/或病状相关的蛋白质的表达和/或活性增加和/或减 少；(4)与发展所述疾病、病症、病状和/或事件相关的习惯和/或生活 方式；(5)已经经历、计划经历或需要移植。在一些实施方案中，易患 疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一 些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、 病症和/或病状。
124.靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病如dmd 影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展现疾病相关病理 学、症状或特征的组织，包括但不限于肌肉消耗、骨骼变形、心肌病、 肌肉局部缺血、认知损害以及受损的呼吸功能。在一些实施方案中， 靶组织是平滑肌、横纹肌或心肌。
125.治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指在施 用至患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、诊断、 预防所述疾病、病症和/或病状的症状和/或延迟其发作的量。本领域 普通技术人员将理解治疗有效量通常经由包括至少一个单位剂量的 给药方案来施用。
126.治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指 用于部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/ 或病状(例如像dmd)的一种或多种症状或特征，延迟其发作，降低 其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。为了降低发展与疾病相 关的病理学的风险的目的，可向不显示所述疾病的病征和/或仅显示 所述疾病的早期病征的受试者施用治疗。
127.详述
128.本发明尤其提供用于基于使用抗flt-1抗体或其抗原结合片段作 为用于治疗肌营养不良的治疗剂来治疗肌营养不良，包括杜氏肌营养 不良(dmd)和/或贝克肌营养不良的方法和组合物。在一些实施方案 中，本发明提供治疗dmd的方法，所述方法包括向患有或易患dmd 的个体施用治疗有效量的抗flt-1抗体或其抗原结合片段，以使得 dmd的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面降低或延 迟发作。
129.本发明的各个方面在以下章节中详细描述。章节的使用并不意味 着限制本发明。每个章节可适用于本发明的任何方面。在本技术中， 除非另外指出，否则使用“或”意味着“和/或”。
130.杜氏肌营养不良(dmd)
131.dmd是一种特征在于在整个身体中肌肉的进行性恶化和肌肉相 关功能的丧失的疾病。预期本发明提供用于减缓、延迟或预防肌肉退 化、再生肌肉以及逆转、消除、延迟、预防或最小化与各种肌肉组织 中的dmd和其他肌营养不良相关的纤维化、炎症和其他症状或特征 的方法和组合物。
132.肌肉组织
133.在动物中存在两种主要的肌肉组织类型，横纹肌和平滑肌。如本 文所用，术语“横纹肌”是指含有重复肌小节的肌肉组织。横纹肌倾向 于在自主控制下并附着至骨骼。横纹肌允许身体的自主运动，并且包 括主要肌肉群，包括四头肌、腓肠肌、二头肌、三头肌、斜方肌、三 角肌等。横纹肌往往很长，并且许多横纹肌能够独立起作用。然而， 一些横纹肌不附着至骨骼，包括在口、肛门、心脏和食道的上部中的 那些。
134.另一方面，平滑肌具有非常不同的结构。平滑肌倾向于组构成连 续的片，其中在平滑肌细胞之间具有机械连接，而不是一系列具有单 独骨骼附件的长肌肉。平滑肌通常位于中空器官的壁中，并且通常不 在自主控制之下。内衬特定器官的平滑肌必须同时承受相同的负荷和 收缩。平滑肌至少部分地起作用来处理由运动和/或姿势或压力变化 引起的中空器官的负荷变化。这种双重作用意味着平滑肌不仅必须能 够像横纹肌一样收缩，而且必须能够紧张地收缩以针对持续负荷维持 器官尺寸。平滑肌的实例是内衬血管、细支气管、膀胱和胃肠道如直 肠的那些。
135.肌肉的强度取决于肌肉细胞的数量和大小以及其解剖结构。通过 合成新的肌原纤维(肥大)和/或形成更多的肌肉细胞(增生)来增加肌肉 纤维的直径将增加肌肉的力产生能力。
136.肌肉也可通根据位置或功能进行分组。在一些实施方案中，将 flt-1抗体或其抗原结合片段靶向至面部的一种或多种肌肉、用于咀 嚼的一种或多种肌肉、舌部和颈部的一种或多种肌肉、胸部的一种或 多种肌肉、肩胛带和臂部的一种或多种肌肉、臂部和肩部的一种或多 种肌肉、一种或多种腹侧和背侧前臂肌肉、手部的一种或多种肌肉、 竖脊肌的一种或多种肌肉、骨盆带和腿部的一种或多种肌肉、和/或 前腿和足部的一种或多种肌肉。
137.在一些实施方案中，面部的肌肉包括但不限于眼内肌，如睫状肌、 虹膜扩张肌、虹膜括约肌；耳部的肌肉，如耳廓肌、颞顶肌、镫骨肌、 鼓膜张肌；鼻部的肌肉，如降眉间肌、鼻肌、鼻孔扩张肌、降鼻中隔 肌、提上唇鼻翼肌；口部的肌肉，如提口角肌、降口角肌、口轮匝肌、 颊肌、颧大肌和颧小肌、颈阔肌、提上唇肌、降下唇肌、笑肌、颏肌 和/或皱眉肌。
138.在一些实施方案中，咀嚼肌肉包括但不限于：咬肌、颞肌、翼内 肌、翼外肌。在一些实施方案中，舌部和颈部的肌肉包括但不限于颏 舌肌、茎突舌肌、舌腭肌、舌骨舌肌、二腹肌、茎突舌骨肌、下颔舌 骨肌、颏舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、甲状舌骨 肌、胸锁乳突肌、前斜角肌、中斜角肌、和/或后斜角肌。
139.在一些实施方案中，胸部、肩胛带和臂部的肌肉包括但不限于， 锁骨下肌胸大肌、胸小肌、腹直肌、腹外斜肌、腹内斜肌、腹横肌、 膈肌、外肋间肌、内肋间肌、前锯肌、斜方肌、提肩胛肌、大菱形肌、 小菱形肌、背阔肌、三角肌、肩胛下肌、冈上肌、冈下肌、大圆肌、 小圆肌、和/或喙肱肌。
140.在一些实施方案中，臂部和肩部的肌肉包括但不限于，肱二头肌 长头、肱二头肌短头、肱三头肌长头、肱三头肌外侧头、肱三头肌内 侧头、肘肌、旋前圆肌、旋后肌和/或肱
肌。
141.在一些实施方案中，腹侧和背侧前臂的肌肉包括但不限于，肱桡 肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、掌长肌、尺侧腕伸肌、桡侧腕长伸肌、 桡侧腕短伸肌、指伸肌、小指伸肌。
142.在一些实施方案中，手部的肌肉包括但不限于手的内在肌肉，如 鱼际肌、拇短展肌、拇短屈肌、拇对掌肌、小鱼际肌、小指展肌、小 指短屈肌、小指对掌肌、掌侧骨间肌、背侧骨间肌和/或蚓状肌。
143.在一些实施方案中，竖脊肌的肌肉包括但不限于子，颈肌、棘肌、 最长肌、和/或髂肋肌。
144.在一些实施方案中，骨盆带和腿部的肌肉包括但不限于，腰大肌、 髂肌、股方肌、长收肌、短收肌、大收肌、股薄肌、缝匠肌、股四头 肌如股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、腓肠肌、腓骨肌(fibularis) (腓骨肌(peroneus))长肌、比目鱼肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、绳腱: 股二头肌:长头、绳腱:股二头肌:短头、绳腱:半腱肌、绳腱:半膜肌、 阔筋膜张肌、耻骨肌和/或胫骨前肌。
145.在一些实施方案中，前腿和足部的肌肉包括但不限于，趾长伸肌、 长伸肌、腓骨短肌、跖肌、胫骨后肌、趾长屈肌、趾短伸肌(extensordigitorumbrevis)、趾短伸肌(extensorhallucis brevis)、拇展肌、屈姆短 肌、小趾展肌、小趾短屈肌、小趾对跖肌、趾短伸肌、足部的蚓状肌、 跖方肌或副屈肌、趾短屈肌、背侧骨间肌、和/或骨间足底肌。
146.示例性肌肉靶标总结于表1中。
147.表1.
148.[0149][0150]
肌营养不良
[0151]
肌营养不良是引起肌肉退化、从而导致虚弱和运动受损的一组遗 传性病症。所有肌营养不良的中心特征在于它们在本质上是进行性 的。肌营养不良包括但不限于：杜氏肌营养不良(dmd)、贝克肌营养 不良、emery-dreifuss肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌 营养不良以及1型和2型肌强直性营养不良，包括先天形式的1型肌 强直性营养不良。症状可因肌营养不良的类型而异，其中一些或全部 肌肉受到影响。肌营养不良的示例性症状包括肌肉运动技能的延迟发 育，使用一种或多种肌肉群的困难，吞咽、讲话或进食困难，流涎， 眼睑下垂，频繁跌倒，成年人肌肉或肌肉群中的强度丧失，肌肉大小 的损失，
由于身体虚弱或改变的生物力学所致的步行障碍，和/或认 知或行为障碍/智力迟钝。
[0152]
虽然不存在肌营养不良的已知疗法，但是使用几种支持治疗，其 包括症状和疾病改善疗法。皮质类固醇、ace抑制剂、血管紧张素 受体阻断剂、物理疗法、矫形装置、轮椅、或其他用于adl和肺功 能的辅助医疗装置通常用于肌营养不良中。心脏起搏器用于预防由于 肌强直性营养不良中的心律失常所致的猝死。改善肌强直(不能放松) 的抗肌强直剂包括美西律(mexilitine)，并且在一些情况下苯妥英、普 鲁卡因胺和奎宁。
[0153]
杜氏肌营养不良
[0154]
杜氏肌营养不良(dmd)是肌营养不良的隐性x连锁形式，其导 致肌肉退化和最终死亡。dmd的特征在于近端肌肉无力、步态异常、 腓肠肌(小腿)肌肉肥大、以及肌酸激酶升高。许多dmd患者在5岁 左右被诊断出，此时症状/体征通常变得更加明显。受影响的个体通 常在10-13岁左右停止行走，并且由于呼吸系统并发症和心肌病而在 20岁中期至后期中或之前死亡。
[0155]
在患有dmd的个体中，与未受影响的个体相比，血清肌酸激酶 水平可增加大于10倍。在一些实施方案中，将所提供的组合物施用 至受影响的个体产生与治疗前的基线水平相比降低的血清肌酸激酶 水平。通常，治疗前立即测量基线水平。在一些实施方案中，施用所 提供的组合物使得与就在治疗前的基线血清肌酸激酶水平相比，血清 肌酸激酶水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或95％。在一些实施方案中，施用所提供的组合物使得血 清肌酸激酶水平降低至小于约3500iu/l、3000iu/l、2500iu/l、2000 iu/l、1500iu/l、1000iu/l、750iu/l、500iu/l、250iu/l、100iu/l、 90iu/l、80iu/l、70iu/l或60iu/l。在一些实施方案中，施用所 提供的组合物产生与未治疗的受试者的血清肌酸激酶水平相比降低 的血清肌酸激酶水平。
[0156]
病症dmd由位于人x染色体上的肌营养不良蛋白基因中的突变 引起，所述基因编码蛋白质肌营养不良蛋白，其是一种提供细胞膜的 营养不良相关蛋白聚糖复合物(dgc)的结构稳定性的肌肉组织内的 重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白丝网络和细 胞外基质，从而为肌纤维提供物理强度。因此，肌营养不良蛋白的改 变或不存在导致肌纤维的异常肌膜撕裂和坏死。虽然两种性别均可携 带突变，但女性很少表现出严重疾病病征。
[0157]
dmd的主要症状是与肌肉消耗相关的肌无力，其中通常首先影 响自主肌肉，特别是影响臀部、骨盆区域、大腿、肩部的肌肉和小腿 肌肉。肌肉无力也发生在臂部、颈部和其他区域。小腿经常被增大。 病征和症状通常在6岁之前出现，并且可早在婴儿期出现。心肌病通 常在18岁以后发生于dmd患者中。其他身体症状包括但不限于独 立步行的能力延迟，步行、跨步或跑步的进行性困难，以及步行能力 的最终丧失(通常到12岁时)；频繁跌倒；疲劳；运动技能困难(跑步、 跳跃、蹦跳)；腰椎前凸增加，从而导致髋屈肌缩短；跟腱和绳腱功 能受损、结缔组织纤维化；肌纤维畸形；由脂肪和结缔组织替代肌肉 组织引起的舌和小腿肌肉的假性肥大(增大)；神经行为障碍(例如 adhd)、学习障碍(阅读障碍)和特定认知技能(特别是短期非文字记 忆)中的非进行性变弱的高风险；骨骼畸形(包括在一些情况下脊柱侧 凸)。
[0158]
在dmd中观察到的肌肉变化伴随结缔组织的增加(即纤维化的 发展)，并且由涉及机械、体液和或细胞因子的反应或修复过程造成。 缺乏功能性肌营养不良蛋白导致肌肉纤
维膜的不稳定性，并且作为结 果，细胞对机械剪切的抵抗力较小，并且倾向于电解质的过量流入， 从而导致组织损伤。因为dmd中的肌肉组织被损伤，所以恢复受卫 星细胞增殖的能力限制。这导致坏死、炎症、纤维化和脂肪细胞替代。 结缔组织的增加在疾病过程早期发生，因为将每个肌细胞置于鞘中并 覆盖肌膜(即肌内膜)的结膜组织在可观察到的肌肉损伤之前增加。胶 原结缔组织的增加是dmd的肌肉病理学的一种因素，从而不利地影 响到受影响的肌细胞的营养供应，并且其次影响肌肉强度和移动丧失 的年龄。
[0159]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 使得肌肉组织的纤维化减少。在一些实施方案中，肌肉是骨骼肌。在 具体实施方案中，肌肉是心肌、膈肌、腓肠肌和/或胫骨前肌(ta)肌 肉。在一些实施方案中，通过减少的胶原蛋白染色来证明减少的纤维 化。在一些实施方案中，胶原蛋白是i型胶原蛋白。在一些实施方案 中，减少的纤维化可例如通过测量施用抗flt-1抗体或其抗原结合片 段的小鼠的肌肉中的胶原蛋白阳性面积的百分比来测量。例如，施用 抗flt-1抗体或其抗原结合片段的小鼠的膈肌中的胶原蛋白阳性面积 百分比可以是总组织面积的至少约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、 约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约7.5％、约8.0％、 约8.5％或约9.0％。在一个具体实施方案中，施用抗flt-1抗体的小鼠 的膈肌中的胶原蛋白阳性面积百分比可显著低于施用同种型对照抗 体的小鼠的膈肌中的胶原蛋白阳性面积百分比。
[0160]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 使得肌肉组织的坏死减少。在一些实施方案中，肌肉是骨骼肌。在具 体实施方案中，肌肉是心肌、膈肌、腓肠肌和/或胫骨肌(ta)肌。在 一些实施方案中，减少的坏死可例如通过测量施用抗flt-1抗体或其 抗原结合片段的小鼠的肌肉中的坏死阳性面积的百分比来测量。例 如，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段的小鼠的腓肠肌中的坏死阳 性面积百分比可以是总组织面积的至少约0.5％、约0.45％、约0.4％、 约0.35％、约0.3％、约0.25％、约0.2％、约0.15％、约0.1％、约0.05％、 或约0.025％。在一个具体实施方案中，施用抗flt-1抗体的小鼠的腓 肠肌中的坏死阳性面积百分比可显著低于施用同种型对照抗体的小 鼠的腓肠肌中的坏死阳性面积百分比。
[0161]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 产生增加的肌力和/或抗疲劳性。
[0162]
flt-1受体
[0163]
flt-1受体(也称为血管内皮生长因子受体1(vegfr-1)或flt-1)是 由flt1基因编码并且在内皮细胞和单核细胞细胞膜上表达的受体。 信号糖蛋白的血管内皮生长因子(vegf)家族在胚胎发生和产后生长 中充当血管生成的潜在启动子。具体地说，vegf-a配体与vegf受 体的结合已经显示促进血管渗透性并且还引发内皮细胞迁移、增殖和 存活，并且新形成的内皮细胞提供新的血管系统的基本结构。对于血 管形成的主要vegf信号分子vegf-a通过vegf受体-1(vegfr-1， 也称为flt-1)和vegf受体-2(vegfr-2，也称为flk-1)介导其信号。 flt-1的可溶性形式(sflt-1)也存在，但缺乏细胞内信号传导结构域且 因此被认为仅通过螯合vegf-a或与其结合的其他配体以在调控能 力方面发挥作用。sflt-1和不与细胞内信号转导途径相关的其他含 flt-1结合位点的分子被称为“诱饵受体”。flt-1和flk-1受体含有细胞 外vegf-a结合结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域，并且在成血血管 细胞和内皮细胞谱系中的发育阶段和组织再生期间均显示表达。与 flk-1相比，flt-1对
vegf-a具有大约10倍的结合亲和力(kd约2-10 pm)，但较弱酪氨酸激酶活性表明vegf-a与flt-1结合后的血管生 成信号转导比由vegf-a与flk-1结合产生的血管生成信号转导弱。 因此，纯合flt-1基因敲除小鼠在胚胎期死于内皮细胞过度产生和血 管组织破坏。相反，纯合flk-1基因敲除小鼠死于由于胚胎发生期间 缺乏卵黄囊血岛形成所致的组织化血管发育的缺陷。flt-1和flk-1受 体两者均是正常发育所需的，但是vegf-a浓度的选择性增加可允许 与flk-1受体的更大结合并且诱导增加毛细血管密度并促进肌肉再 生、纤维化和炎症的减轻以及与dmd和各种肌肉组织中的其他肌营 养不良相关的症状和特征的缓解的促血管生成作用。
[0164]
如本文所用，术语“flt-1受体”是指可溶性和膜相关flt-1受体两 者或其功能片段。
[0165]
抗flt-1抗体
[0166]
如本文所用，术语“抗flt-1抗体”是指结合至flt-1受体(例如，可 溶性或膜相关flt-1受体)的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施 方案中，产生以高亲和力结合至flt-1受体的抗flt-1抗体。不希望受 理论束缚，据信结合至flt-1受体的抗flt-1抗体抑制一种或多种内源 性配体结合至flt-1，且由此允许更多量的可用配体与其他vegf受 体如flk-1受体缔合。增加vegf的可用性促进血管生成，伴随到肌 肉的血流量增加以对抗功能性局部缺血并产生dmd的结构和功能特 征的改善。在一些实施方案中，结合至flt-1受体的抗体增加可用于 结合至其他vegf受体的vegf的量。
[0167]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段包含表2中 提供的序列。
[0168]
表2.
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178][0179][0180]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段包含一个或 多个互补决定区(cdr)，所述互补决定区选自由以下组成的组：vlcdr1，其由与seq id no:19至seq id no:21中的任一个具有至少 60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；vlcdr2，其由与seq id no:22至seq id no:24中的任一个具有至少 60％、70％、80％、90％、
cdr2和vh cdr3。在 另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链， 所述vh链包含分别由seq id no:2、seq id no:6和seq id no:16 的氨基酸序列定义的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在另一个 实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链，所述 vh链包含分别由seq id no:2、seq id no:10和seq id no:18的 氨基酸序列定义的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在另一个实 施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链，所述vh 链包含分别由seq id no:2和seq id no:17的氨基酸序列定义的 vh cdr1和vh cdr3，以及由seq id no:7、seq id no:8、seq idno:13或seq id no:14的氨基酸序列定义的vh cdr2。在另一个实 施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链，所述vh 链包含分别由seq id no:3和seq id no:17的氨基酸序列定义的 vh cdr1和vh cdr3，以及由seq id no:9、seq id no:11或seqid no:12的氨基酸序列定义的vh cdr2。在另一个实施方案中，所 述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链，所述vh链包含分别 由seq id no:4、seq id no:9和seq id no:17的氨基酸序列定义 的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在一个具体实施方案中，所 述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括vh链，所述vh链包含由seqid no:3的氨基酸序列定义的vh cdr1、由seq id no:12的氨基酸 序列定义的vh cdr2以及由seq id no:17的氨基酸序列定义的vhcdr3。在一些实施方案中，vh cdr3不是seq id no:15。
[0186]
在另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括 轻链vl区，所述轻链vl区包含与seq id no:49至seq id no:61 中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的 氨基酸序列；和/或重链vh区，所述重链vh区包含与seq id no:35 至seq id no:48中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％ 或98％同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述vl区包 含seq id no:60的氨基酸序列，并且所述vh区包含seq id no:45 的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区， 所述重链恒定区包含与seq id no:87至seq id no:89中的任一个 具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。 在一些实施方案中，所述vl区不是seq id no:49或seq id no:50。 在一些实施方案中，所述vh区不是seq id no:35或seq id no:36。
[0187]
在另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段包括 轻链，所述轻链包含与seq id no:75至seq id no:86中的任一个 具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列； 和/或重链，所述重链包含与seq id no:62至seq id no:74中的任 一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸 序列。在一个具体实施方案中，所述轻链包含seq id no:76的氨基 酸序列，并且所述重链区包含seq id no:71的氨基酸序列。
[0188]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段的重链包含 氨基酸序列
[0189]
mgwsciilflvatatgvhselqlvesggglvqpggslrlscaasgf
[0190]
tfsdysaswvrqapgkglewvsaiswsgdstyyaesvkgrftifr
[0191]
dnskntlylqmnslraedtavyycakswatpieslyyygsdywg
[0192]
qgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepv
[0193]
tvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
[0194]
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfpp
1和或抑制vegf与可溶性flt-1的结合。在其他实 施方案中，所述竞争和或抑制是以剂量依赖性方式。在具体实施方案 中，vegf与flt-1的结合的抑制使得vegf r2的磷酸化增加。不希 望受理论约束，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段与flt-1的结合抑 制vegf与flt-1的结合。未结合的vegf结合vegf r2，这可通过 测量vegf r2的磷酸化来证明。在具体实施方案中，所述抗flt-1抗 体或抗原结合片段以剂量依赖性方式挽救vegf r2磷酸化。例如， vegf r2磷酸化可被挽救至少约100％、约95％、约90％、约85％、 约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约 45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％ 或约5％。
[0210]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段在生物测定 中提供大于约95％、大于约90％、大于约85％、大于约80％、大于 约75％、大于约70％、大于约65％、大于约60％、大于约55％、大 于约50％、大于约45％、大于约40％、大于约35％、大于约30％、 大于约25％、大于约20％、大于约15％或大于约10％挽救。在一个 具体实施方案中，所述生物测定包括在sflt-1和抗flt-1抗体或其抗 原结合片段存在下用vegf刺激的人原代静脉内皮细胞(huvec)。 可通过确定vegf r2受体的磷酸化状态来测定vegf诱导的细胞活 化。在单独sflt-1(例如没有抗flt-1抗体)存在下，数据可被表示为相 对于vegf r2受体的磷酸化，vegf r2受体的磷酸化的挽救百分比。
[0211]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约 200小时、大于约150小时、大于约100小时、大于约95小时、大 于约90小时、大于约85小时、大于约80小时、大于约75小时、大 于约70小时、大于约65小时、大于约60小时、大于约55小时、大 于约50小时或大于约45小时以及其中的范围的半衰期。在一些实施 方案中，在小鼠中测量半衰期。
[0212]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约 400ug/ml、大于375ug/ml、大于约350ug/ml、大于约325ug/ml、 大于约300ug/ml、大于约275ug/ml、大于约250ug/ml、大于约 225ug/ml、大于约200ug/ml、大于约175ug/ml、大于约150ug/ml、 大于约125ug/ml、大于约100ug/ml、大于约75ug/ml或大于约50 ug/ml以及其中的范围的最大血清浓度。在一些实施方案中，在小鼠 中测量所述最大血清浓度。
[0213]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结 合flt-1，并且与其他vegf受体具有最小或无明显结合。在一些实 施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合flt-1，并且 与vegf r2(flk-1)和/或vegf r3(flt-4)具有最小或无明显结合。
[0214]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段当与人flt-1 结合时具有大于约1x 10-3
m-1
sec-1
、大于约1x 10-4
m-1
sec-1
、大于约 1x 10-5
m-1
sec-1
、大于约1x 10-6
m-1
sec-1
或大于约1x 10-7
m-1
sec-1
的ka。
[0215]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段当与人flt-1 结合时具有大于约1x 10-3
sec-1
、大于约1x 10-4
sec-1
、大于约1x 10-5 sec-1
或大于约1x 10-6
sec-1
的kd。
[0216]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段当与人flt-1 结合时具有大于约1x 10-8
m、大于约1x 10-9
m、大于约1x 10-10
m、 大于约1x 10-11
m或大于约1x 10-12
m的kd。
[0217]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至可溶 性flt-1。在具体实施方案中，结合是剂量依赖性的，其中较高浓度 的抗体或其抗原结合片段结合较大量的可溶性flt-1。
[0218]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约 99％、大于约98％、大于约97％、大于约96％、大于约95％、大于约 94％、大于约93％、大于约92％、大于约91％、大于约90％或大于约 80％的人同一性百分比。
[0219]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约 99％、大于约98％、大于约97％、大于约96％、大于约95％、大于约 94％、大于约93％、大于约92％、大于约91％、大于约90％或大于约 80％的人同源性百分比。
[0220]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至flt-1 蛋白。在一些实施方案中，所述flt-1蛋白是重组蛋白，例如重组sflt-1。 在一个具体实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合人 flt-1同种型1(np_002010.2gi:156104876；seq id no:90)(表13)。
[0221]
在另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人 flt-1同种型x1(xp_011533316.1gi:767977511；seq id no:91)。在 另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人 flt-1同种型2前体(np_001153392.1gi:229892220；seq id no:92)。 在另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人 flt-1同种型3前体(np_001153502.1gi:229892300；seq id no:93)。 在另一个实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人 flt-1同种型4前体(np_001153503.1gi:229892302；seq id no:94)。
[0222]
在一些实施方案中，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合至 flt-1蛋白的特定表位。例如，所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段结 合至如在表3中提供的氨基酸序列。
[0223]
表3.
[0224][0225]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 产生至少约700ug/ml、至少约650ug/ml、至少约600ug/ml、至少 约550ug/ml、至少约500ug/ml、至少约450ug/ml、至少约400 ug/ml、至少约350ug/ml、至少约300ug/ml、至少约250ug/ml、 至少约200ug/ml、至少约150ug/ml、至少约100ug/ml、至少约 50ug/ml、至少约40ug/ml、至少约30ug/ml、至少约20ug/ml、 至少约10ug/ml或至少约5ug/ml以及其中的范围的峰值血清抗体 水平。在一些实施方案中，所述峰值血清抗体水平是剂量依赖性的。
[0226]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 产生至少约450ug/ml、至少约400ug/ml、至少约350ug/ml、至少 约300ug/ml、至少约250ug/ml、至少约200ug/ml、至少约150 ug/ml、至少约100ug/ml、至少约50ug/ml或至少约25ug/ml以及 其中的范围的谷值血清抗体水平。在一些实施方案中，所述谷值血清 抗体水平是剂量依赖性
的。
[0227]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 产生与基线水平相比或与单独施用媒介物的受试者的水平相比，降低 的可溶性flt-1的血清水平。通常，就在施用前测量基线水平。在一 些实施方案中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段使得与就在施用 前可溶性flt-1的基线血清水平相比，可溶性flt-1的血清水平降低至 少约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、 约30％、约20％或约10％。在一些实施方案中，施用抗flt-1抗体或 其抗原结合片段使得可溶性flt-1的血清水平降低至小于约4000 pg/ml、约3500pg/ml、约3000pg/ml、约2500pg/ml、约2000pg/ml、 约1750pg/ml、约1500pg/ml、约1250pg/ml、约1000pg/ml、约 900pg/ml、约800pg/ml、约700pg/ml、约600pg/ml、约500pg/ml、 约450pg/ml、约400pg/ml、约350pg/ml、约300pg/ml、约250 pg/ml、约200pg/ml、约150pg/ml、约100pg/ml、约50pg/ml或 约10pg/ml以及其中的范围。在一些实施方案中，与未施用抗flt-1 抗体或其抗原结合片段的受试者中的可溶性flt-1的血清水平相比， 施用所述抗体或其抗原结合片段产生降低的可溶性flt-1的血清水 平。在一些实施方案中，降低的可溶性flt-1的血清水平是剂量依赖 性的。
[0228]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 使得与基线水平相比或与用单独媒介物处理的受试者的水平相比，vegf的血清水平增加。通常，治疗前立即测量基线水平。在一些实 施方案中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段使得与就在施用前 vegf的基线血清水平相比，vegf的血清水平增加至少约95％、约 90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％ 或约10％。在一些实施方案中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 使得vegf的血清水平增加至多于约500pg/ml、约450pg/ml、约 400pg/ml、约350pg/ml、约300pg/ml、约250pg/ml、约200pg/ml、 约150pg/ml、约100pg/ml、约50pg/ml或约25pg/ml以及其中的 范围。在一些实施方案中，与未进行治疗的受试者中的vegf的血清 水平相比，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段产生增加的vegf血 清水平。在一些实施方案中，增加的vegf血清水平是剂量依赖性的。
[0229]
在一些实施方案中，在体内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 使得肌肉组织的血管生成增加。在一些实施方案中，肌肉是骨骼肌。 在具体实施方案中，肌肉是膈肌、腓肠肌和/或胫骨前肌(ta)肌肉。 在一些实施方案中，增加的血管生成通过内皮细胞标志物例如cd31 的cd31染色增加来证明。在一些实施方案中，增加的染色可例如通 过测量施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段的小鼠的肌肉中的cd31 阳性面积百分比来测量。例如，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 的小鼠的膈肌中的cd31阳性面积百分比可以是总组织面积的至少约 0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约 1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约 1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％或约2.5％。在 另一实例中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段的小鼠的ta肌肉 中的cd31阳性面积百分比可以是总组织面积的至少约0.5％、约 0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1.0％。在一个具体实施方案 中，施用抗flt-1抗体的小鼠的膈肌或ta肌肉中的cd31阳性面积百 分比可显著高于施用同种型对照抗体的小鼠的膈肌或ta肌肉中的 cd31阳性面积百分比。
[0230]
在一些实施方案中，可例如通过测量施用抗flt-1抗体或其抗原 结合片段的小鼠的肌肉中的标准化的cd31阳性百分比来测量内皮细 胞标志物的增加的染色。在具体实施
方案中，施用抗flt-1抗体或其 抗原结合片段的小鼠的肌肉的cd31染色增加是相对于在施用同种型 对照抗体的小鼠的肌肉中测量的cd31染色。例如，施用抗flt-1抗 体或其抗原结合片段的小鼠的膈肌中的标准化的cd31阳性百分比可 以是至少约200％、约190％、约180％、约170％、约160％、约150％、 约140％、约130％、约120％或约110％。在另一实例中，施用抗flt-1 抗体或其抗原结合片段的小鼠的ta肌肉中的标准化的cd31阳性百 分比可以是至少约300％、约290％、约280％、约270％、约260％、 约250％、约240％、约230％、约220％、约210％、约200％、约190％、 约180％、约170％、约160％、约150％、约140％、约130％、约120％ 或约110％以及其中的范围。
[0231]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结 合人flt-1，并且与其他哺乳动物flt-1受体具有最小或无明显结合(例 如，结合亲和力小于10-7
m或10-6
m)。在一些实施方案中，抗flt-1 抗体或其抗原结合片段选择性地结合人flt-1并且不结合至猴flt-1。 在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合人 flt-1并且不结合至小鼠flt-1。
[0232]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段结合人flt-1 以及猴flt-1。在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段结 合至食蟹猴flt-1。在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片 段结合人flt-1以及小鼠flt-1。
[0233]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段选自由以下 组成的组：igg、f(ab’)2、f(ab)2、fab’、fab、scfv、双抗体、三抗 体和四抗体。
[0234]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段是igg。在 一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段是igg1。
[0235]
工程改造的恒定区
[0236]
在一些实施方案中，合适的抗flt-1抗体含有结合至fcrn受体的 fc结构域或其部分。作为非限制性实例，合适的fc结构域可源自免 疫球蛋白亚类，如igg。在一些实施方案中，合适的fc结构域源自 igg1、igg2、igg3或igg4。特别合适的fc结构域包括源自人或人 源化抗体的那些。
[0237]
预期fc结构域与fcrn受体之间的改善的结合产生延长的血清半 衰期。因此，在一些实施方案中，合适的fc结构域(seq id no:104) 包含导致与fcrn的结合改善的一个或多个氨基酸突变。影响与fcrn 的结合改善的fc结构域内的各种突变是本领域中已知的，并且可适 于实践本发明。在一些实施方案中，合适的fc结构域包含在对应于 人igg1的leu234、leu235、gly237、thr250、met 252、ser254、 thr256、thr 307、glu 380、met428、his 433和/或asn434的一个 或多个位置处的一个或多个突变。
[0238]
fc结构域中的一些突变导致igg与fcrn受体的结合减少，且由 此抑制效应子功能。在一些实施方案中，合适的fc结构域(seq idno：104)包含在对应于人igg1的leu 234、leu 235和gly 237的一 个或多个位置处的一个或多个突变。在一个具体实施方案中，leu 234 被突变为ala。在另一个实施方案中，leu 235被突变为ala。在另一 个实施方案中，gly 237被突变为ala。
[0239]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或抗原结合片段含有间隔区和 /或连接至另一个实体。在一些实施方案中，接头或间隔区包含与 gapgggggaaaaaggggggap(seq id no:105)(gag接头)具 有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在一些 实施方案中，接头或间隔区包含与 gapgggggaaaaaggggggapgggggaaaaaggggggap (seq id no:106)(gag2接头)具有至少50％(例如，至少55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％ 或100％)同一性的序列。在一些实施方案中，接头或间隔区包含与 gapgggggaaaaaggggggapgggggaaaaaggggggapgggggaaaaaggggggap(seq id no:107)(gag3接头)具有至少 50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
[0240]
抗flt-1抗体和抗原结合片段的产生
[0241]
适用于本发明的重组抗flt-1抗体或其抗原结合片段可通过任何 可用的方式产生。例如，重组抗flt-1抗体或抗原结合片段可通过利 用经工程改造以表达编码重组抗flt-1抗体或抗原结合片段的核酸的 宿主细胞系统来重组产生。
[0242]
因此，本发明进一步提供编码本文所述的各种氨基酸序列的多核 苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗 flt-1抗体重链或轻链氨基酸序列(例如seq id no:62-86或seq idno:108-110中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发 明提供一种编码本文所述的抗flt-1抗体重链或轻链氨基酸序列的可 变区(例如seq no:35-61中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施 方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗flt-1抗体重链或轻链氨 基酸序列的cdr区(例如seq id no:1-34中的任一个)的多核苷酸序 列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗flt-1抗 体恒定区氨基酸序列(例如seq id no:87-89中的任一个)的多核苷酸 序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗flt-1 抗体fc区氨基酸序列(例如seq id no:104)的多核苷酸序列。在一些 实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗flt-1抗体接头氨基 酸序列(例如seq id no:105-107)的多核苷酸序列。
[0243]
在一些实施方案中，编码抗flt-1抗体重链、轻链、可变区、cdr 区、fc区或接头区氨基酸序列的多核苷酸序列还包括编码信号肽的 序列。作为非限制性实例，合适的信号肽包含氨基酸序列 mgwsciilflvatatgvhs(seq id no:111)。
[0244]
本文描述的各种多核苷酸序列可体现在用于表达重组抗flt-1抗 体或其抗原结合片段的各种载体系统中。
[0245]
当重组产生抗体时，可使用任何表达系统。为了给出一些实例， 已知的表达系统包括例如卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
[0246]
在一些实施方案中，适合于本发明的重组抗flt-1抗体或其抗原 结合片段在哺乳动物细胞中产生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞 的非限制性实例包括balb/c小鼠骨髓瘤系(nso/l，ecacc编 号:85110503)；人成视网膜细胞(per.c6，crucell,leiden,thenetherlands)；以及由sv40(cos-7，atcc crl 1651)转化的猴肾cv1 系。
[0247]
在一些实施方案中，本发明提供一种由人细胞产生的重组抗flt-1 抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供一种由cho 细胞产生的抗flt-1抗体或其抗原结合片段。
[0248]
含有本发明抗体的药物组合物
[0249]
本发明进一步提供包含根据本发明的治疗活性成分(例如抗flt-1 抗体或其抗原结合片段)连同一种或多种药学上可接受的载体或赋形 剂的药物组合物。此类药物组合物
可任选地包含一种或多种另外的治 疗活性物质。
[0250]
虽然对本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合用于向人凭 医生处方施用的药物组合物，但熟练技术人员将理解此类组合物通常 适合用于向所有种类的动物施用。改变适用于向人施用的药物组合物 以便使得组合物适用于向各种动物施用是众所周知的，并且普通兽医 药理学家可仅仅通过普通实验(如果存在)来设计和/或进行此种改变。
[0251]
本文描述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后 开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性 成分与稀释剂或另一种赋形剂或载体和/或一种或多种其他辅助成分 缔合，并且然后如果必要和/或希望，使产品成形和/或包装为所需的 单剂量或多剂量单位。
[0252]
根据本发明的药物组合物可以单一单位剂量和/或以多个单一单 位剂量大批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含 预先确定的量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常 等于将要向受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的合宜分 数，例如像这种剂量的一半或三分之一。
[0253]
根据本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂 或载体和/或任何另外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身 份、尺寸和/或病状并且进一步取决于待施用所述组合物的途径而改 变。举例来说，所述组合物可包含介于0.1％与100％(w/w)之间的活 性成分。
[0254]
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂或载体，如本文所用 的赋形剂或载体包括适合于所需的具体剂型的任何和所有溶剂、分散 介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等 渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。remington’sthe science and practice of pharmacy,第21版,a.r.gennaro (lippincott,williams&wilkins,baltimore,md,2006；其以引用的方式 并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的 已知技术。除了如通过产生任何不希望的生物作用或另外以有害的方 式与药物组合物的任何其他组分相互作用而与物质或其衍生物不相 容的任何常规赋形剂介质或载体以外，所述赋形剂或载体的使用被涵 盖在本发明的范围内。
[0255]
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂或载体至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施 方案中，赋形剂或载体被批准用于人和用于兽医使用。在一些实施方 案中，赋形剂或载体由美国食品药品管理局批准。在一些实施方案中， 赋形剂或载体是药用级。在一些实施方案中，赋形剂或载体满足美国 药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0256]
在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂或载体包 括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化 剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形 剂或载体可任选包含在药物组合物中。根据配制者的判断，赋形剂或 载体如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂和/或芳 香剂可存在于组合物中。
[0257]
合适的药学上可接受的赋形剂或载体包括但不限于水、盐溶液 (例如，nacl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物 油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、 糖(如甘露糖醇、蔗糖、或其他)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、 粘
性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等， 以及其组合。如果需要，药物制剂可与助剂(例如润滑剂、防腐剂、 稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味 剂和/或芳香物质等)混合，所述助剂不会与活性化合物产生有害反应 或干扰其活性。在一个优选实施方案中，使用适合于静脉内施用的水 溶性载体。
[0258]
如果需要，合适的药物组合物或药剂还可含有少量的润湿剂或乳 化剂或ph缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、 丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物还可用传统粘合剂和载剂 (如甘油三酯)配制为栓剂。口服制剂可包含标准载体，如药用级甘露 糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、 碳酸镁等。
[0259]
药物组合物或药剂可根据常规程序配制为适用于施用至人类的 药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通 常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂 和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，成分被分开供应或以单 位剂型混合在一起，例如呈在气密密封容器如指示活性剂的量的安瓿 或药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式。当组合物欲通过输注 施用时，它可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶来分 配。在组合物通过注射施用时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿以 使得成分可在施用之前混合。
[0260]
在配制和/或制造药剂方面的一般考虑因素可见于例如 remington:the science andpractice ofpharmacy第21版,lippincottwilliams&wilkins,2005(以引用的方式并入本文)中。
[0261]
施用途径
[0262]
本文所述的抗flt-1抗体或其抗原结合片段(或含有本文所述的抗 flt-1抗体或其抗原结合片段的组合物或药剂)通过任何适当的途径施 用。在一些实施方案中，胃肠外施用抗flt-1抗体或抗原结合片段蛋 白或含有所述抗flt-1抗体或抗原结合片段蛋白的药物组合物。胃肠 外施用可以是静脉内、皮内、鞘内、吸入、经皮(局部)、眼内、肌内、 皮下、肌内和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，皮下施用抗flt-1 抗体或其抗原结合片段或含有所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段的 药物组合物。如本文所用，术语“皮下组织”被定义为皮肤正下方的松 散、不规则结缔组织的层。例如，可通过将组合物注射到包括但不限 于大腿区域、腹部区域、臀部区域或肩胛区域的区域中来进行皮下施 用。在一些实施方案中，静脉内施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段 或含有所述抗flt-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实 施方案中，口服施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段或含有所述抗 flt-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。如果需要，可同时使用 多于一种途径。
[0263]
在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其他实 施方案中，施用在个体的多个部分中产生作用，例如全身作用。通常， 施用导致将抗flt-1抗体或抗原结合片段递送至一种或多种靶组织， 包括但不限于肾、肝、脑、脊髓、肠道、眼睛、肺、脾、心脏(包括 心肌、横纹肌和平滑肌)。
[0264]
在一些实施方案中，横纹肌选自由以下组成的组：三头肌、胫骨 前肌、比目鱼肌、腓肠肌、四头肌和膈肌。
[0265]
在一些实施方案中，平滑肌是内衬血管、细支气管、膀胱和胃肠 道如直肠的肌肉。
[0266]
剂型和给药方案
[0267]
在一些实施方案中，组合物以治疗有效量和/或根据与特定所需 结果(例如，治疗
1.0mg/kg至约3mg/kg范围内的剂量施用抗flt-1抗体或其抗原结合 片段。在具体实施方案中，以约1.0mg/kg、约3.0mg/kg、约10mg/kg 或约20mg/kg的剂量施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段。
[0276]
在一些实施方案中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段降低至 少一种dmd病征或症状的强度、严重程度或频率或延迟其发作。在 一些实施方案中，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段降低至少一种 dmd病征或症状的强度、严重程度或频率或延迟其发作，所述dmd 病征或症状选自由以下组成的组：肌肉消耗、骨骼变形、心肌病、肌 肉局部缺血、认知损害以及受损的呼吸功能。
[0277]
在一些实施方案中，如通过6分钟步行测试、定量肌肉强度测试、 定时运动性能测试所测量，施用抗flt-1抗体或其抗原结合片段改善 临床结果。brooke和vignos肢体功能量表、肺功能测试(强力肺活量、 第1秒用力呼气容积、呼气流量峰值速率、最大吸气和呼气压力)、 健康相关生活质量、膝盖和肘屈肌、肘伸肌、肩外展、握力、从仰卧 位上升的时间、北极星移动评估(north start ambulatory assessment)、 定时10米步行/跑步、egen-klassification量表、高尔斯分数(gowersscore)、hammersmith运动能力、手持式测压法(hand held myometry)、 运动范围、测角术、高碳酸血症、婴儿和幼儿发育的nayley量表 (nayley scales of infant and toddler development)和/或护理者负担量 表(caregiver burden scale)。
[0278]
组合疗法
[0279]
在一些实施方案中，抗flt-1抗体或其抗原结合片段与一种或多 种另外的治疗剂组合施用。在一个实施方案中，另外的治疗剂是皮质 类固醇，例如泼尼松。在另一个实施方案中，另外的治疗剂是糖皮质 激素，例如地夫可特。在另一个实施方案中，另外的治疗剂是卵泡抑 素或其重组蛋白。在另一个实施方案中，另外的治疗剂是rna调节 治疗剂。rna调节治疗剂可以是外显子跳跃治疗剂或基因疗法。rna 调节治疗剂可以是例如drispersen、pro044、pro045、eteplirsen (avi-4658)、srp-4053、srp-4045、srp-4050、srp-4044、srp-4052、 srp-4055或srp-4008。在一些实施方案中，另外的治疗剂目前用于 治疗肌营养不良。在其他实施方案中，另外的治疗剂也可用于治疗其 他疾病或病症。在一些实施方案中，已知的治疗剂根据其标准或批准 的给药方案和/或时间表施用。在一些实施方案中，已知的治疗剂根 据与其标准或批准的给药方案和/或时间表相比改变的方案施用。在 一些实施方案中，这种改变的方案不同于标准的或批准的给药方法， 在于一个或多个单位剂量的量被改变(例如，减少或增加)，和/或在于 给药频率被改变(例如，在于单位剂量之间的一个或多个时间间隔扩 大，从而导致更低的频率，或单位剂量之间的一个或多个时间间隔减 小，从而导致更高的频率)。
实施例
[0280]
实施例1.高亲和力抗flt-1抗体的产生和表征
[0281]
抗体的产生
[0282]
使用美洲驼单克隆抗体方法产生针对可溶性flt-1的单克隆抗 体。简言之，用重组人可溶性flt-1(购自abcam)免疫美洲驼并收集 血清。
[0283]
抗体表征
[0284]
将结合至人和小鼠flt-1的抗体进一步针对1)vh家族；2)对flt-1 的亲和力；3)ic50；4)通过biacore测定进行的解离速率筛选；5)与食 蟹猴flt-1的交叉反应性以及6)与vegf r2和vegf r3的结合进行 表征。如表4中所示，对针对人flt-1(hfl-1)和小鼠flt-1(mflt-1)的候 选抗体进行表征。
[0285]
表4.
[0286][0287]
通过静脉内施用10mg/kg的每种抗体，在小鼠中研究抗体13b4 和10g12的药代动力学性质(表5)。数据证明，超过288小时不能检 测到抗体10g12，而抗体13b4可在672小时检测到(图1a-1b)。
[0288]
表5.
[0289][0290]
抗体的体内功效
[0291]
通过在4周龄开始每周两次持续一个月静脉内施用来用20mg/kg 抗体13b4或抗体10g12处理mdx小鼠(即杜氏肌营养不良的小鼠模 型)。将对照小鼠用仅媒介物、不结合至flt-1的同种型对照抗体或称 为flt-1:vegf拮抗剂的商业抗flt-1抗体(angio proteomie，目录号 ap-mab0702)处理。为了评估在谷值暴露点处的血清抗体浓度，在 第五个静脉内剂量后4天收集血液。为了评估在峰值暴露点处的血清 抗体浓度，在最后一个剂量后24小时收集血液。抗体13b4和10g12 的峰值和谷值浓度在图2a和2b中示出。在峰值和谷值暴露时间点 处血液中游离抗体13b4和游离抗体10g12的浓度高于同种型对照抗 体和商业对照抗体的浓度。
[0292]
为了评估血清游离sflt-1水平和vegf水平，在第五个静脉内剂 量后24小时和处死前收集血液。与同种型对照抗体相比，抗体13b4 和抗体10g12以及商业对照抗体的施用显著降低了sflt-1的血清浓度 (p《0.0001)(图3)。与同种型对照抗体相比，施用抗体13b4和抗体 10g12产生vegf血清水平的显著增加(p《0.001)(图4)。与同种型对 照抗体相比，商业对照抗体的施用也产生vegf的血液水平的显著增 加(p《0.05)(图4)。
[0293]
组织病理学
[0294]
在30天处理期结束时处死小鼠，并收集膈肌和胫骨前肌(ta)肌 肉，并切片以确定抗flt-1抗体是否诱导骨骼肌中的血管生成。用内 皮细胞标志物cd31对肌肉切片进行染色。与用同种型对照抗体处理 的小鼠的膈肌相比，在用抗体13b4、10g12或商业对照抗体处理的 小鼠的膈肌中观察到毛细血管密度的显著增加(图5a-5d)。使用如图 6a-6b中所示的自动定量成像软件量化数据。与用同种型对照抗体处 理的小鼠的膈肌相比，用商业对照抗体(p《0.05)、抗体13b4(p《0.01) 和抗体10g12(p《0.0001)处理的小鼠的膈肌中的cd31阳性
r2 受体的磷酸化的挽救百分比。单克隆抗体通过拮抗可溶性flt-1来挽 救细胞活化(即磷酸化)(图9)。
[0306]
实施例3.通过轻链改组产生的高亲和力抗flt-1抗体的表征
[0307]
进行实施例2中描述的抗体18b6、11a11和13b4的轻链改组以 提高候选抗体的亲和力和效力。
[0308]
抗体表征
–
与靶标结合
[0309]
所得到的抗体展现对flt-1抗原的增加的亲和力。例如，抗体21c6 的kd比亲本抗体11a11的kd增加大约10倍。类似地，抗体21b3 的kd比亲本抗体13b4的kd增加大约5倍(表7)。
[0310]
表7.
[0311][0312]
抗体表征
–
竞争/拮抗作用
[0313]
为了估计抗体的效力，在轻链改组后，使用人sflt-1和vegf在 竞争elisa中测定抗体。所测试的抗体浓度在0.2mg/ml至200 ng/ml的范围内。将亲本抗体13b4竞争性地结合sflt-1的能力与通 过轻链改组产生的抗体的能力进行比较。所有抗体都证明了对vegf 与人sflt-1的结合的剂量依赖性抑制，其中克隆21b3是最有效的竞 争者(图10)。
[0314]
体内功效
[0315]
为了确定轻链改组抗体的血清半衰期和药代动力学特征，向小鼠 施用单个10mg/kg剂量的轻链改组抗体27h9和21b3以及亲本抗体 13b4(各自用i
125
标记)。在0.083、0.25、0.5、1、4、8和24小时以 及在3、5、7、14、21和28天收集血清，并且测定抗体的血清浓度。 与亲本抗体相比，血清半衰期在轻链改组抗体中降低(图11)。然而， 轻链改组抗体显示与亲本相比改进的药效学特征。例如，抗体27h9 到0.083小时达到222.4ug/ml的最大浓度，而亲本抗体13b4到0.5 小时达到217ug/ml的最大浓度(表8)。
[0316]
表8.
[0317][0318]
组织病理学
[0319]
为了确定轻链改组抗体和亲本抗体是否能够诱导内皮细胞增殖， 通过静脉内施用每两周一次持续4周用20mg/kg抗体处理mdx小鼠。 在处理期结束时处死小鼠，并收集膈肌和胫骨前肌肌肉，并切片以确 定所述抗体是否诱导骨骼肌中的血管生成。用内皮细胞标志物cd31 对肌肉切片进行染色。与用同种型对照抗体处理的小鼠的膈肌相比， 在用抗体13b4和21b3处理的小鼠中观察到膈肌中的毛细血管密度 的显著增加(图12a-12c)。此外，与来自用同种型对照抗体处理的小 鼠的胫骨前肌肌肉相比，来自用轻链改组抗体21b3处理的小鼠的胫 骨前肌中的毛细血管密度显著增加(图12d-12f)。
[0320]
使用
125
i标记的抗体测定抗体27h9、13b4和21b3在膈肌、胫 骨肌和腓肠肌中的生物分布。膈肌在所述时间过程内对所有抗体显示 最高暴露(图13a-13c)。
[0321]
这些研究证明，向mdx小鼠施用flt-1抗体(即13b4和21b3)产 生内皮细胞增殖的显著增加。
[0322]
实施例4.高亲和力抗flt-1抗体21b3的体内功效
[0323]
通过在4周龄时开始一周两次静脉内施用持续一个月用1、3、 10或20mg/kg抗体21b3或20mg/kg同种型对照抗体处理mdx小鼠。 为了评估在谷值暴露点处的血清抗体浓度，在第五个静脉内剂量后4 天收集血液。为了评估在峰值暴露点处的血液抗体浓度，在最后一个 剂量后24小时收集血液。抗体21b3和同种型对照抗体的峰值和谷值 血清浓度在图14a和14b中示出。抗体21b3的峰值和谷值水平是剂 量依赖性的且高于同种型对照抗体。
[0324]
为了评估游离sflt-1的血清水平，在第0天、第14天和第28天 收集血液。施用抗体21b3诱导无血清sflt-1水平的剂量依赖性降低。 如在第14天和第28天观察到，在10和20mg/kg剂量下反应更持久。 然而，与用单独媒介物处理的小鼠中的游离sflt-1水平相比，观察到 在3、10和20mg/kg剂量下的游离sflt-1水平的统计上显著的降低(图 15)。
[0325]
为了评估vegf的血清水平，在第0天、第14天和第28天收集 血液。施用抗体21b3诱导血清vegf水平的剂量依赖性增加。如对 于游离sflt-1水平所观察到的，在10和20mg/kg剂量下且在第14 天和第28天时，反应更持久。事实上，与用单独媒介物处理的小鼠 中的血清vegf水平相比，在10和20mg/kg剂量的抗体21b3下观 察到血清vegf的统计上显著的增加(图16)。
[0326]
组织病理学
[0327]
在30天处理期结束时处死小鼠，并收集膈肌和胫骨前肌肌肉， 并切片以确定抗flt-1抗体是否诱导骨骼肌中的血管生成。针对内皮 细胞标志物cd31对肌肉切片进行染色。与用同种型对照抗体处理的 小鼠的膈肌中的毛细血管密度相比，观察到用抗体21b3处理的小鼠 的膈肌中的毛细血管密度的显著增加(图17a-17e)。使用如图18中所 示的自动定量成像软件量化数据。与用同种型对照抗体处理的小鼠的 膈肌中的cd31阳性面积相比，在用10mg/kg或20mg/kg处理的小 鼠的膈肌中存在cd31阳性面积的显著增加(p《0.0001)。
[0328]
与用同种型对照抗体处理的小鼠中的胫骨前肌相比，在用抗体 21b3处理的小鼠
中也观察到胫骨前肌中的毛细血管密度的显著增加 (图19a-19e)。使用如图20中所示的自动定量成像软件量化数据。与 用同种型对照抗体处理的小鼠的胫骨前肌中的cd31阳性面积相比， 在用10mg/kg或20mg/kg处理的小鼠的胫骨前肌中存在cd31阳性 面积的显著增加(p《0.0001)。
[0329]
rp-lc/ms表征
[0330]
通过反相液相色谱/质谱法(rp-lc/ms)测定去糖基化的21b3抗 体的分子量(图21a)。在还原反应后，测定轻链和重链的分子量。还 测定了重链的糖基化模式(图21b)。
[0331]
这些结果证明，向mdx小鼠施用flt-1抗体(即21b3)导致内皮细 胞增殖的显著增加以及血清中可溶性flt-1的降低和血清中vegf浓 度的增加。
[0332]
实施例5.人源化高亲和力抗flt-1抗体的表征
[0333]
将实施例3中描述的轻链改组抗体进一步修饰以在cdr区和或 fc效应区中引入序列变异。通过表面等离子体共振方法(例如biacore) 评价这些抗体以确定结合特征(表9)。抗体27h9 ng/naaaa展示对 flt-1的降低大约2倍的结合亲和力。
[0334]
表9.
[0335] ka(1/ms)kd(1/s)rmax(ru)kd(m)chi2实验21b3wt5.4e+051.7e-042923.2e-10290221b3aaa5.2e+051.1e-043052.1e-10371227h9old07/053.5e+057.9e-053062.3e-10235127h9wt23/073.3e+058.4e-053232.6e-10236127h9ng/qg3.7e+051.3e-043153.6e-10280127h9ng/na2.9e+051.1e-042983.9e-10158127h9ng/na2.9e+051.5e-042405.1e-1096.4227h9ng/naaaa2.9e+051.5e-042365.1e-1072.52
[0336]
还在基于细胞的测定中评价了抗体通过拮抗sflt-1来挽救细胞活 化的能力。在sflt-1和单克隆抗体存在下，用vegf刺激人原代静脉 内皮细胞(huvec)。通过确定vegf r2受体的磷酸化状态来测定 vegf诱导的细胞活化。单克隆抗体通过拮抗可溶性flt-1挽救细胞 活化(即，磷酸化)(图22a)，并且抗体27h9 ng/naaaa(na+aaa) 与未突变的亲本抗体(wt)相比具有相似的效力。
[0337]
实施例6.抗体优化
[0338]
对候选抗体进行分析以鉴定最接近的人vh和vl种系序列，并 且鉴定cdr内的框架区和氧化/异构化位点内的不同残基。构建含有 人和野生型残基的fab文库，并将其融合至人恒定结构域。应用噬菌 体展示来鉴定具有与亲本抗体21b3相同或更好的解离速率(即无亲 和力丧失)的fab。将具有所需解离速率的fab进行测序并与人种系进 行比较，并且选择具有最高同一性(例如，vh+vl同一性》95％)和同 源性(例如，》96％同源性)的那些以用于转化成人单克隆抗体。还针对 不想要的氨基酸对fab进行了分析。表10提供通过人同一性百分比 排序的fab，其中一些克隆具有达97.6％人同一性和98.8％同源性。
[0339]
表10.
[0340][0341]
实施例7.抗flt-1单克隆抗体的表征
[0342]
使用biacore方法分析单克隆抗体的耐热性。在100μg/ml的浓 度下，将每种单克隆抗体在不同温度下在磷酸盐缓冲盐水中孵育1小 时。在孵育1小时后，将抗体在两小时内缓慢冷却至25℃，然后在4℃ 下孵育过夜。然后通过biocore测定与人flt-1的结合来测量功能性抗 体的百分比(参见表11)。野生型抗体的耐热性与先前实验一致。然而， 除了27h6 dg/da克隆之外，vh或vl区中的突变使解链温度降低 大约2℃。fc区中的aaa突变对抗体的耐热性没有影响。
[0343]
表11.
[0344][0345]
通过biacore对人源化克隆的结合亲和力进行了分析(表12)。在 vegf:sflt-1基于细胞的测定中测定了抗体27h4、27h6和27h9挽救 vegf信号传导的能力(图22b)。简言之，在sflt-1和单克隆抗体27h4、 27h6和27h9存在下，用vegf刺激人原代静脉内皮细胞(huvec)。 通过确定vegf r2受体的磷酸化状态来测定vegf诱导的细胞活化。 在单独sflt-1(例如没有抗flt-1抗体)存在下，数据被表示为相对于 vegf r2受体的磷酸化，vegf r2受体的磷酸化的挽救百分比。还 通过elisa测定了抗体27h4、27h6和27h9拮抗vegf和sflt-1的 结合的能力(图23)。
[0346]
表12.
[0347] ka(1/ms)kd(1/s)rmax(ru)kd(m)21b35.4e+051.7e-042923.2e-1027h43.4e+058.2e-053052.5e-1027h93.3e+058.4e-053232.6e-1027h69.1e+051.4e-044361.6e-10
[0348]
实施例8.抗flt-1抗体对肌肉病理学的体外研究
[0349]
通过在3周龄开始一周两次持续6或12周静脉内施用来用1、3 或10mg/kg的抗flt-1抗体21b3或10mg/kg的igg1同种型对照抗 体处理mdx小鼠。
[0350]
为了评估游离抗体浓度的血清水平，在第2、第4、第7和第10 周施用的静脉内剂量后4天从小鼠中收集血液。在最后一次剂量后 24小时收集处死样品(图24)。在10mg/kg剂量下，相对于接受同种 型对照抗体的小鼠中游离抗体的血清水平，在所有时间点游离抗体的 血清水平均存在统计上显著的差异。在3mg/kg剂量下，相对于接受 同种型对照抗体的小鼠中游离抗体的血清水平，在第4周、第7周和 第10周和在处死时游离抗体的血清水平均存在统计上显著的差异。 在1mg/kg剂量下，相对于接受同种型对照抗体的小鼠中游离抗体的 血清水平，在处死时游离抗体的血清水平存在统计上显著的差异。
[0351]
为了评估游离sflt-1的血清水平，在第2、第4、第7和第10周 施用的静脉内剂量后4天从小鼠中收集血液。在最后一次剂量后24 小时收集处死样品(图25)。在10mg/kg剂量下，相对于接受同种型 对照抗体的小鼠中游离sflt-1的血清水平，在所有时间点游离sflt-1 的血清水平均存在统计上显著的差异。在3mg/kg剂量下，相对于接 受同种型对照抗体的小鼠中游离sflt-1的血清水平，在第4周、第7 周和第10周和在处死时游离sflt-1的血清水平均存在统计上显著的 差异。在1mg/kg剂量下，相对于接受同种型对照抗体的小鼠中游离 sflt-1的血清水平，在处死时游离sflt-1的血清水平存在统计上显著 的差异。
[0352]
为了评估vegf的血清水平，在第2、第4、第7和第10周施用 的静脉内剂量后4天从小鼠中收集血液。在最后一次剂量后24小时 收集处死样品(图26)。施用抗体21b3诱导血清vegf水平的剂量依 赖性增加。在10mg/kg剂量下，相对于接受同种型对照抗体的小鼠 中vegf的血清水平，在所有时间点vegf的血清水平均存在统计 上显著的差异。在3mg/kg剂量下，相对于接受同种型对照抗体的小 鼠中vegf的血清水平，在第7周和在处死时vegf的血清水平均 存在统计上显著的差异。在1mg/kg剂量下，相对于接受同种型对照 抗体的小鼠中vegf的血清水平，在处死时vegf的血清水平存在 统计上显著的差异。
[0353]
组织病理学
[0354]
在处理期的第6周和第12周处死小鼠，并收集膈肌、腓肠肌和 胫骨前肌，并且切片以确定用抗flt-1抗体处理是否诱导血管生成并 阻止骨骼肌中的纤维化和坏死。
[0355]
血管生成
[0356]
针对内皮细胞标志物cd31对肌肉切片进行染色(图27a-27h、 28a-28h和29a-29h)。与用同种型对照抗体处理的小鼠的肌肉相比， 在用抗体21b3处理的小鼠中研究的所有肌肉群中观察到毛细血管密 度的显著增加。使用自动定量成像软件量化数据。与用同种型对照抗 体处理的小鼠的膈肌中的cd31阳性面积相比，用3mg/kg(p《0.01) 和10mg/kg(p《0.0001)的抗体21b3处理的小鼠在第6周和第12周时 的膈肌中存在cd31阳性面积的统计上显著的增加。与用同种型对照 抗体处理的小鼠的腓肠肌中的cd31阳性面积相比，用10mg/kg抗 体21b3处理的小鼠在第6周和第12周时的腓肠肌中存在cd31阳性 面积的统计上显著的增加(p《0.05)。与用同种型对照抗体处理的小鼠 的胫骨前肌肌肉中的cd31阳性面积相比，用3mg/kg的抗体21b3 处理的小鼠在第6周(p《0.05)和第12周(p《0.0001)时和用10mg/kg (p《0.0001)的抗体21b3处理的小鼠在第6周和第12周时的胫骨前肌 中存在cd31阳性面积的统计上显著的增加。(图30a-30c)。
[0357]
纤维化
[0358]
还将肌肉的切片通过免疫组织化学针对i型胶原蛋白染色(图 31a-31h、32a-32h和33a-33h)。与用同种型对照抗体处理的小鼠 的膈肌和腓肠肌相比，在用抗体21b3处理的小鼠的膈肌和腓肠肌中 观察到i型胶原蛋白染色的显著减少。与用同种型对照抗体处理的小 鼠的膈肌中的i型胶原蛋白染色相比，用1mg/kg(p《0.0001)、3mg/kg (p《0.001)和10mg/kg(p《0.0001)的抗体21b3处理的小鼠在12周时的 膈肌中的i型胶原蛋白染色中存在统计上显著的减少。与用同种型对 照抗体处理的小鼠的腓肠肌中的i型胶原蛋白染色相比，用1mg/kg (p《0.01)、3mg/kg(p《0.05)和10mg/kg(p《0.001)的抗体21b3处理的 小鼠在12周时的腓肠肌中的i型胶原蛋白染色中存在统计上显著的 减少。(图34a-34c)。
[0359]
坏死
[0360]
相对于用同种型对照抗体处理的小鼠的腓肠肌中存在的坏死百 分比，确定用21b3抗体处理的小鼠的腓肠肌中存在的坏死百分比。 观察到坏死改善的趋势(图35a-35b)。
[0361]
实施例9.由抗flt-1抗体21b3和21c6靶向的人sflt-1上的表 位的定位
[0362]
通过氢氘交换(hdx)质谱法建立了由抗人sflt-1单克隆抗体 (mab)21b3和21c6靶向的人sflt-1上的肽水平表位。
[0363]
胃蛋白酶消化和lc-ms
[0364]
对于胃蛋白酶消化，将10μg的sflt-1或sflt-1和抗体(21b3)混 合物(10μg:20μg)或sflt-1和抗体(21c6)混合物(10μg:20μg)在0.365mtcep和1.7m盐酸胍(ph 2.5)中变性。将混合物进行在线胃蛋白酶消 化，并使用由联接至microtof-q2质谱仪(bruker)的waters acquityuplc组成的uplc-ms系统分析所得到的肽。将肽在50mm x 1mmc8柱上用5％-28.5％溶剂b(0.1％在乙腈中的甲酸)的19分钟梯度分 离。溶剂a是0.1％在水中的甲酸。将溶剂混合阀、注射阀、c8柱和 所有连接不锈钢管浸入维持在0℃下的冷冻循环水浴中。通过用 mascot针对sflt-1序列搜索ms/ms数据进行肽鉴定。前体和产物离 子的质量容差分别是0.1da和0.2da。
[0365]
去糖基化处理
[0366]
将200μg的人sflt-1重组蛋白与10μl的pngase f在37℃下一 起孵育4小时。
[0367]
fab制备
[0368]
使用pierce fab制备试剂盒用木瓜蛋白酶消化和蛋白a捕获从两 种抗sflt-1 mab(21b3和21c6)制备fab。
[0369]
尺寸排阻色谱法(sec)
[0370]
为了检查sec上天然或去糖基化的人sflt-1与两种抗人sflt-1mab(21b3和21c6)之间的结合，将10μg的sflt-1(天然的或去糖基 化的)与40μg的抗sflt-1 mab混合。将单独天然或去糖基化的sflt-1、 单独抗sflt-1 mab或所述复合物以0.35ml/分钟的流速注入至pbs作 为流动相的sec柱并在280nm下监测蛋白质。由抗sflt-1 mab(21b3 和21c6)产生的fab以及抗sflt-1 fab与sflt-1之间的结合也使用sec 进行评估。
[0371]
hdx
[0372]
将10μl人sflt-1(10μg)或sflt-1和mab(21b3)混合物(10μg:20 μg)或sflt-1和mab(21c6)混合物(10μg:20μg)与90μl氧化氘标记 缓冲液(50mm磷酸盐、100mm氯化钠，ph7.4)一起孵育0秒、30 秒、2分钟、10分钟、1小时或4小时。通过加入100μl的3.4m盐 酸胍、0.73m tcep缓冲液(最终ph为2.5)淬灭氘交换，且然后进行 上述胃蛋白酶消化和lc-ms分析。在仅ms模式下记录质谱。使用 hdexaminer软件(sierraanalytics,ca)对原始ms数据进行处理。使 用氘代肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差计算氘水平。
[0373]
结果
[0374]
为了验证聚糖除去不会改变人sflt-1与抗体的结合，将天然和去 糖基化的sflt-1蛋白与抗人sflt-1 igg(21b3和21c6)混合，并且在尺 寸排阻色谱上监测复合物形成。数据证明天然人sflt-1完全结合至两 种抗人sflt-1 igg(21b3和21c6)，而去糖基化的人sflt-1不完全结合 至抗人sflt-1 mab(21b3)或不结合至抗人sflt-1 mab(21c6)，这表明 去糖基化扰乱了人sflt-1与所述抗体之间的相互作用。因此，选择天 然人sflt-1来进行hd
交换实验。由于非均匀糖基化和12个n-连接 的糖基化位点的高复杂性，所以对于天然人sflt-1初始显示较差序列 覆盖率。为了提高序列覆盖率，鉴定了每个糖基化位点处的聚糖质量， 并对于天然人sflt-1实现了高序列覆盖率(85.2％)。
[0375]
将天然人sflt-1单独或与抗人sflt-1 mab(21b3)或抗人sflt-1mab(21c6)的复合物在氧化氘中孵育。氘交换在室温下进行0秒、30 秒、2分钟、10分钟、60分钟和240分钟。通过低ph淬灭交换反应， 并且用胃蛋白酶消化蛋白质。从lc-ms上的质量偏移监测在鉴定的 肽处的氘水平。绘制所有肽的交换时间内的氘积累曲线。虽然大多数 人sflt-1肽在有或无抗人sflt-1 mab(21b3和21c6)情况下展现相同或 相似的氘水平，但是在mab 21b3或mab 21c6结合时，若干肽区段 具有显著降低的氘并入。残基117-129(对应于seq id no:90的氨基 酸141-153)和169-182(对应于seq id no:90的氨基酸193-206)在结 合至抗人sflt-1 mab 21b3时经历了强氘保护，而残基106-114(对应 于seq id no:90的氨基酸130-138)和117-124(对应于seq id no:90 的氨基酸141-148)在结合至人sflt-1 mab 21c6时经历了强氘保护。 这些强保护区被指定为抗人sflt-1 mab(21b3和21c6)的表位肽，并 在图36和图37中所示的差示热图中以蓝色突出显示。含有来自表位 区域的氨基酸残基的鉴定肽的ms/ms光谱在图38a-38e中示出。肽 115-124对应于seq id no:90的氨基酸139-148；肽115-129对应于 seq id no:90的氨基酸139-153；肽154-182对应于seq id no:90 的氨基酸178-206；肽175-180对应于seq id no:90的氨基酸 119-204；并且肽104-114对应于seq id no:90的氨基酸128-138。
[0376]
结论
[0377]
对于人sflt-1实现了85.2％的序列覆盖率。残基117-129和 169-180在结合至抗人sflt-1 mab 21b3时经历了强氘保护，而残基 106-114和117-124在结合至抗人sflt-1 mab 21c6时经历了强氘保 护。这些强保护区域被指定为相应抗人sflt-1 mab的表位肽。
[0378]
等效案和范围
[0379]
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文 所述的发明的具体实施方案的许多等效案。本发明的范围不意图限于 以上描述，而是如以下权利要求书中所阐述。
[0380]
表13.
[0381]
[0382]
[0383][0384]
表14.
[0385]