梅片树倍半萜合酶CbTPS6及其相关生物材料与应用的制作方法

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及一种梅片树萜类合酶cbtps6及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、梅片树(physiolgical type of cinnamomum burmannii)是樟科樟属常绿乔木，富含右旋龙脑((+)-borneol)，是珍稀药材，也是一种高级香料、日化美妆用品原料、化工用品，被广泛应用于医疗、美容、香料等多个行业。中国科学院华南植物园在广东境内发现的一种具有生产利用价值的天然右旋龙脑新资源，填补了我国生产天然右旋龙脑的空白。其挥发油中除右旋等单萜类成分外，还有大量倍半萜成分。其中部分倍半萜类化合物具有显著的药理学活性，例如，梅片树挥发性成分中含有微量的β-榄香烯。β-榄香烯是具有榄香烷骨架的倍半萜，从温莪术的挥发油中分离出的β-榄香烯是我国自行开发研制的抗肿瘤药物榄香烯乳的主要成分。

2、萜类合酶(terpene synthase，tps)是梅片树基因组中一类重要的萜类次生代谢产物合成相关的基因家族。cbtps6是梅片树萜类合酶基因家族中的一员。目前，尚未发现从梅片树可以得到具有β-榄香烯合成能力的关键酶基因的相关研究。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为得到新的参与倍半萜化合物合成的梅片树萜类合酶，以合成或制备β-榄香烯。

2、为解决上述问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为cbtps6，来源于梅片树(physiolgical type of cinnamomum burmannii)，命名为梅片树萜类合酶cbtps6，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

3、a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

4、b)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

5、c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

6、其中，序列2由561个氨基酸残基组成。

7、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

8、上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

9、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

10、上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

11、与cbtps6的相关生物材料也在本发明的保护范围之内。

12、本发明提供的与cbtps6的相关生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：

13、a1)编码cbtps6的核酸分子；

14、a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

15、a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；

16、a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；

17、a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；

18、a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；

19、a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；

20、a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；

21、a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

22、a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

23、a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

24、a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

25、上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下b1)-b5)任一所示：

26、b1)序列表中序列1所示的dna分子；

27、b2)编码序列是序列表中序列1所示的dna分子；

28、b3)序列表中序列4所示的dna分子；

29、b4)编码序列是序列表中序列4所示的dna分子；

30、b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的dna分子杂交，且编码cbtps6的dna分子。

31、其中，序列表中的序列1由1692个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。

32、所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

33、其中，所述核酸分子可以为dna，如cdna、基因组dna或重组dna，所述核酸分子也可以为rna，如mrna或hnrna。

34、上述生物材料中，a2)所述的含有编码cbtps6的核酸分子的表达盒(cbtps6基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达cbtps6的dna，该dna不但可包括启动cbtps6转录的启动子，还可包括终止cbtps6转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

35、上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

36、上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

37、上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

38、本发明进一步提供了上述蛋白质或其相关生物材料的应用。

39、所述应用具体如下所示：

40、1)上述蛋白质作为萜类合酶的应用；

41、2)上述相关生物材料在制备萜类合酶中的应用；

42、3)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成萜类化合物中的应用；

43、4)上述蛋白质或相关生物材料在催化法尼基焦磷酸形成(-)-β-榄香烯中的应用。

44、上述应用中，所述萜类化合物为(-)-β-榄香烯。

45、本发明还提供了制备cbtps6的方法。

46、本发明制备cbtps6的方法，包括将cbtps6的编码基因导入到受体微生物中，得到表达cbtps6的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到cbtps6。

47、上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株transetta(de3)。

48、上述方法中，所述cbtps6的编码基因可通过重组质粒pet32a::cbtps6导入到大肠杆菌表达菌株transetta(de3)中；所述重组质粒pet32a::cbtps6是用序列1所示的cbtps6基因构建至pet32a(+)载体的bamhi酶切位点处，且保持pet32a(+)载体其他序列不变得到的重组表达载体。

49、本发明进一步提供了一种制备(-)-β-榄香烯的方法，所述方法包括用cbtps6催化法尼基焦磷酸(fpp)的步骤。

50、上述方法中，在催化过程中还需要加入酶促缓冲液，所述酶促缓冲液由hepes、mgcl2、dtt组成；

51、所述hepes在所述酶促缓冲液中的浓度为50mm；

52、所述mgcl2在所述酶促缓冲液中的浓度为10mm；

53、所述dtt在所述酶促缓冲液中的浓度为5mm；

54、所述酶促缓冲液中的ph值为7.2。

55、本发明从梅片树cdna中克隆得到cbtps6基因，通过实验证明：本发明的cbtps6蛋白能够催化fpp形成(-)-β-榄香烯，对梅片树中的(-)-β-榄香烯等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，为利用基因工程技术提高梅片树中活性成分(-)-β-榄香烯含量或直接生产(-)-β-榄香烯提供重要基础，进一步对于调节和生产植物萜类化合物及培育高品质的梅片树树具有重要的理论及实际意义。