鉴定罂粟的SNP分子标记及应用的制作方法

鉴定罂粟的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及分子鉴定技术领域，具体涉及鉴定罂粟的snp分子标记及应用。


背景技术：

2.罂粟(papaver somniferum l.)为罂粟科(papaveraceae)罂粟属(papaver l.)一年生草本植物，与大麻、古柯一同被联合国禁毒公约列为世界三大毒品原植物。罂粟属约100种,我国有7种，分别为罂粟(p.somniferuml.)、鬼罂粟(papaverorientalel.)、虞美人(papaverrhoeasl.)、黑环罂粟(papaverpavoninumfisch.et mey.)、野罂粟(papaver nudic aulel.)、灰毛罂粟(papavercanescensa.tolm.)、长白山罂粟(papaverradicatumrottb.)。罂粟属植物花型丰富，花色艳丽，常被用作观赏植物栽培。由于罂粟与同属植物虞美人、鬼罂粟等在花型、颜色及果实上极为相似，为毒品原植物罂粟的鉴定及相关案件的侦破带来困难。在法庭科学中，虽可通过化学分析法来鉴定罂粟，但它受到植物生长期的限制，且化学检测周期长，操作复杂，对仪器设备要求较高等，增加了公安机关对罂粟案件定性与侦破的难度。
3.近些年，est-ssr标记得到开发并应用于罂粟的鉴定。2018年徐小玉等应用自行设计的1对罂粟种属特异性est-ssr引物对案件中疑似罂粟籽的检材进行鉴定，为案件的定性提供了物证依据。2011年，lee等开发了1对能够较好的应用于本土罂粟与其近缘种的鉴的est-ssr标记引物。2016年，裴黎等人公开了一种罂粟种属特异性遗传标记检测体系，其包含4对鉴定罂粟的引物对组，可同时扩增罂粟4个str基因座。2018年，杨志云通过4对特异性引物实现了罂粟ssr分子标记鉴定。2019年，本研究团队开发了一组包含有3对特异性引物的引物组，可对罂粟及其近缘物种进行有效鉴定。然而，关于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,snp)分子标记在罂粟鉴定方面的报道少之又少。
4.snp主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的dna序列多态性。与其它分子标记相比，snp具有数目多、分布广、遗传稳定、具有代表性等优点，是目前使用较为广泛的分子标记之一。随着测序技术的迅猛发展，罂粟基因组序列得到公布，扩大了snp分子标记的检测范围，为snp标记在罂粟属的研究中应用奠定了基础。由于罂粟在种内存在丰富的遗传变异，因此罂粟的鉴定既要表现其种间的差异性又要兼顾其种内的保守性。snp则可以精确到单个核苷酸的识别，通过dna序列间的细微差异区分不同个体，除此之外它还具有分析速度快、易建立标准化操作，非常适合物种的鉴定，目前已被广泛应用到法庭科学实践中进行个体识别和亲子鉴定。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供鉴定罂粟的snp分子标记。
6.本发明的另一个目的是提供snp分子标记在鉴定罂粟中的应用。该方法在简易性、高效性的基础上，提高了毒品原植物罂粟鉴定的准确性。
7.为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
8.利用gbs技术对收集到的具有形态差异的罂粟及其近缘物种共十二份植物材料混样dna进行测序，通过对测序数据进行严格的过滤和比对分析，筛选出了两个毒品原植物罂粟特异性snp位点：snp1和snp2；
9.针对snp1设计的引物为：
10.snp1f：gtacgataccctaggcagacattc
11.snp1r：cagttccagctattttagatcg；
12.针对snp2设计的引物为：
13.snp2f：cagtaccgcctgtgaagact
14.snp2r：aatgggatgatgacagaacg。
15.两个特异性snp分子标记均可单独用于准确鉴别罂粟及其近缘物种，若待测物种在位点snp1为g/g纯和位点则为毒品原植物罂粟，若为a/a纯和位点或c/c纯和位点则为罂粟属其他物种；若待测物种在位点snp2为c/c纯和位点则为罂粟，若为a/a纯和位点或a/c杂和位点则为罂粟属其他物种。
16.本发明的保护内容包括，检测罂粟基因组nc_039359.1_95133221碱基的试剂在罂粟鉴别中的应用，所述的试剂优选为引物，具体为snp1f：gtacgataccctaggcagacattc和snp1r：cagttccagctattttagatcg。
17.检测罂粟基因组nc_029434.1_19785碱基的试剂在罂粟鉴别中的应用，所述的试剂优选为引物，具体为snp2f：cagtaccgcctgtgaagact和snp2r：aatgggatgatgacagaacg。
18.以上所述的罂粟的基因组版本是papaver somniferum(assembly asm357369v1)。
19.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
20.本发明充分考虑到罂粟同种、同属物种的丰富变异，全面收集了罂粟种内不同花色、花型及产地的个体，及中国分布的罂粟属其他物种，比较筛选了两个罂粟特异性snp位点，在鉴别罂粟与其近缘物种植物方面具有更高的种属特异性和更强的准确率。
21.本发明使用snp分子标记的方法，利用自行设计的两对特异性引物分别对待检测植物样本dna进行pcr扩增并对扩增产物进行测序，通过测序结果中snp位点的基因型可直接获得鉴定结果。该方法操作简便、周期短，可有效提高缉毒工作中毒品原植物罂粟鉴定的效率和准确性。
附图说明
22.图1罂粟特异性snp位点鉴定结果。
23.图2特异性位点snp1多序列比对结果。
24.图3特异性位点snp2多序列比对结果。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例详细说明：
26.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。本发明所用的罂粟的基因组版本是papaver somni ferum(assembly asm357369v1)。
27.实例中所用罂粟及其近缘物种植物样本采集：
28.在种内水平上，罂粟样品由中国科学院武汉植物园、公安部第一研究所等相关单位提供，产地分别是：湖北武汉、黑龙江杜尔伯特蒙古族自治县、山东菏泽、山东长清、湖北孝感及缅甸地区；并且所收集的罂粟样本包含了在花色(红色、粉色、紫色、白色等)、花型(单瓣和重瓣)及果荚数(单个和多个)上存在变异的个体。属内种间水平上，收集到罂粟属7个种2个变型的样本，每个物种尽可能采集其分布区内不同居群的多个个体。以上材料均采集叶片，用硅胶保存。材料和样品来源见表1。
29.表1罂粟及其同属近缘物种来源
[0030][0031][0032]
实施例1：
[0033]
用于罂粟鉴定的snp特异性分子标记筛选
[0034]
1、基因组dna的提取
[0035]
采用改良的ctab法提取所收集罂粟属植物样本dna，使用紫外分光光度计对dna浓度进行检测，将其稀释成最终浓度为1ng/μl的dna，-20℃保存备用。
[0036]
2、罂粟特异性snp位点的挖掘
[0037]
选取部分样本编号相同的个体dna进行混合，每个混合dna样本包含十个不同的个
体。对12份罂粟及其近缘物种植物混合dna样本(zwyys,ys2,md，ymr,df,yys,mgy,hs,cbs,hh1,hh2,hm)进行gbs简化基因组测序，通过对测序原始数据进行过滤得到高质量数据，将其比对至罂粟基因组并进行变异检测与注释。申请人筛选得到大量的snp位点，但发现这些位点大部分都存在鉴定假性，导致鉴定结果不准确的情况。
[0038]
最终挖掘出两个罂粟特异性snp位点，分别命名为snp1和snp2，选取snp位点上下游250bp作为候选序列并设计引物；
[0039]
针对snp1设计的引物为：
[0040]
snp1f：gtacgataccctaggcagacattc
[0041]
snp1r：cagttccagctattttagatcg
[0042]
针对snp2设计的引物为：
[0043]
snp2f：cagtaccgcctgtgaagact
[0044]
snp2r：aatgggatgatgacagaacg
[0045]
特异性snp位点信息：
[0046][0047]
含有snp1的序列为：
[0048]
》nc_039359.1_95133221 95132971-95133471
[0049]
tagatgaccttttaagtgctgggatttcatggacaatcacagataagaagagagtacgataccctaggcagacattcatgaaccgttgtgtgtctctggacaaaggagctccaccacaaagcataaatctcatacggcctccaagaatagatcttatctttttgaaaacaatgacatccagaaaagtcttttccagtccccaagccccaaacaagcttccttctatagcagacaatcgacgtttgtatccgaggttgaaaagttttttggttaatccacccttctcattgacctatataaaaagatatggtccaaacaaaagacacttaacattaaccgcaaccacgcagtcacgaaaataagaaggcgataaaccaactgtaagccccactaaattgtagtcaactcaaacctttttcaacactccgtctcgaacacgatctaaaatagctggaactgctgccataagggtgggcttcaatgcagaggcatctcccaggg
[0050]
含有snp2的序列为：
[0051]
》nc_029434.1_19785 19535-20035
[0052]
caaacaggtctatataacatagaaaagcaggatgtccatgacgtgtacgtgtgggatgcaccaaatcttcattgaattttatttttccgttagaaggagctcgtacatgttctgcagtaccgcctgtgaagactccaccggtatgaaaagttcttaacgttagctgggtccccggttccccaatagattgacccgcaataatacctactgcttctcccaattcgaccagatcaccatgagtggaactccgcccataacataatcggcagatccaagatgtactcctgcaagtaaagggggttcgaatatatattggttgtgctcgaaaagttatgaatcggttgacaagtccaatacctatatcttgatttcgaatggcaatgcaacgcgaacccatatatatatcgtctgctaatacacgaccaattaatgtttggataaaaatacgttctgtcatcatcccatttcgagggctcacagaaataccgcggatggtgccac
[0053]
上述分子标记引物的使用方法如下：
[0054]
(1)提取待测样本dna；
[0055]
(2)根据目的基因序列设计特异性引物，如下：
[0056]
snp1f：gtacgataccctaggcagacattc
[0057]
snp1r：cagttccagctattttagatcgtg
[0058]
snp2f：cagtaccgcctgtgaagact
[0059]
snp2r：aatgggatgatgacagaacg
[0060]
(3)使用设计的引物对罂粟属植物dna进行pcr扩增；
[0061]
(4)利用abi3730xl测序仪对电泳条带清晰的扩增产物进行测序；
[0062]
(5)使用bioedit软件对测序结果和候选序列进行比对，根据特异性snp位点碱基类型来判断待测样本是否为毒品原植物罂粟。两个分子标记位点，均能准确对罂粟进行判定。
[0063]
若待测物种在位点snp1为g/g纯和位点则为毒品原植物罂粟，若为a/a纯和位点或c/c纯和位点则为罂粟属其他物种；
[0064]
若待测物种在位点snp2为c/c纯和位点则为罂粟，若为a/a纯和位点或a/c杂和位点则为罂粟属其他物种。
[0065]
实施例2：
[0066]
snp分子标记对毒品原植物罂粟进行快速鉴定的方法在罂粟种属鉴定中的应用
[0067]
1、提取dna
[0068]
利用ctab法分别提取上述表1所列植物叶片的基因组dna，其中罂粟共68株，其近缘物195株。
[0069]
2、pcr扩增
[0070]
以步骤1提取的dna为模板，分别用实施例1开发的两对特异性引物对进行pcr扩增。pcr的扩增体系为30μl体系，体系包括总dna 1.5μl,2
×
taq pcr master mix 15.0μl，snp1f和snp1r各0.75μl(或snp2f和snp2r各0.75μl)，ddh2o12.0μl。pcr的扩增条件为：94℃变性3min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
[0071]
3、扩增产物测序
[0072]
利用abi3730xl对扩增条带清晰的产物进行测序。
[0073]
4、多序列比对
[0074]
利用bioedit软件，以候选序列为参考序列，对测序结果进行多序列比对。根据待测物种pcr扩增产物在snp1或在snp2位点的基因型来进行物种鉴定。
[0075]
实验结果显示，利用引物对snp1f和snp1r对所有的样本进行pcr扩增，扩增产物的测序显示所有罂粟样本在位点snp1均为g/g纯合，所有的罂粟近缘物种在位点snp1处均为a/a纯合。
[0076]
利用引物对snp2f和snp2r对所有的样本进行pcr扩增并对扩增，扩增产物的测序结果显示所有罂粟样本在位点snp2均为c/c纯合，所有的罂粟近缘物种在位点snp2处均为a/a纯合。
[0077]
上述结果表明：本发明的两个特异性snp分子标记均可单独用于准确鉴别罂粟及其近缘物种，若在位点snp1为g/g纯合位点或在位点snp2为c/c纯和位点均可确定待测物种为罂粟。