花生SL型油体蛋白基因AhOLE2及其在提高植物耐盐性中的应用

花生sl型油体蛋白基因ahole2及其在提高植物耐盐性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生sl型油体蛋白基因ahole2及其在提高植物耐盐性中的应用。


背景技术：

2.植物在自然环境中经常要面对各种非生物胁迫(如干旱、盐胁迫、高低温等)；这些不利条件能够抑制植物的生长，甚至导致生物体死亡。随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的植物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。
3.目前，通常采用常规杂交方法选育植物新品种，由于耐盐碱种质缺乏，短期内难以选育出耐盐碱新品种。当前发展迅速的基因工程技术为植物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供花生sl型油体蛋白基因ahole2以及该基因在提高植物耐盐性中的应用。
5.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种花生sl型油体蛋白基因ahole2，所述花生sl型油体蛋白基因ahole2的核酸序列如seq id no:1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
7.克隆权利要求1所述花生sl型油体蛋白基因ahole2的引物，序列如下：
8.p1：5
′‑
taacatggctgaagcactct-3
′
；
9.p2：5
′‑
cggtaatacaagcaacccag-3
′
。
10.上述花生sl型油体蛋白基因ahole2在提高植物耐盐性中的应用，其中，所述的耐盐性为至少耐受300mm nacl。
11.一种用于提高植物耐盐性的重组载体、重组菌、表达盒、转基因细胞系，含有上述花生sl型油体蛋白基因ahole2的编码区序列。
12.一种提高植物耐盐性的方法，将上述花生sl型油体蛋白基因ahole2的序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物的耐盐性。
13.在一个具体的实施例中，所述的耐盐性为至少耐受300mm nacl。
14.上述提高植物耐盐性的方法中，所述的植物可以为任意植物，例如拟南芥、花生。
15.本发明技术方案的优点
16.1、本发明从花生中克隆了sl型油体蛋白基因ahole2，测序结果表明该基因没有内含子，编码蛋白有保守序列脯氨酸结。
17.2、转花生ahole2基因的拟南芥植株形态发育正常，经300mm nacl处理后，与野生型相比，过表达株系表现出较强的耐盐性，ole突变体萎蔫严重；本发明将花生ahole2基因
在拟南芥中表达可显著提高其耐盐性。
18.3、本发明将ahole2基因在花生中超量表达，可显著提高其耐盐性。用300mm nacl的胁迫处理后，转基因花生的耐盐性明显强于非转基因植株。
附图说明
19.图1为250mm nacl胁迫处理后花生油体蛋白基因ahole2在不同时间段的相对表达量；
20.图2盐胁迫处理对转基因和非转基因拟南芥植株表型(第一行)和最大光化学效率(第二行)的影响；
21.图3盐胁迫处理对转基因拟南芥和非转基因对照fv/fm、npq和y(no)值的影响；
22.图4过表达ahole2拟转基因花生的pcr鉴定(其中m：dl2000；1：阳性对照；2：阴性对照；3-13：拟转基因花生)；
23.图5盐胁迫处理后过转基因花生(oe-1、oe-2)和非转基因对照(wt)植株的生长情况；
24.图6盐胁迫处理对转基因花生(oe-1、oe-2)和非转基因对照(wt)光合系统ii最大光化学效率的影响(从左到右依次为wt、oe-1、oe-2)；
25.图7盐胁迫处理对转基因花生(oe-1、oe-2)和非转基因对照(wt)fv'/fm'、npq和spad的影响；
26.图8盐胁迫处理利用nbt和dab对转基因花生(oe-1、oe-2)和非转基因(wt)植株叶片染色情况；
27.图9盐胁迫处理对转基因花生(oe-1、oe-2)和非转基因对照(wt)h2o2和o
2-积累，mda和脯氨酸含量的影响。
具体实施方式
28.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
29.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
30.以下实施例中所采用的的实验材料的来源如下：
31.大肠杆菌dh5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；
32.根癌农杆菌菌株gv3101购自北京天恩泽基因科技有限公司；
33.根癌农杆菌菌株eha105购自北京天恩泽基因科技有限公司；
34.拟南芥ole突变体购自arashare；
35.拟南芥哥伦比亚野生型品种(青岛农业大学遗传研究室实验室提供)。
36.转基因的花生受体材料为花育23(青岛农业大学遗传实验室提供)。
37.实施例1花生sl型油体蛋白基因ahole2的克隆及表达分析
38.1、花生sl型油体蛋白基因ahole2的克隆
39.提取花育23的基因组dna，并以此为模板，以如下引物对克隆花生sl型油体蛋白基
因ahole2，获得其基因序列如seq id no:1所示，编码产生的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述氨基酸序列中有保守的脯氨酸结(-px5spx3p-)。
40.seq id no:1
41.taacatggctgaagcactctactacggcggccgccaacgccaagagcaaccaaggtccacccagcttgtcaaggccaccaccgctgttgtcgccggaggctccctcttgatcctcgccggccttgtgctggccggcaccgtcattggcctcacaacgatcacaccgctcttcgtgatcttcagcccggtgcttgtgccagctgtcatcactgtggcactcttaggcttggggttcttggcttctggaggcttcggcgtggcggcaataacagtgctgacgtggatctataggtacgtaacaggtaagcatccacctggcgccaaccaattggacacagcccgccacaagctgatgggcaaggcgcgtgagattaaggactttggtcaacaacaaaccagtggggcccaggcttcttgagcataccatcttcgtttgcatctttgtttgcacgcacgtccacgccatcatttatctttttcgaattgttatggtttattttattttatttaattttttatgagtctgggttgcttgtattaccg
42.seq id no:2
[0043][0044][0045]
扩增引物序列如下：
[0046]
p1：5
′‑
taacatggctgaagcactct-3
′
(seq id no:3)；
[0047]
p2：5
′‑
cggtaatacaagcaacccag-3
′
(seq id no:4)。
[0048]
2、盐胁迫对花生sl型油体蛋白基因ahole2的表达的影响
[0049]
a、用250mm nacl处理
‘
花育23号’的幼苗，在不同时间段(处理后的0h、6h、12h、24h和48h)取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用rna提取试剂盒提取rna。抽提后的总rna用dnase i处理，并进行纯化。
[0050]
b、样品在abi 7500fast型荧光定量pcr仪上进行反应。
[0051]
20μl反应体系包括：10μl 2
×
sybrgreen qpcr master mix，20μmol/l正反向引物各0.25μl，20ng反转录产物。
[0052]
扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。
[0053]
c、油体蛋白基因ahole2定量pcr的引物为：
[0054]
正向引物序列：5'-acgccaagagcaaccaag-3'(seq id no:5)；
[0055]
反向引物序列：5'-gaaccccaagcctaagagtg-3'(seq id no:6)。
[0056]
以花生actin基因为内标，内标基因的引物为：
[0057]
正向引物序列：5'-gtggccgtacaactggtatcgt-3'(seq id no:7)；
[0058]
反向引物序列：5'-atggatggctggaagagaact 3'(seq id no:8)。
[0059]
测得油体蛋白基因ahole2在盐胁迫处理前后表达量变化情况，结果如图1所示，由图1可知，油体蛋白基因ahole2在盐胁迫处理后表达量明显增加，表明其受盐胁迫诱导。
[0060]
实施例2 sl型油体蛋白基因ahole2植物表达载体的构建
[0061]
(1)以花育23的cdna为模板，克隆油体蛋白基因ahole2的编码区，并分别在上下游引物上引入kpn i和sac i酶切位点；所采用的的引物序列如下，其中下划线部分指的是酶切位点：
[0062]
正向引物：5
′‑
ggtacctaacatggctgaagcactct-3
′
(seq id no:9)；
[0063]
反向引物：5
′‑
gagctccggtaatacaagcaacccag-3
′
(seq id no:10)；
[0064]
(2)回收pcr产物，并在t4 dna连接酶作用下与克隆载体pmd18-t(购买于takara)进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α。提取重组质粒，用kpn i和sac i进行双酶切，回收含油体蛋白基因ahole2的酶切片段，并克隆到植物表达载体pbi121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pbi121-ahole2。
[0065]
实施例3 sl型油体蛋白基因ahole2在提高拟南芥耐盐性中的应用
[0066]
1、表达载体转化拟南芥，包括以下步骤：
[0067]
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将实施例2构建的植物表达载体pbi121-ahole2利用液氮冻融法转化农杆菌菌株gv3101感受态细胞，筛选出含有pbi121-ahole2的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到yeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)液体培养基中，28℃、180rpm培养至od600＝0.5～0.8时，取2ml菌液转移到50mlyeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)培养基中，培养到od600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体1/2msb5悬浮备用。
[0068]
b、拟南芥的种植：选取合适的的拟南芥种子，在1％naclo中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。
[0069]
c、农杆菌介导的遗传转化：选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30s，注意叶片尽量不与浸染液接触。将盆钵取下，横放于暗箱中约24h。注意保持一定的湿度。24h后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。大约3w后收取成熟种子。
[0070]
d、转基因拟南芥的筛选
[0071]
将转基因拟南芥种子接种到添加卡那霉素的ms培养基中，22℃培养一周左右，选取鲜绿健壮的拟南芥幼苗，移植于基质土。
[0072]
e、转基因植株的pcr检测
[0073]
提取转基因植株的基因组dna，利用上述载体序列和sl型油体蛋白基因ahole2序列设计引物进行pcr扩增。pcr反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，56℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。鉴定结果送去测序，测序正确的即为转ahole2基因的拟南芥植株。
[0074]
2、转ahole2基因的拟南芥耐盐性鉴定
[0075]
将ahole2转化ole突变体和野生型拟南芥(wt)，经筛选获得t3代纯合体。用300mmnacl溶液浇灌生长15d的拟南芥幼苗，观察拟南芥ole突变体(ole)、野生型植株(wt)、互补株系(将ahole2基因转入拟南芥ole突变体，ole/ole2)及过表达株系(将ahole2基因转
入拟南芥野生型植株，oe-ole2)的表型变化。结果表明经300mm nacl处理7d之后，与野生型相比，过表达株系oe-ole2表现出较强的耐盐性，ole突变体植株萎蔫严重(图2)。
[0076]
用叶绿素荧光成像系统检测经300mm nacl处理7d的拟南芥幼苗，结果如图2第二行和图3中a所示，其中，图2第二行表示了不同处理组最大光化学效率，其中颜色从红色到紫色分别代表最大光化学效率由小到大，ole突变体植株显示黄色，wt显示黄色和紫色，ole/ole2和oe-ole2显示紫色，且oe-ole2的紫色范围大于ole/ole2，结合图3中a的数据说明了ahole2基因的转化提高了植株的最大光化学效率，且高于ole突变体和wt。
[0077]
盐胁迫显著降低了ole突变体的y(npq)值(调节性能量耗散的量子产量)(图3中b)；psii光化学量子效率(φpsii)与fv/fm值有相似的变化趋势(图3中d)；在盐胁迫下，ole突变体的y(no)值(光损伤的重要指标)明显低高于wt、互补株系(ole/ole2)和过表达株系(oe-ole2)(图3中c)。
[0078]
实施例4 sl型油体蛋白基因ahole2在提高花生耐盐性中的应用
[0079]
1、表达载体转化花生，包括以下步骤：
[0080]
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pbi121-ahole2重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株eha105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到yeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)液体培养基中，28℃、180rpm培养至od600＝0.5～0.8时，取2ml菌液转移到50ml yeb(利福平50mg/l，卡那霉素50mg/l)培养基中，培养到od600＝0.6。将菌液于5000rpm离心10min后，用相同体积的液体msb5悬浮备用。
[0081]
b、花生外植体的分离：选取饱满的花生种子(花育23号)，在70％酒精中浸泡1min，0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗3-5次，将每片子叶纵向切成2半。
[0082]
c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入sim诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250mg/l头孢霉素的sim诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃
±
1℃。
[0083]
将形成丛生芽的外植体转移外到250mg/l头孢霉素、100mg/l卡那霉素的sem培养基上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃
±
1℃。
[0084]
培养2w后，切下不定芽部分转移到250mg/l头孢霉素、150mg/l卡那霉素的sem培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次。
[0085]
d、转基因植株的pcr检测
[0086]
提取再生植株的基因组dna，利用上述载体序列和ahole2基因序列设计引物进行pcr扩增。pcr反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，58℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。鉴定结果送去测序，测序正确的即为转ahole2基因的花生植株。转基因植株pcr阳性率达到19.8％(图4)。
[0087]
e、转基因阳性植株的嫁接移栽
[0088]
以15d左右苗龄的无菌实生苗为砧木，切除距子叶节约2cm以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约1cm。当转基因植株幼苗长到约3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约1cm的v形伤口，切口平整。将接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于msb5培养基中无菌培养3-4d；然后移栽于灭菌的育苗基质中进行驯化2w，之后移栽到基质土中，至收获荚果。
[0089]
f、转基因植株耐盐性分析
[0090]
用200mm nacl溶液浇灌生长2w的花生幼苗，3d后用300mm nacl溶液浇灌幼苗15d，观察过表达植株及非转基因对照的表型变化。结果表明经nacl处理之后，过表达ahole2基因(oe)的植株(oe-1和oe-2)表现出较强的耐盐性，非转基因花生植株(wt)萎蔫严重(图5)。
[0091]
用叶绿素荧光成像系统和叶绿素光合仪测定转基因阳性植株和非转基因对照叶片的相关参数，结果如图6所示，图6颜色从黄色到紫色分别代表最大光化学效率由小到大，非转基因对照植株显示黄色，过表达株系(oe-1和oe-2)显示紫色，这说明了2个过表达株系(oe-1和oe-2)的光合系统ii最大光化学效率(psii)(fv/fm)高于非转基因对照；此外结合图7中的数据表明2个过表达株系(oe-1和oe-2)psii光化学效率(fv'/fm')、psⅱ量子效率非光化学淬灭系数npq和spad值均显著高于非转基因对照(wt)。
[0092]
为了检测盐胁迫处理后转基因阳性植株和非转基因对照叶片的活性氧积累情况，利用nbt和dab对其测定进行染色(图8)，其中，图8中nbt染色结果中，叶片蓝色部分越多，说明了o
2-积累量越多；转基因植株(oe-1和oe-2)比非转基因对照(wt)叶片的蓝色部分少，说明了o
2-积累量少。dab染色结果中，叶片棕色部分越多，明了h2o2积累量越多；转基因植株(oe-1和oe-2)比非转基因对照(wt)叶片的棕色部分少，说明了h2o2积累量少。进一步测定转基因阳性植株和非转基因对照叶片的h2o2和o
2-积累量、mda和脯氨酸含量，结果表明与非转基因对照相比，2个过表达株系(oe-1和oe-2)的o
2-积累量分别减少40.24％、30.00％；h2o2积累量分别减少47.97％、32.97％；mda含量分别减少39.69％、33.16％；脯氨酸含量分别增加36.53％、33.77％(图9)。
[0093]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。