GmUVR8基因家族在提高植物异黄酮含量中的应用

gmuvr8基因家族在提高植物异黄酮含量中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及gmuvr8基因家族在提高植物异黄酮含量中的应用。


背景技术：

2.在植物生长发育中，太阳光至关重要。光不仅可以作为植物光合作用的重要来源促进植物的生长发育，其还通过一系列的光受体实现植物细胞信号转导。紫外光是太阳光的固有组分，不可避免地会影响植物的生长发育。紫外光按波长可分为uv-a（320~400 nm）、uv-b（280~320 nm）、uv-c（100~280 nm）。由于地球表面存在大气层，大气层中的臭氧层会吸收uv-c 和大部分的uv-b。虽然uv-b最终到达地面的占光能总量的比例不足0.1%，但仍对植物生长发育至关重要。比如，低强度紫外照射抑制拟南芥下胚轴的正常生长。再比如，高强度的紫外辐射使dna和蛋白质损伤，引起植物活性氧的累积。为了应对紫外辐射，植物产生了一系列的自我防御机制，比如合成次级代谢物异黄酮，作为“防晒霜”来抵御紫外辐射带来的损伤。
3.大豆异黄酮主要存在于豆科植物中，在大豆种皮、胚轴、和子叶中含量最高。大豆异黄酮是一种天然的雌激素，长期服用弥补女性雌性激素分泌不足的缺陷，调节人体内雌激素水平，从而缓解更年期综合症。此外，异黄酮可预防心血管疾病，防治骨质疏松，是天然的癌症化学预防剂。在大豆中，异黄酮主要分为分为3类，即黄豆苷类（daidzingroups）、染料木苷类（genistingroups）、黄豆黄素苷类（glycitingroups）。每类以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在。
4.在植物生长发育过程中，异黄酮含量的增加可显著提高植物的抗病性。研究表明，紫外辐射促进异黄酮类物质的生成，可能增加植物的抗病能力。uv resistance locus 8 (uvr8)蛋白是近年来唯一鉴定出的植物的紫外光受体，因此过量表达gmuvr8受体蛋白可能会提高响应紫外光信号的能力，促进异黄酮的合成，获得富含异黄酮的植物品系，具有一定的生产应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供gmuvr8基因家族在提高植物异黄酮含量中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：gmuvr8基因家族在提高植物异黄酮含量中的应用，所述gmuvr8基因家族包括以下三个成员：gmuvr8a基因、gmuvr8b基因和gmuvr8c基因；所述gmuvr8a基因编码的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述gmuvr8b基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述gmuvr8c基因编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。
7.进一步的，上述gmuvr8a基因的cds序列如seq id no.4所示；上述gmuvr8b基因的cds序列如seq id no.5所示；上述gmuvr8c基因的cds序列如seq id no.6所示。
8.进一步的，上述植物为大豆。
primer和uvr8a-reverse primer通过高保真dna聚合酶的pcr反应给gmuvr8a加上接头，扩增出带接头的目的基因全长片段：uvr8a-forward primer：5
’‑
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatgaaatgttattttgatggacaatacagga-3’；uvr8a-reverse primer：5
’‑
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcaaacacggagccgttt-3’。
27.利用引物uvr8b-forward primer和uvr8b-reverse primer通过高保真dna聚合酶的pcr反应给gmuvr8b加上接头，扩增出带接头的目的基因片段：uvr8b-forward primer：5
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ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatggaagatgaagtgatgagtgaagt-3’；uvr8b-reverse primer：5
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ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcaattgacatcactttcagggac-3’。
28.利用引物uvr8c-forward primer和uvr8c-reverse primer通过高保真dna聚合酶的pcr反应给gmuvr8c加上接头，扩增出带接头的目的基因片段：uvr8c-forward primer：5
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ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatgctgcactcttcaagtctac-3’；uvr8c-reverse primer：5
’‑
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcaaactcggatccgtttgaca-3’。
29.pcr反应体系：大豆cdna为模板1μl，primer-f和primer-r(引物浓度为10 μmol)各1μl，dntp mix 4μl，prime star gxl 1μl,5xgxl buffer 10μl，ddh2o 32μl。
30.pcr反应条件：98℃ 5min，98℃ 30sec；55℃ 退火30sec；72℃延伸1min30sec，共计30个循环。pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将目的基因片段分别与pdnor221载体（购自invitrogen公司）连接进行bp反应，25℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌dh10b感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序，正确通读的克隆提取质粒，构建入门载体。将入门载体质粒和携带attr位点的pgwb642质粒载体进行lr反应，25℃连接过夜，转化大肠杆菌dh10b感受态细胞，验证阳性克隆。培养阳性克隆，提取并纯化其质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株gv3101中，再对准备好的大豆进行侵染转化。
31.实施例4 大豆稳定转化将农杆菌侵染好的大豆放置在共培养培养基上于25℃培养4天；然后转移至恢复培养基上于25℃培养7天，再转移至含basta的抗性再分化培养基上于25℃培养14天，然后再转移至含植物激素和basta的抗性再分化培养基上于25℃培养14天，最后转移至伸长培养基上于25 ℃培养14天。获得的植株转移到土壤中生长，并用1:1000稀释的basta喷施筛选阳性苗。
32.实施例5 基因表达水平分析用实时荧光定量pcr的方法进行转基因株系的基因表达水平分析。分别提取gmuvr8a，gmuvr8b，gmuvr8c转基因t3代株系以及和野生型株系03-3叶片中rna，使用反转录试剂盒反转得到cdna作为模板，进行实时荧光定量pcr。gmactin-11作为内参基因，以野生型株系03-3的表达水平为1，用
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c(t)法进行分析。所用到的引物如下：uvr8a-forward primer：5’‑
gattctcttgtgcctcaga-3’，uvr8a-reverse primer：5
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agattgtcaccgactcca-3’；uvr8b-forward primer：5
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ggacagattggagttggtaa-3’，uvr8b-reverse primer：5
’‑
ttggaacattgcggtctat-3’；uvr8c-forward primer：5
’‑
tgatcgttgctctcctgt-3’，uvr8c-reverse primer：5
’‑
ccacactcaatgcctcaa-3’。
33.扩增程序：94℃ 3min；94℃ 5sec，60℃ 30sec；共计40个循环。扩增循环结束后，升温至65℃，然后加热升温至95℃变性dna产物。
34.扩增条件：cdna模板1 μl，primer-f和primer-r(引物浓度为10 μmol)各0.3 μl，2 x sybr green qpcr mix 7.5 μl，ddh2o 5.9 μl。
35.大豆转基因t3代株系中gmuvr8a，gmuvr8b，gmuvr8c基因在转录水平的表达量如图2所示。sr1-14和sr1-15为gmuvr8a的表达量，与野生型相比，sr1-14表达量是野生型的8.7倍, sr1-15表达量是野生型的6.8倍；sr2-1和sr2-10为gmuvr8b的表达量，与野生型相比，sr2-1表达量是野生型的72倍, sr2-10表达量是野生型的107倍；sr3-1和sr3-2为gmuvr8c的表达量，与野生型相比，sr3-1表达量是野生型的10.49倍，sr3-2表达量是野生型的3.7倍。
36.实施例6 异黄酮含量测定采用超高效液相色谱法分别测定gmuvr8a，gmuvr8b，gmuvr8c转基因t3代株系以及和野生型株系03-3种子中4种大豆异黄酮类化合物大豆苷、染料木苷、黄豆苷元、染料木素的含量。方法：色谱柱：waters beh c18 100mm
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2.1mm 1.7μm ，流动相：a为0.1%fa water ，b为0.1%fa acn4.2 ，梯度洗脱；流速：0.3 ml/min；柱温：40℃。
37.大豆转基因t3代株系种子中黄豆苷元的含量如图3所示。l14和l15为gmuvr8a黄豆苷元的含量测定，与野生型相比，l14黄豆苷元含量是野生型的2.19倍， l15黄豆苷元含量是野生型的2.21倍； l10为gmuvr8b黄豆苷元的含量测定，与野生型相比，l10黄豆苷元含量是野生型的1.78倍； l1和l2为gmuvr8c黄豆苷元的含量测定，与野生型相比，l1黄豆苷元含量是野生型的3.67倍，l2黄豆苷元含量是野生型的2.77倍。
38.大豆转基因t3代株系种子中大豆苷的含量如图4所示。l14和l15为gmuvr8a大豆苷的含量测定，与野生型相比，l14大豆苷含量是野生型的1.12倍，l15大豆苷含量是野生型的1.08倍； l10为gmuvr8b大豆苷的含量测定，与野生型相比，l10大豆苷含量是野生型的1.1倍；l1和l2为gmuvr8c大豆苷的含量测定，与野生型相比，l1大豆苷含量是野生型的1.25倍，l2大豆苷含量是野生型的1.12倍。
39.大豆转基因t3代株系种子中染料木素的含量如图5所示。l14和l15为gmuvr8a染料木素的含量测定，与野生型相比，l14染料木素含量是野生型的1.17倍，l15染料木素含量是野生型的1.12倍；l1为gmuvr8b染料木素的含量测定，与野生型相比，l1染料木素含量显著
降低；l1和l2为gmuvr8c染料木素的含量测定，与野生型相比，l1染料木素含量是野生型的2.42倍，l2染料木素含量是是野生型的1.8倍。
40.大豆转基因t3代株系种子中染料木苷的含量如图6所示。l14和l15为gmuvr8a染料木苷的含量测定，与野生型相比，l14和l15染料木苷含量无显著变化；l1为gmuvr8b染料木苷的含量测定，与野生型相比，l1染料木苷含量显著降低；l1和l2为gmuvr8c染料木苷的含量测定，与野生型相比，l1染料木苷含量是野生型的1.14倍，l2染料木苷含量是野生型的1.12倍。
41.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。