Reg4抗菌肽治疗致病性大肠埃希菌感染的应用的制作方法

reg4抗菌肽治疗致病性大肠埃希菌感染的应用
技术领域
1.本发明涉及新药物用途领域，具体地，涉及reg4抗菌肽治疗致病性大肠埃希菌感染的应用。


背景技术：

2.大肠埃希菌是人和动物肠道正常菌群的主要成员，但其中有些带有致病基因的血清型会引起人类肠道感染、泌尿道感染，并可引发致死性并发症。
3.在胃肠道感染疾病中，肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic e.coli，epec)为大肠埃希菌性胃肠炎的常见病原体之一，其在儿童中的发病率较高，尤其是3岁以下的幼儿，且疾病的危害性大，在发展中国家的发病率和病死率较高。
4.由此，研究表明，肠致病性大肠埃希菌(epec)是儿童中重度腹泻的主要病原菌之一，严重威胁婴幼儿肠道发育和健康成长。抗生素治疗是治疗epec感染的重要手段，但随着抗生素的滥用，越来越多的epec临床分离株表现出对青霉素和头胞菌素等多种抗生素耐药。
5.婴幼儿肠道免疫功能发育不成熟、胃酸及各种消化酶活力较低，且自身免疫力低下。epec感染易引起患儿出现中重度急性水样腹泻、发热和呕吐等症状，严重影响患儿身心健康。越来越多的epec临床分离株表现出对青霉素和头胞菌素等多种抗生素耐药。因此，目前迫切需要开发不易产生耐药性、活性高、安全可靠的新型抗epec感染的药物。
6.虽然，抗菌肽是抗生素的理想代替品之一。但目前尚未有研究发现reg4蛋白在治疗epec感染中的作用。


技术实现要素：

7.本发明旨在克服上述缺陷，提供了一种抗生素的理想代替品，即、reg4抗菌肽。
8.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
9.上述活性成分为:reg4蛋白；
10.关于reg4蛋白的序列如seq id no.1所示；
11.seq id no.1
12.》sp|q9d8g5|reg4_mouse regenerating islet-derived protein 4 os＝mus musculus ox＝10090 gn＝reg4 pe＝2sv＝1
13.metalaserlysglyvalargleuleuleuleuleusertrpvalalaglyprogluval
14.leuseraspileleuargprosercysalaproglytrpphetyrtyrargserhiscys
15.tyrglytyrphearglysleuargasntrpserhisalagluleuglucysglnsertyr
16.glyasnglyserhisleualaservalleuasnglnlysglualaservalileserlys
17.tyrilethrglytyrglnargasnleuprovaltrpileglyleuhisaspproglnlys
18.lysglnleutrpglntrpthraspglyserthrasnleutyrargargtrpasnproargthrlyssergluala
19.arghiscysalaglumetasnprolysasplyspheleuthrtrp
20.asnlysasnglycysalaasnargglnhispheleucyslystyrlysthr
21.上述用途包括:用于制备治疗epec感染症状的药物。
22.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
23.所述用途还包括:用于制备治疗和缓解由epec感染引起的肠道炎症反应的药物；
24.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
25.所述用途还包括:用于制备治疗和缓解由epec感染引起的病理性损伤的药物。
26.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
27.所述用途还包括:用于制备治疗和缓解由epec感染导致的体重丢失病症的药物。
28.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
29.所述用途还包括:本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
30.所述用途包括:用于制备抑制epec生长的药物。
31.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
32.所述用途还包括:用于制备减少epec在肠道内的定植的药物。
33.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
34.所述用途还包括:用于制备能够降低epec迁移能力的药物。
35.本发明提供了一种活性成分的用途,其特征在于:
36.所述用途还包括:用于制备减少epec对肠道外脏器的侵袭的药物。
37.此外，本发明还提供了一种epec急性感染实验模型,其特征在于，由如下步骤建模:
38.s1.在细菌感染前2天，向目标模型体添加链霉素；
39.s2.在细菌感染前1天，停止添加链霉素；
40.s3.采用epec菌液进行细菌感染。
41.本发明的作用和效果：
42.在本发明的研究中表明，再生基因(regenerating family，reg)蛋白4(reg4)是机体表达的分泌性蛋白，经本发明的研究表明reg4蛋白具有抗菌肽活性。
43.在本发明的研究中将不同浓度reg4蛋白与epec共孵育，发现reg4蛋白能显著抑制epec生长。定量pcr检测epec感染小鼠肠道粘膜中reg4表达水平，发现epec感染导致reg4表达水平升高。
44.此外，本发明基于成功建立的epec急性感染实验，使用reg4蛋白治疗epec感染小鼠，发现reg4蛋白能减少epec在肠道内的定植及对肠道外脏器的侵袭，改善由epec感染引起的肠道炎症和病理性损伤。同时，elisa实验检测发现reg4蛋白能与epec鞭毛蛋白结合，从而减少epec迁移能力。
45.此外，epec致病主要依靠肠上皮细胞脱落基因座(the locus of enterocyte effacement，lee)编码效应分子，该效应分子依靠lee编码的iii型分泌系统(t3ss)分泌并转位进入宿主细胞，从而引起细胞病变和损伤。典型的改变是细菌紧密粘附在宿主细胞表面，引起肠刷状缘位点破坏和原生质膜扭曲变形，细胞骨架重新排列。细菌粘附处形成基垫，并伴有上皮细胞大量微绒毛脱落，即粘附和脱落损伤(attaching and effacing lesion，a/e lesion)。a/e损伤导致了肠黏膜吸收能力下降，从而破坏机体电解质平衡，导
致严重腹泻。鞭毛作为肠致病性大肠埃希菌的运动器官，在细菌运动和致病性上具有重要作用。细菌鞭毛可促进肠致病性大肠埃希菌粘附和侵袭肠上皮细胞。故而，通过本发明的研究表明，reg4能够与epec鞭毛蛋白结合，也就是说在本发明中明确了reg4蛋白通过结合肠致病性大肠埃希菌鞭毛，从而减少epec定植肠道和侵袭肠道外脏器的具体机制。
46.由此，本发明公开的reg4蛋白抗菌活性较强，具有分子质量小、抗蛋白酶降解、抗菌谱广、抗菌机制异于传统抗生素，对抗生素产生的超级耐药菌株具有较好的抗菌活性等特性，而reg4蛋白属于人体抗菌肽中的一种，不会引起机体排异反应，且无药物残留等风险。
47.因此，本发明公开的reg4蛋白有望减少传统抗生素耐药性，作为一种新型抗菌肽，用于有效治疗epec感染，成为今后治疗肠致病性大肠埃希菌感染的最佳药物，为临床治疗epec感染提供新的治疗策略。
附图说明
48.图1.reg4蛋白抑制epec生长
49.其中，图1a为epec细菌生长动力学曲线(****，epec+pbs vs.epec+10μg/ml,p《0.0001)。
50.图1b为reg4蛋白和epec细菌共同孵育第4h od
600
测量结果。
51.图1c为reg4蛋白和epec细菌共同孵育第24h细菌平板涂布结果。
52.图1d为reg4蛋白和epec细菌共同孵育第24h细菌数目测量结果。
53.图2.epec感染小鼠流程图和小鼠体重变化
54.其中，图2a为epec感染小鼠流程图。
55.图2b为epec感染小鼠体重变化。
56.图3.epec感染小鼠肠道病理变化和评分
57.其中，图3a为回肠和结肠he染色光镜(各组放大倍数：
×
100)。
58.图3b为各组小鼠回肠和结肠炎症病理学评分
59.图4.小鼠盲肠及粪便中epec细菌含量检测结果
60.其中，图4a为重组鼠reg4蛋白对盲肠和粪便中epec细菌含量的影响。
61.图4b为各组小鼠盲肠组织和粪便中epec细菌含量的比较。
62.图5.小鼠肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中epec细菌含量检测结果
63.其中，图5a为重组鼠reg4蛋白对肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中epec细菌含量的影响。
64.图5b为各组小鼠肝脏中epec细菌含量的比较。
65.图5c为各组小鼠脾脏中epec细菌含量的比较。
66.图5d为各组小鼠肠系膜淋巴结中epec细菌含量的比较。
67.图6.小鼠相关炎症因子表达水平检测
68.其中，图6a为elisa检测小鼠血清中il-22含量。
69.图6b为elisa检测小鼠血清中ifn-γ含量。
70.图6c为小鼠结肠粘膜组织中il-1β的表达水平。
71.图6d为小鼠结肠粘膜组织中il-10的表达水平。
72.图6e为小鼠结肠粘膜组织中ifn-γ的表达水平。
73.图6f为小鼠结肠粘膜组织中il-6的表达水平。
74.图7.reg4与epec鞭毛结合作用
75.其中，图7a为epec在半固体琼脂糖培养板内迁移结果。
76.图7b为epec在半固体琼脂糖培养板内迁移形成的晕圈直径检测结果。
77.图7c为epec鞭毛蛋白提取结果。
78.图7d为elisa检测epec鞭毛与reg4蛋白结合作用。
具体实施方式
79.实施例1.reg4蛋白在体外抑制epec生长实验
80.1.1主要材料
81.(1)胰蛋白胨：st800，上海碧云天生物技术有限公司
82.(2)酵母膏：st968，上海碧云天生物技术有限公司
83.(3)氯化钠：1249kg001，上海兢蔚生物科技有限公司
84.(4)高纯度低电渗琼脂糖：g5056-100g，武汉塞维尔生物科技有限公司
85.(5)肠致病性大肠埃希氏菌(escherichia coli,epec)：bio-56094，购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
86.1.2方法
87.1.2.1 luria-bertani(lb)培养基和培养板的配制：
88.lb培养基：在1000ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，加入1000ml双蒸水(摇动容器直至溶质溶解，高压下蒸汽灭菌20min。
89.lb固体培养基及倒板：(1).配制：100ml lb培养基加入1.5g琼脂粉；
90.(2).抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的lb固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时加入卡那霉素(终浓度为50μg/ml)，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
91.(3).倒板：10ml lb倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
92.(4).保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
93.1.2.2肠致病性大肠埃希氏菌培养
94.用无菌吸管吸取0.5ml左右lb液体培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解。将溶解后的细菌悬液转移至盛有5ml液体培养基的试管中混匀，并取100μl转接到固体培养基上。将液体试管和斜面试管静置培养。取100μl epec菌液加至1000ml含50μg/ml卡那霉素的写上全称然后再缩写培养基中，37℃，过夜培养，培养至对数生长期后，4000rpm，20min，离心收集菌体，用pbs缓冲液重悬，使用平板计数法测定菌液菌落总数，-80℃保存菌体备用。
95.1.2.3 reg4蛋白浓度调整
96.用灭菌pbs缓冲液将药物浓度调整为1mg/ml。所有蛋白溶液在使用前均使用0.22μm滤膜过滤除菌，保存于无菌1.5ml ep管。
97.1.2.4 reg4蛋白与epec共孵育
98.将10μl复苏的epec细菌悬液接种到总共200μl含有不同浓度(0，2或10μg/ml)reg4
蛋白。每2小时通过od
600
测量监测细菌的生长。
99.用灭菌pbs缓冲液将epec稀释至终浓度为2
×
105cfu/ml。取15ml离心管4支，排成一排，第1管加入1980ul lb培养基和20μl稀释好的epec菌液(作为对照组)，第2管加入1978μl lb培养基、20μl菌液和2μl重组鼠reg4蛋白(作为1μg/ml组)，第3管加入1960μl lb培养基、20μl菌液和20μl重组鼠reg4蛋白(作为10μg/ml组),混匀。盖好盖子，置37℃恒温箱中孵育24小时。
100.1.2.5细菌菌落总数测定
101.将孵育好的菌液用灭菌水连续稀释至终浓度为1
×
107cfu/ml。取100μl孵育好的菌液均匀涂抹于卡那霉素琼脂培养板上。平板平放于超净台上30分钟，使菌液渗入培养基表层内。将平板倒置于37℃恒温箱中培养24h，24h后计算平板菌落数目，乘于稀释倍数即得出各组菌落数目。
102.1.3结果
103.1.3.1细菌菌落总数测定
104.根据gb 4789.2-2016标准进行细菌平板计数。epec菌落总数为7.6
×
109cfu/ml。
105.1.3.2重组reg4蛋白抑制epec细菌生长
106.将epec分别与不同浓度的重组reg4蛋白共同孵育，进行od
600
测定(图1a-b)。细菌生长动力学曲线结果显示，当reg4蛋白浓度达到10μg/ml时能有效抑制epec的生长。
107.将epec分别与pbs、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml重组鼠reg4蛋白共同孵育24h，进行细菌菌落总数测定(图1c-d)。结果显示，pbs组细菌总数为8.46
×
109cfu/ml,给予1μg/ml重组reg4蛋白后细菌总数减少至3.51
×
109cfu/ml(p＝0.023)，给予5μg/ml重组reg4蛋白后细菌总数减少至1.87
×
109cfu/ml(p＝0.002)，给予10μg/ml重组reg4蛋白细菌总数则减少约7倍，总数为1.24
×
109cfu/ml(p＝0.0005)。结果表明，重组reg4蛋白能有效抑制epec生长。
108.实施例2.reg4蛋白抵抗epec感染小鼠
109.2.1主要材料
110.(1)c57bl/6小鼠：上海吉辉实验动物饲养有限公司
111.(2)灌胃针8号：gwz-8-45，上海晶旷生物科技有限公司
112.2.2方法
113.2.2.1 reg4蛋白浓度调整
114.用灭菌pbs缓冲液将药物浓度调整为1mg/ml。所有蛋白在使用前均使用0.22μm滤膜过滤除菌，保存于无菌1.5ml ep管。
115.2.2.2 epec菌液稀释
116.用灭菌pbs缓冲液将epec稀释至终浓度为2
×
109cfu/ml。
117.2.2.3小鼠急性感染实验
118.取35日龄野生型(wide type,wt)雄性c57bl/6小鼠作为感染对象，随机分成6组，分组如下：包括con组(n＝10)，epec+pbs组和epec+reg4组(n＝10)。
119.实验操作如图2a所示，在细菌感染前2天在小鼠饮用水中添加5g/l链霉素以引起肠道菌群絮乱，感染前1天改用正常饮用水。给予每只小鼠灌胃100μl epec菌液(细菌总量为2
×
109cfu)。从感染后第1天起，epec+reg4组小每日经腹腔注射给予100μl 10μg/ml鼠
reg4蛋白，con组和epec+pbs组给予腹腔注射等量灭菌pbs。
120.每日定时记录小鼠体重，在感染第4天进行取材。小鼠麻醉之后眼球取血，脱颈处死，开腹取材。取部分回肠和结肠置于4％多聚甲醛中固定。收集肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、部分盲肠和小鼠粪便用于细菌总数测定。刮取回肠末端和结肠肠粘膜。
121.2.2.4脏器细菌负荷量测定
122.用无菌剪刀、镊子取小鼠肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、盲肠和粪便，根据重量加入无菌pbs溶液，无菌环境中进行匀浆处理。后对匀浆液进行连续梯度稀释，分别吸取100μl匀浆液涂布在含有卡那霉素的lb培养板上，过夜培养，观察菌落状态并计数。
123.2.2.6肠道组织病理学评分
124.取小鼠回肠和结肠置于4％多聚甲醛中固定，常规脱水、包埋、切片、he染色，显微镜下观察肠上皮组织完整性、粘膜下水肿程度和炎症细胞浸润等病理变化。
125.2.2.7检测肠道炎症反应
126.根据试剂商提供的实验方案，检测小鼠血清中il-22和ifn-γ含量。使用rna提取试剂盒提取小鼠结肠粘膜组织，定量per检测小鼠结肠粘膜相关炎症基因的表达水平，包括il-1β、il-10、ifn-γ和il-6。
127.2.3结果
128.2.3.1 reg4蛋白能改善epec感染小鼠体重丢失
129.各组小鼠体重丢失情况如图2b所示，未给予epec感染的con组小鼠体重缓慢上升，感染后第3天体重增长初始体重的107.8％，而epec感染的各组小鼠均出现不同程度的体重丢失。在感染后第1天，epec+pbs组和epec+reg4组小鼠体重分别为初始体重的96.1％和96.4％，显著低于con组(p均《0.0001)。在感染后第3天，epec+reg4组小鼠体重增长初始体重的102.8％，而epec+reg4组小鼠体重为初始体重的98.6％，两组小鼠体重增长速率具有统计学差异(p＝0.0069)。结果表明，reg4蛋白治疗能改善epec感染小鼠体重丢失情况。
130.2.3.2 reg4蛋白能缓解epec引起的肠道损伤
131.病理检测结果如图3a-b显示，相比于con组小鼠回肠和结肠组织，epec+pbs组小鼠回肠和结肠均可见肠绒毛均发生严重的破损、脱落，粘膜脱落至肠腔内，肠腔内可见纤维素渗出，大部分腺体被破坏，粘膜下层水肿严重，粘膜肌层和粘膜下层可见有大量中性粒细胞浸润。而epec+reg4组小鼠回肠和结肠损伤均有所改善，肠粘膜脱落减轻，固有层炎症细胞浸润减少。肠道病理评分也显示，epec+pbs组小鼠回肠和结肠发生严重的炎症，而给予reg4蛋白后肠道炎症明显减轻。结果表明reg4蛋白可以有效缓解epec造成的肠道病理损伤。
132.2.3.3 reg4蛋白能减少epec在肠道内定植
133.对各组小鼠粪便和盲肠中的epec细菌数量进行检测，结果如图4a-c。未感染对照组小鼠盲肠和粪便中均未检测到epec，而epec+pbs组小鼠盲肠和粪便均检测到大量epec。在给予reg4蛋白治疗后，epec+reg4组小鼠盲肠和粪便中的epec数目明显减少(p《0.01)。
134.2.3.4 reg4蛋白能减轻epec对小鼠脏器组织的侵袭情况
135.对各组小鼠肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏中的epec细菌数量进行检测，结果如图5a-d。未感染对照组小鼠肠道外脏器中未检测到epec，epec感染小鼠各脏器均可见epec定植分布。与epec+pbs组小鼠相比，epec+reg4组小鼠肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中的epec数量明显减少。结果表明reg4蛋白能有效抑制epec侵袭其他肠道外器官组织。
136.2.3.5 reg4蛋白能改善epec诱导的肠道炎症反应
137.使用elisa试剂盒检测各组小鼠血清中il-22和ifn-γ含量。结果如图6a-b显示，epec感染小鼠血清il-22和ifn-γ含量较未感染组小鼠明显增加，给予reg4蛋白干预可明显减少血清中il-22和ifn-γ含量。使用定量per检测小鼠结肠粘膜相关炎症基因的表达水平，结果如图6c-f。epec感染小鼠结肠粘膜组织中il-1β、il-10、ifn-γ和il-6的表达水平均较未感染组小鼠明显升高，给予reg4蛋白干预可明显减低小鼠结肠粘膜组织中il-1β、il-10、ifn-γ和il-6的表达水平。以上结果表明reg4蛋白能改善epec诱导的肠道炎症反应。
138.实施例3.reg4抑制epec迁移作用机制
139.3.1主要材料
140.(1)96孔eia/ria板：9018，上海宇进生物科技有限公司
141.(2)reg4抗体：bs-10036r，上海科雅生物科技有限公司
142.(3)tmb显色液：p0209-100ml，上海碧云天生物技术有限公司
143.3.2方法
144.3.2.1 reg4蛋白对epec迁移的影响
145.将处于对数生长期的epec与reg4蛋白共孵育1h。取10ul培养物接种在含有0.3％琼脂的半固体琼脂平板上，37℃孵育10h后细菌运动形成晕圈，检测晕圈直径大小。
146.3.2.2提取伤epec鞭毛
147.epec培养至对数生长期，用pbs重悬细菌沉淀，300次/min振荡分离鞭毛和菌体。离心(4000g，20min)，获取上清和沉淀。将上清进一步超速离心(80000g,60min),获取上清和沉淀，沉淀即为epec鞭毛。sds-page鉴定epec鞭毛蛋白纯度。
148.3.2.3 elisa实验检测epec鞭毛与reg4蛋白结合
149.将elisa板用100ug/ml鞭毛或bsa包被过夜(4℃，16h)。使用pbs洗板3次，用含1％bsa的pbs配制不同浓度的reg4蛋白和突变型reg4蛋白(0、2、4、6、8和10ug/ml)，将含蛋白溶液与elisa板共孵育2h(37℃)。pbs洗板3次，加入reg4抗体(1:1000)，孵育2h。pbs洗板3次，加入二抗(1:5000)，在37℃孵育2h。pbs洗板3次，加入tmb显色，测量od
450
值。
150.3.3结果
151.3.3.1 reg4蛋白能减少epec迁移
152.对比epec在半固体琼脂平板的迁移情况，结果如图7a-b。pbs组epec在半固体琼脂平板迁移，形成直径为(12.8
±
0.4)cm的晕圈，而给予reg4蛋白之后，reg4+epec组细菌晕圈直径减小为(8.8
±
0.6)cm，提示reg4蛋白能抑制epec迁移。
153.3.3.2提取epec鞭毛
154.提取鞭毛蛋白并行sds-page电泳，考马斯亮蓝染色分析。结果如图7c，考马斯亮蓝结果显示在沉淀中检测到相对分子质量约为60kda的条带，其大小均与预期蛋白大小相符。鞭毛蛋白浓度为1.1mg/ml。
155.3.3.3 epec鞭毛与reg4蛋白结合
156.使用elisa实验检测epec鞭毛与reg4结合情况，结果如图7d.epec+bsa值od
450
值未见明显变化，而epec+reg4组od
450
值随着reg4蛋白剂量的增加而增加，提示reg4蛋白与epec鞭毛蛋白相互结合。
157.158.