一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒及其应用的制作方法

一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒及其应用。


背景技术：

2.微生物次级代谢产物是临床上广泛应用的各类抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物、免疫抑制剂等药物的重要来源。由于微生物基因组的复杂性，除了生长繁殖相关的必须基因外，基因组中还存在着众多次级代谢生物合成基因簇。但有很多次级代谢生物合成基因簇处于沉默状态，甚至属于冗余基因，其存在会与目标产物的生物合成产生竞争，它的表达会消耗大量初级代谢产生的能量和前体，并且还会导致杂质的产生，降低目标产物的产量并且为分离与纯化增加难度。因此对微生物细胞进行工程设计，去除冗余的大片段基因，以高效合成高附加值的天然产物已受到越来越多的关注。
3.传统基因组简化的方法包括同源重组、双链断裂修复重组、位点特异性重组、转座重组，但它们都或多或少存在基因编辑工具构建复杂、在基因组上残留片段无法实现无痕敲除、基因删减存在不确定性等问题。crispr/cas9系统，是目前应用较为广泛的高效、简便、能对基因组进行定点编辑的新技术，该系统只需cas9蛋白、crrna和tracrrna连接而成的sgrna参与。crispr/cas9系统能够对基因进行高效编辑，利用同源重组修复的方式能实现基因无痕敲除。
4.万古霉素是目前临床上治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)感染的首选药物，还应用于治疗对所有抗生素均无效的严重感染，在临床治疗中具有重要意义。a.keratiniphila hccb10007是经过物理、化学方法诱变选育而来的万古霉素高产菌株，基因组包含一个环状染色体、一个环形内源性质粒。染色体基因组全长8,948,591bp，gc含量69％，通过对其进行生物信息分析，预测到在基因组中存在至少26个次级代谢生物合成基因簇。虽然crispr/cas9系统已成功地应用于大肠杆菌、酿酒酵母菌、肺炎链球菌、链霉菌等微生物，在链霉菌中进行大片段基因编辑也有较高效率，a.keratiniphila hccb10007虽然同属于放线菌，但与链霉菌相比，其基因组结构更加复杂，次级代谢产物网络更加庞大，在该菌株上应用crispr/cas9技术进行大片段基因敲除仍然具有极大挑战性。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒。本发明的第二个目的在于提供一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒的构建方法。本发明的第三个目的是提供一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。本发明的第四个方面是提供一种用于敲除a.keratiniphila hccb10007大的片段基因的双sgrna。本发明的第五个方面是提供一种敲除a.keratiniphila hccb10007上的大片段基因
后用于同源重组修复的上下游同源臂。本发明的第六个方面是提供一种敲除大片段基因的a.keratiniphila hccb10007突变菌株。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.作为本发明的第一个方面，一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒，包括用于敲除a.keratiniphila hccb10007大的片段基因的双sgrna和敲除a.keratiniphila hccb10007上的大片段基因后用于同源重组修复的上下游同源臂，所述双sgrna的序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述用于同源重组修复的上下游同源臂是以a.keratiniphila hccb10007基因组为模板，分别用seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9、seq id no.10所示的引物进行pcr扩增，并进行测序验证获得。
8.根据本发明，所述的crispr/cas9编辑质粒，其是通过如下步骤构建获得：
9.步骤一、使用hind iii酶切plyny04质粒，获得酶切后的载体；将酶切后的线性化载体与所述的上下游同源臂采用overlap重组的方式进行连接以获得骨架质粒；
10.步骤二、使用speⅰ酶切骨架质粒，获得线性化骨架载体；将如seq id no.3和seq id no.4所示的两条oligo退火连接形成双链sgrna-1，将如seq id no.5和seq id no.6所示的两条oligo退火连接形成双链sgrna-2，然后将线性化骨架载体分别与双链sgrna-1和双链sgrna-2采用overlap重组的方式进行连接，获得含有单一sgrna-1的编辑质粒和含有单一sgrna-2的编辑质粒；
11.步骤三、使用xbai酶切含有单一sgrna-1的编辑质粒，获得线性化sgrna-1载体；以含有单一sgrna-2的编辑质粒为模板，用如seq id no.11和seq id no.12所示的引物利用pcr的方法扩增含有erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段；然后将erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段与含有单一sgrna-1的编辑质粒的线性化sgrna-1载体进行连接，采用overlap重组的方式，获得含有双sgrna的编辑质粒phmyeco4-26，并测序验证。
12.作为本发明的第二个方面，一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒的构建方法，包括如下步骤：
13.步骤一、以a.keratiniphila hccb10007基因组为模板，分别用seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9、seq id no.10所示的引物进行pcr扩增，获得用于同源重组修复的上下游同源臂；
14.步骤二、使用hind iii酶切plyny04质粒，获得酶切后的载体；然后将酶切后的线性化载体与扩增得到的上下游同源臂采用overlap重组的方式进行连接以获得骨架质粒；
15.步骤三、使用speⅰ酶切骨架质粒，获得线性化骨架载体；将如seq id no.3和seq id no.4所示的两条oligo退火连接形成双链sgrna-1，将如seq id no.5和seq id no.6所示的两条oligo退火连接形成双链sgrna-2，然后将线性化骨架载体分别与双链sgrna-1和双链sgrna-2采用overlap重组的方式进行连接，获得含有单一sgrna-1的编辑质粒和含有单一sgrna-2的编辑质粒；
16.步骤四、使用xbai酶切含有单一sgrna-1的编辑质粒，获得线性化sgrna-1载体；以含有单一sgrna-2的编辑质粒为模板，用如seq id no.11和seq id no.12所示的引物利用pcr的方法扩增含有erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段；然后将erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段与含有单一sgrna-1的编辑质粒的线性化sgrna-1载体进行连接，采用overlap重组的方式，获得含有双sgrna的编辑质粒phmyeco4-26，并测序验证。
17.根据本发明，步骤一还包括对扩增产物进行纯化：将扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，获取相应大小片段的产物进行胶回收，得到纯化的前后同源臂，并进行测序验证。
18.作为本发明的第三个方面，一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。
19.根据本发明，所述水解角蛋白拟无枝酸菌包括a.keratiniphila hccb10007。
20.根据本发明，所述的应用，其是将验证正确的含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒转入e.coli jm110去甲基化处理，然后电转化入a.keratiniphila hccb10007感受态中。
21.作为本发明的第四个方面，一种用于敲除a.keratiniphila hccb10007大的片段基因的双sgrna，其序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
22.作为本发明的第五个方面，一种敲除a.keratiniphila hccb10007上的大片段基因后用于同源重组修复的上下游同源臂，其是以a.keratiniphila hccb10007基因组为模板，分别用seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9、seq id no.10所示的引物进行pcr扩增，并进行测序验证获得。
23.作为本发明的第六个方面，一种敲除大片段基因的a.keratiniphila hccb10007突变菌株，其是采用所述的含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒敲除糖苷聚酮类次级代谢产物eco-0501生物合成基因簇上的87.5kb的大片段基因后获得的突变菌株，所述大片段基因的具体位置为eco-0501生物合成基因簇上的aori_2930-aori_2954。
24.根据本发明，所述的敲除大片段基因的a.keratiniphila hccb10007突变菌株，其是采用所述的含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒敲除糖苷聚酮类次级代谢产物eco-0501生物合成基因簇中的大片段基因后得到的突变菌株。
25.作为本发明的第七个方面，一种含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒敲除后的突变菌株的鉴定方法，包括如下步骤：
26.步骤一、将单菌落接种至含有安普霉素的培养基中进行抗性筛选；
27.步骤二、采用菌液pcr扩增，设计如seq id no.13和seq id no.14所示的内侧引物以及如seq id no.15和seq id no.16所示的外侧引物进行验证，并通过凝胶电泳检测；
28.步骤三、将以内、外侧引物pcr验证均正确的突变菌株的基因组dna为模板，用seq id no.15和seq id no.16扩增得到的pcr产物进行测序验证。
29.本发明的有益效果是：本发明首次实现了在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行80kb以上大片段基因的精准敲除，且构建的含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒有效提升了基因敲除效率，简化基因工程操作，为后续菌株的基因组简化奠定良好基础。
附图说明
30.图1为两个sgrna设计位点在a.keratiniphila hccb10007菌株eco-0501基因簇上的位置。
31.图2(1)和图2(2)分别为实施例3中合成的分别含有单条sgrna-1和sgrna-2的编辑质粒的结构示意图。
32.图3为实施例3中合成的含有双sgrna的编辑质粒phmyeco4-26的结构示意图。
33.图4为实施例5中用于验证转化子是否实现基因敲除的，上图为引物verify-inside-f/r的设计位点；下图为使用引物verify-inside-f/r对转化子进行pcr验证的结果；其中，编号1-7为不同的转化子，con为a.keratiniphila hccb10007(阴性对照)，m为1kb dna ladder marker(1kb dna分子量梯度标尺)。不能扩增出目标条带(1491bp)则证明基因已被敲除。
34.图5为引物verify-inside-f/r验证正确的3号和5号转化子使用verify-outside-f/r引物进行二次验证，上图为引物设计位点示意图；下图为使用引物verify-outside-f/r对转化子进行pcr验证的结果；其中，编号3、5为待验证转化子，con为a.keratiniphila hccb10007(阴性对照)，m为1kb dna ladder marker(1kb dna分子量梯度标尺)。如能扩增出目标条带(6777bp)则证明基因已被敲除。
35.图6为实施例5中pcr验证正确的突变菌株的测序结果。
36.图7为实施例7中阳性突变菌的发酵产物hplc检测结果，箭头所示为eco-0501产物峰位置。
具体实施方式
37.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
38.以下实施例所用的试剂及质粒来源：
39.1、质粒plyny04采用中国专利申请文献cn109609537a的方法构建。为本实验室构建。
40.2、e.coli dh5α和e.coli jm110均为市售品；
41.3、水解角蛋白拟无枝酸菌a.keratiniphila hccb10007保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc no.6023。
42.实施例1 用于靶向敲除的sgrna设计
43.步骤一、选定的敲除片段为位于a.keratiniphila hccb10007菌株的eco-0501生物合成基因簇上87.5kb大小的片段，具体位置为aori_2930-aori_2954。
44.步骤二、使用sgrna在线设计工具cctop-crispr/cas9 target online predictor，基于待敲除片段进行sgrna片段设计及筛选，两个sgrna序列为：
45.sgrna-1:actcgggatctcctgacttg(pam:ggg)，(seq id no.1)；
46.sgrna-2:caaaggacagaaaagaaagg(pam:tgg)，(seq id no.2)。
47.步骤三、合成对应的寡核苷酸片段(小写部分为与载体连接时的同源臂)
48.sgrna-1 oligo-f:atttctagctctaaaaccaagtcaggagatcccgagtactagttcctaccaaccggcacg，(seq id no.3)；
49.sgrna-1 oligo-r:cgtgccggttggtaggaactagtactcgggatctcctgacttggttttagagctagaaat，(seq id no.4)；
50.sgrna-2 oligo-f:atttctagctctaaaaccctttcttttctgtcctttgactagttcctaccaaccggcacg，(seq id no.5)；
51.sgrna-2 oligo-r:cgtgccggttggtaggaactagtcaaaggacagaaaagaaagggttttagag
ctagaaat，(seq id no.6)。
52.步骤四、将sgrna1和sgrna2的两条oligo分别退火连接形成双链，用于后续与载体进行连接，反应条件：95℃水浴5min，随后自然冷却至室温；反应体系如表1所示：
53.表1 反应体系
54.oligo-f(10μm)5μloligo-r(10μm)10μlt4 ligase buffer(t4连接酶缓冲液)10μlddh2o25μltotal50μl
55.实施例2 基因敲除后用于同源重组修复的上下游同源臂的合成
56.步骤一、以a.keratiniphila hccb10007基因组序列为模板，设计并合成扩增引物：
57.arm-af:acgacggccagtgccaagcttccggatacaccaagagcacatca，(seq id no.7)；
58.arm-ar:acgggcgatcttgccgaggagcctagaggac，(seq id no.8)；
59.arm-zf:tcctcggcaagatcgcccgtcccaccgagcgt，(seq id no.9)；
60.arm-zr:ggtgctttttttgagaagcttggatcaaggcaacctgctgtg，(seq id no.10)。
61.步骤二、以a.keratiniphila hccb10007基因组为模板，分别用seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9、seq id no.10所示的引物进行pcr扩增，反应体系及pcr程序如表2所示(以arm-af和arm-ar进行扩增为例，arm-zf和arm-zr的扩增同表2，将arm-af和arm-ar替换成arm-zf和arm-zr)：
62.表2 反应体系和pcr程序
[0063][0064]
步骤三、扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％，120v，40min)，获取相应大小片段的产物使用试剂盒进行胶回收，得到纯化的片段，获得上下游同源臂。
[0065]
实施例3 含有双sgrna的特异性基因敲除的crispr/cas9编辑质粒的构建
[0066]
步骤一、使用hind iii酶切plyny04质粒，获得酶切后的载体，反应条件：37℃，4h；反应体系如表3所示：
[0067]
表3 反应体系
[0068]
hind iii2.5μl10
×
m buffer5μlplyny042.5μgddh2oxμltotal50μl
[0069]
步骤二、使用胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。
[0070]
步骤三、将酶切纯化后的线性化载体与扩增得到的上下游同源臂进行连接以获得骨架质粒，采用overlap重组的方式，反应条件：37℃反应30min，立刻降至4℃或立即置于冰上冷却；反应体系如表4所示：
[0071]
表4 反应体系
[0072][0073][0074]
备注：每个片段最适使用量＝[0.02
×
片段碱基对数]ng(x，y1，y2均由此计算)。
[0075]
步骤四、连接反应结束后，将10μl重组产物加入到100μl的dh5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激45s，迅速放回冰上2min，随后向离心管内加入700μl无抗lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min，再涂布于加入安普霉素的lb固体平板上，37℃倒置过夜培养。
[0076]
步骤五、长出的单菌落用seq id no.7和seq id no.10引物进行pcr验证，能扩增出相应条带的单菌落，并对其同源臂部分进行测序验证，验证正确即得到骨架质粒。
[0077]
步骤六、使用speⅰ酶切骨架质粒，获得线性化骨架载体，反应条件：37℃，4h；反应体系如表5所示：
[0078]
表5 反应体系
[0079][0080]
步骤七、将线性化骨架载体分别与实施例1的sgrna-1及sgrna-2两条oligo退火连接后的片段进行连接，采用overlap重组的方式，实验方法同本实施例的步骤三所述，获得含有单一sgrna-1的编辑质粒和含有单一sgrna-2的编辑质粒。
[0081]
步骤八、使用xba i酶切含有单一sgrna-1的编辑质粒，获得线性化sgrna-1载体，反应条件：37℃，4h；反应体系如表6所示：
[0082]
表6 反应体系
[0083][0084][0085]
步骤九、以含有单一sgrna-2的编辑质粒为模板，用如seq id no.11和seq id no.12所示的引物利用pcr的方法扩增含有erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段，引物序列如下：
[0086]
sgrna2-f:gcatgcatactagagaatctaaaaaaagcaccgactcg，(seq id no.11)；
[0087]
sgrna2-r:ggaaaactctcagcttctaggattctctagtatgcatg，(seq id no.12)。
[0088]
pcr反应体系及程序如表7所示：
[0089]
表7 pcr反应体系及程序
[0090][0091]
步骤十、将纯化后的erme
*
启动子和sgrna-2的基因片段与线性化sgrna-1载体进行连接，采用overlap重组的方式，实验方法同本实施例的步骤三所述，验证正确的即为含有双sgrna的crispr/cas9编辑质粒phmyeco4-26，结构示意图见图3。
[0092]
实施例4crispr/cas9编辑质粒电转入a.keratiniphila hccb10007
[0093]
步骤一、将构建好的编辑质粒phmyeco4-26转入e.coli jm110进行去甲基化处理：将10μl质粒加入到100μl的jm110感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激45s，迅速放回冰上2min，随后向离心管内加入700μl无抗lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min，再涂布于加入安普霉素的lb固体平板上，37℃倒置过夜培养，长出的单菌落进行液体扩增，并使用试剂盒提取质粒即得到去甲基化phmyeco4-26质粒。
[0094]
步骤二、取2-5μg(体积《6μl)去甲基化phmyeco4-26质粒加入60μl的a.keratiniphila hccb10007感受态细胞中，轻柔吹吸混匀，立即放入冰预冷的电转杯(btx，φ2mm)中电转化条件：600ω，25μf，7.5kv/cm，电击时长约13ms。
[0095]
步骤三、电转化后用1ml tsb培养基重悬菌体，转移至15ml试管中，在恒温培养箱振荡培养7小时，28℃，220rpm。
[0096]
步骤四、活化后的菌液4000rpm离心2min，弃去900ul上清，剩余菌液重悬后涂布于含有安普霉素的bennet平板培养基上，28℃恒温培养箱培养5天。
[0097]
实施例5突变株的鉴定
[0098]
步骤一、基于a.keratiniphila hccb10007基因组序列，在被敲除基因内部以及外侧设计两对引物用于验证突变株：内侧引物(seq id no.13和seq id no.14)如不能扩增出目标条带(1491bp)则证明基因已被敲除；外侧引物(seq id no.15和seq id no.16)如能扩增出目标条带(6777bp)则证明基因已被敲除，引物序列如下：
[0099]
verify-inside-f:atcctactgtcgggttcatcgg，(seq id no.13)；
[0100]
verify-inside-r:ggtccacctttcttttctgtccttt，(seq id no.14)；
[0101]
verify-outside-f:agtttcctttgacgccatgc，(seq id no.15)；
[0102]
verify-outside-r:tggactctgtctggggtgtg，(seq id no.16)。
[0103]
步骤二、挑选平板上的转化子，接种于3ml含有安普霉素的tsb液体培养基中，在恒温培养箱振荡培养2天，28℃，220rpm。
[0104]
步骤三、转化子菌液分别用内侧引物(seq id no.13和seq id no.14)和外侧引物(seq id no.15和seq id no.16)进行pcr实验，并通过凝胶电泳检测(1％，120v，40min)，结果见4、图5。
[0105]
步骤四、将以内、外侧引物pcr验证均正确的突变菌株的基因组dna为模板，用seq id no.15和seq id no.16扩增得到的pcr产物进行测序验证，经过三重验证正确的即为完成基因敲除的阳性突变菌株，结果见图6。
[0106]
实施例6阳性突变株中crispr/cas9编辑质粒的消除
[0107]
步骤一、阳性突变菌株的菌液在不加抗生素的本氏培养基上划线分离，37℃过夜培养后，挑取单菌落同时涂布于不加抗生素和加入安普霉素的本氏培养基，28℃培养3天，在不加抗生素的平板上正常生长，而在抗性平板上不生长的单菌落即为成功消除质粒的阳性菌株。
[0108]
步骤二、再通过pcr扩增的方式进行确证，使用扩增同源臂的引物seq id no.7和seq id no.8(或seq id no.79和seq id no.10)进行pcr验证，无法扩增出条带即确证质粒消除成果。
[0109]
实施例7突变菌株代谢产物分析
[0110]
步骤一、将出发菌a.keratiniphila hccb10007和基因敲除的突变菌的菌液均匀涂布于高氏1号固体培养基平板上，在28℃恒温培养箱中倒置培养4天，至长满白色孢子；
[0111]
步骤二、用无菌平铲挖取1cm2左右的菌块转接入25ml种子培养基中，于220rpm，28℃摇床中震荡培养48h；
[0112]
步骤三、吸取培养后的种子菌液(总体积的10％)转入25ml发酵培养基f1中，于220rpm，28℃摇床中震荡培养5天；
[0113]
步骤四、取2ml发酵液，12,000rpm离心5min，弃去上清，菌体加入500μl无水乙醇超声30min，浸泡过夜，浸提液进行hplc检测。hplc检测条件如下：
[0114]
流动相配制：用10mm的醋酸胺溶液，醋酸调ph至4.0作为缓冲液。缓冲液与乙腈按45:55的比例混合，摇匀。
[0115]
色谱柱：agilent zorbax sb-c18 column(5μm
×
250mm)；柱温：35℃；检测器：dad(hp1100)检测器；检测波长：360nm；流速：1ml/min；进样量：20μl；洗脱方法：等度洗脱。
[0116]
结果显示，出发菌a.keratiniphila hccb10007中能检测到eco-0501的峰，而基因敲除的突变菌中已检测不到eco-0501产物峰，进一步证明含有双sgrna的crispr/cas9编辑质粒phmyeco4-26成功敲除了eco-0501基因簇上的片段，阻止了eco-0501的合成。
[0117]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。