1.本发明涉及酶制剂和食品技术领域，具体涉及一种高效降解麸质蛋白的多酶复合体及其应用。
背景技术：2.小麦是世界上广泛种植的粮食作物，同时也是fao(1995)报告的八类常见的食入性过敏源之一。它可以引起多种麸质蛋白相关性疾病，其中乳糜泻就是由麸质蛋白引起的一种慢性小肠炎症疾病，在全球的发病率约为1％。乳糜泻已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危及生命，已成为全球性不可回避的食品安全问题之一。
3.乳糜泻尚无特效的治疗方法，唯一可靠的治疗方式是终生严格的无麸质饮食。因此，低致敏的小麦产品的加工制备备受重视。目前，常用的脱敏技术包括物理法、化学法、基因工程法和酶处理法等。物理加工是脱敏常用的方法，但很难有效的降低小麦蛋白的致敏性；由于化学试剂的影响，使得化学方法的使用存在一定的局限性；酶处理法因其高效、环保等优点越来越受到重视。
4.然而麸质蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，使得麸质蛋白难以被彻底水解，而形成能引起乳糜泻的毒性肽，如p31-43和33mer等，故而寻找能高效降解麸质蛋白和麸质蛋白毒性肽的微生物和酶成了研究重点。
技术实现要素：5.针对背景技术中麸质蛋白难以被彻底水解的问题，本发明的目的在于提供一种高效降解麸质蛋白的多酶复合体及其应用。本发明制备的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)多酶复合体能够高效降解麸质蛋白和致乳糜泻肽，对于治疗或预防麸质蛋白相关疾病如乳糜泻具有重要意义。
6.一种高效降解麸质蛋白的多酶复合体，所述多酶复合体是由蜡样芽孢杆菌afa01发酵制得。
7.优选地，所述蜡样芽孢杆菌afa01于2020年11月05日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.21108。
8.优选地，所述高效降解麸质蛋白的多酶复合体制备发酵包括如下步骤：
9.s1：将蜡样芽孢杆菌afa01接种在培养基上，收集菌体并重悬菌体；
10.s2：将s1所得菌体超声，然后加入chaps控制其终含量，静置并离心取上清液；
11.s3：将s2所得菌体裂解液上清液上样至deda ff阴离子交换柱，用nacl进行梯度洗脱，收集活性组分；
12.s4：将s3所得活性组分上样至sephacryl s-300hr柱，洗脱并收集活性组分；
13.s5：将s4得到的麸质蛋白水解活性组分冷冻干燥，即为多酶复合体。
14.优选地，s1所述培养基为scb固体培养基：淀粉10g/l、酪蛋白3g/l、kno
3 2g/l、
nacl 2g/l、k2hpo
4 2g/l、mgso
4 0.05g/l、cacl
2 0.02g/l、feso
4 0.01g/l；ph值为7.2。
15.优选地，s1所述重悬采用ph 7.5-8.5的50mm tris-hcl。
16.优选地，s2所述超声悬浮至冰上进行，超声条件为：频率100-500w、超声总时间10-20min，每间隔2-10s超声1-5s。
17.优选地，s2所述静置为4℃下放置0.5-2h，所述离心为12000g离心10min。
18.优选地，s3所述deda ff阴离子交换柱采用ph 8.5、含0.5％w/v chaps、20mm的tris-hcl缓冲液平衡。
19.优选地，s4所述sephacryl s-300hr柱采用150mm nacl、20mm tris-hcl平衡。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.本发明蜡样芽孢杆菌多酶复合体不但能够水解完整的麸质蛋白，还能够降解致乳糜泻肽，破坏其中的致乳糜泻t细胞表位。该多酶复合体水解蛋白和多肽过程是高度有序的级联催化反应，能更高效的降解麸质蛋白及致乳糜泻肽。因此，本发明多酶复合体制备得酶制剂不仅能作为口服酶制剂辅助人体消化麸质蛋白，用于辅助治疗乳糜泻；还能用于食品加工中，更有效的降解麸质蛋白，有望为乳糜泻患者提供安全可靠的低致敏食品，降低乳糜泻患者的安全风险。
附图说明
22.图1为本发明多酶复合体降解麦醇溶蛋白进程图。
23.图2为蜡样芽孢杆菌多酶复合体降解乳糜泻肽进程图。
24.图3为蜡样芽孢杆菌多酶复合体与黑曲霉an-pep降解33-mer比较图。
25.图4为蜡样芽孢杆菌多酶复合体与黑曲霉an-pep降解33-mer进程图比较图。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.实施例1：蜡样芽孢杆菌多酶复合体的制备
28.(1)在scb固体培养基(淀粉10g
·
l-1
、酪蛋白3.0g
·
l-1
、kno
3 2.0g
·
l-1
、nacl 2.0g
·
l-1
、k2hpo
4 2.0g
·
l-1
、mgso
4 0.05g
·
l-1
、cacl
2 0.02g
·
l-1
、feso
4 0.01g
·
l-1
、ph值7.2)上接种蜡样芽孢杆菌afa01，37℃培养2d，收集菌体，用50mm tris-hcl(ph 8.5)重悬菌体。
29.(2)菌体悬浮至于冰上超声(300w，超声2s，间隔3s，总时间15min)，加入chaps使其终含量达到1.2％(w/v)，4℃放置1h，每10min混匀一次。然后12000g离心10min，取上清，并过0.22μm滤膜。
30.(3)deda ff阴离子交换柱用20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.5，含0.5％w/vchaps)平衡。上样后，用0～0.6m nacl进行梯度洗脱，收集活性组分。
31.(4)sephacryl s-300hr柱用150mm nacl、50mm tris-hcl(ph 7.5)平衡，将(3)得到的活性组分上样至sephacryl s-300hr柱，洗脱并收集活性组分。
32.(5)将(4)得到的麸质蛋白水解活性组分冷冻干燥，即为多酶复合体。
33.(6)将(5)得多酶复合体与辅料混匀，即为多酶复合体酶制剂。
34.实施例2
35.以实施例1所得的多酶复合体进行麦醇溶蛋白的分解实验。
36.麦醇溶蛋白浓度为0.5mg/ml，多酶复合体浓度为0.01mg/ml(0.01
‰
)，酶解条件温度37℃，缓冲液调节ph 7.0。取样测定麦醇溶蛋白变化，检测方法参考刘振宇等发表的《玉米醇溶蛋白检测方法研究》(《现代畜牧科技》，2016年第7期总第19期)。结果见图1，从图中可以发现使用多酶复合体，能在30min内将醇溶蛋白含量降低至5％，120min时醇溶蛋白含量降低至2％以下。
37.实施例3
38.以实施例1所得的多酶复合体进行乳糜泻肽分解实验。
39.乳糜泻肽(33-mer)浓度为0.5mg/ml，多酶复合体浓度为0.005mg/ml，酶解条件温度37℃，缓冲液调节ph 7.0。取样测定33mer降解情况，检测方法参考赵冠华等发表的《应用maldi-tof-ms检测肺鳞癌患者血清多肽并分析其与化疗疗效相关性》(《中国肺癌杂志》，2017年第5期)。结果见图2，从图中可以发现使用多酶复合体，能在5min内将所有的完整33-mer降解，30min时残留的多肽基本都小于9肽，33-mer中致乳糜泻t细胞表位被破坏。
40.实施例4
41.为考察蜡样芽孢杆菌多酶复合体降解乳糜泻肽效果，对比了使用本多酶复合体和商业化的黑曲霉脯氨酸肽链内切酶an-pep对乳糜泻肽降解速率和降解程度差异。
42.乳糜泻肽(33-mer)浓度为2mg/ml，an-pep和多酶复合体浓度均为0.01mg/ml，酶解条件温度37℃，在0、2和4h时取样用反相高效液相检测残留33-mer，检测方法参考钟山等发表的《rp-hplc法测定中药材蚂蟥中蚂蟥多肽的含量》(《分析试验室》,2013第11期)。结果见图3，从图中可以发现多酶复合体降解33-mer速率高于黑曲霉脯氨酸肽链内切酶an-pep，多酶复合体降解33-mer速率是an-pep的1.7倍。33-mer降解程度用maldi-tof-ms检测，检测方法参考赵冠华等发表的《应用maldi-tof-ms检测肺鳞癌患者血清多肽并分析其与化疗疗效相关性》(《中国肺癌杂志》，2017年第5期)。结果见图4，从图中可以发现多酶复合体降解33-mer程度明显高于黑曲霉脯氨酸肽链内切酶an-pep。
43.以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。