一株白囊耙齿菌及其在降解果园废弃树枝中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株白囊耙齿菌及其在降解果园废弃树枝中的应用。


背景技术：

2.果园每年会产生大量枯枝落叶等废弃物，废弃的果树枝条由于不合理的处理，直接丢弃园内或简单焚烧，不仅影响果园外观、浪费资源，而且丢弃的枝条给果园害虫提供栖息地，易成为果园病害、虫害的传染源，焚烧枝条也直接对环境造成危害。
3.果园废弃物难降解的部分主要是果园废弃枝条，枝条主要组成成分为木质纤维素。自然条件下，由于其自身物理结构和化学组成的特殊性，木质纤维素具有水不溶性和生物抵抗性，故难以被水解或被微生物直接代谢，从而阻碍其快速降解和再生利用。木质纤维素中纤维素占40％～50％，半纤维素占20％～35％，木质素占15％～30％，纤维素是由d-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，多以排列紧密的微丝状存在，是构成细胞壁的骨架。在微生物利用纤维素之前，必须把它从木质素和半纤维素包裹中释放出来，导致纤维素利用率低且实际操作时间缓慢。半纤维素的结构较纤维素更为复杂，其不仅包括主链骨架，还包含一系列不同的侧链取代基等。半纤维素以无定形状态渗透在骨架物质之中，与细胞分化最后阶段才形成的木质素通过化学键连接，然后包裹在纤维之外，以增加细胞壁的刚性。木质素是结构极复杂的天然有机高分子化合物，也是最难生物降解的有机物之一。木质素是酚类聚合物，单体之间通过醚键和碳碳键相连导致其难以水解。木质素对植物起着支持和保护作用。但也由于难降解的木质素与细胞壁紧密结合使得植物木质纤维结构稳定而不易生物降解。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株白囊耙齿菌及其在降解果园废弃树枝中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的白囊耙齿菌可以提高果园废弃树枝的降解效率。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一株白囊耙齿菌(irpex lacteus)sdau-b，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23855，保藏日期为2021年11月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.本发明还提供一种微生物菌剂，包含上述的白囊耙齿菌。
8.本发明还提供上述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将果树树枝木屑、蝗虫粪和玉米芯混合均匀，并灭菌，之后接种上述的白囊耙齿菌，培养后得到所述微生物菌剂。
9.进一步地，所述果树树枝木屑为苹果树树枝木屑或桃树树枝木屑。
10.进一步地，所述果树树枝木屑、所述蝗虫粪和所述玉米芯的质量比为3:1:1。
11.进一步地，所述培养为在25℃条件下培养20～30d。
12.本发明还提供上述的白囊耙齿菌或微生物菌剂在降解果园废弃树枝中的应用。
13.进一步地，所述废弃树枝为苹果树树枝木或桃树树枝。
14.本发明还提供一种降解果园废弃树枝的方法，包括以下步骤：
15.(1)按照上述的方法制备得到微生物菌剂；
16.(2)将果树树枝木屑、蝗虫粪和玉米芯混合均匀，并灭菌，之后接种步骤(1)制备得到的微生物菌剂，之后进行堆肥降解。
17.进一步地，在步骤(2)中，所述微生物菌剂的接种量为所述果树树枝木屑、所述蝗虫粪和所述玉米芯总重量的50-70％。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.(1)本发明提供的白囊耙齿菌具有降解木质素和纤维素的能力，其中对木质素具有较高的降解效率，其在废弃物堆料物中对木质素的降解率高达46％。
20.(2)本发明提供的白囊耙齿菌能够提高废弃物堆料物中降解酶的活力。
21.(3)本发明提供的白囊耙齿菌能够发挥降解作用促进堆体铵态氮含量增加。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为实施例2表2中试验组0的降解桃树枝废弃物样品图；
24.图2为实施例2表2中试验组1的降解桃树枝废弃物样品图；
25.图3为实施例2表2中试验组2的降解桃树枝废弃物样品图；
26.图4为实施例2表2中试验组3的降解桃树枝废弃物样品图；
27.图5为实施例2表2中试验组4的降解桃树枝废弃物样品图；
28.图6为实施例2表2中试验组5的降解桃树枝废弃物样品图；
29.图7为实施例2表2中试验组6的降解桃树枝废弃物样品图；
30.图8为实施例2表2中试验组7的降解苹果树枝废弃物样品图；
31.图9为实施例2表2中试验组8的降解苹果树枝废弃物样品图；
32.图10为实施例2表2中试验组9的降解苹果树枝废弃物样品图；
33.图11为实施例2表2中试验组10的降解苹果树枝废弃物样品图；
34.图12为实施例2表2中试验组11的降解苹果树枝废弃物样品图；
35.图13为实施例2表2中试验组12的降解苹果树枝废弃物样品图；
36.图14为接种量为50％时桃树枝废弃堆料温度变化图，其中t 50％nb加代表添加腐熟剂，t 50％nb不加代表不添加腐熟剂；
37.图15为接种量为60％时桃树枝废弃堆料温度变化图，其中t 60％nb加代表添加腐熟剂，t 60％nb不加代表不添加腐熟剂；
38.图16为接种量为70％时桃树枝废弃堆料温度变化图，其中t 70％nb加代表添加腐熟剂，t 70％nb不加代表不添加腐熟剂；
39.图17为接种量为50％时苹果树枝废弃堆料温度变化图，其中pg 50％nb加代表添
加腐熟剂，pg 50％nb不加代表不添加腐熟剂；
40.图18为接种量为60％时苹果树枝废弃堆料温度变化图，其中pg 60％nb加代表添加腐熟剂，pg 60％nb不加代表不添加腐熟剂；
41.图19为接种量为70％时苹果树枝废弃堆料温度变化图，其中pg 70％nb加代表添加腐熟剂，pg 70％nb不加代表不添加腐熟剂；
42.图20为sdau-b菌株在桃树废弃物中木聚糖酶活力图，其中“+”代表有腐熟剂；
43.图21为sdau-b菌株在桃树废弃物中cmc酶活力图，其中“+”代表有腐熟剂；
44.图22为sdau-b菌株在苹果树废弃物中木聚糖酶活力图，其中“+”代表有腐熟剂；
45.图23为sdau-b菌株在苹果树废弃物中cmc酶活力图，其中“+”代表有腐熟剂；
46.图24为sdau-b菌株对桃树枝废弃物的减重率，其中“+”代表有腐熟剂；
47.图25为sdau-b菌株对苹果树枝废弃物的减重率，其中“+”代表有腐熟剂；
48.图26为sdau-b菌株对废弃物中纤维素、半纤维素、木质素的降解率；
49.图27为桃树枝堆肥中钾含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
50.图28为苹果树枝堆肥中钾含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
51.图29为桃树枝堆肥中磷含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
52.图30为苹果树枝堆肥中磷含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
53.图31为桃树枝堆肥中硝态氮含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
54.图32为苹果树枝堆肥中硝态氮含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
55.图33为桃树枝堆肥中铵态氮含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂；
56.图34为苹果树枝堆肥中铵态氮含量的变化，其中“加”代表有腐熟剂，“不加”代表没有腐熟剂。
具体实施方式
57.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
58.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
59.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
60.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
61.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
62.以下实施例中，所用培养基、试剂、试验材料和仪器如下：
63.培养基：
64.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。
65.刚果红纤维素琼脂：k2hpo
4 1.0g，mgso4`7h2o 0.5g，琼脂20g，nacl 0.5g，(nh4)2so
4 2.0g，cmc-na 2.0g，刚果红0.2g，水1000ml，ph自然。
66.pda-愈创木酚培养基：pda培养基中加入0.02％的愈创木酚。
67.试剂及试验材料：
68.桦木木聚糖(birchwood xylan，sigma)、刚果红染液、nacl水溶液、腐熟剂(靠山多霸品牌)。
69.dns试剂：酒石酸钾钠(cmc-na)18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，naoh 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中。
70.1％cmc缓冲液：称取1g cmc，溶解在100ml 50mol/l柠檬酸与100mmol磷酸氢二钠缓冲溶液(ph6.0)中。
71.1％木聚糖溶液：用50mmol/lph＝10甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制。
72.1mg/ml木糖标准溶液：无水木糖至于80℃烘箱进行烘干操作，直至木糖重量恒定，准确量取木糖固体0.1g，添加适量蒸馏水充分溶解，并定容至100ml。
73.1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取葡萄糖100mg，添加适量蒸馏水充分溶解，并定容至100ml，置于4℃保存备用。
74.0.16mmol/l乳酸棉兰染色溶液：取azureb染料0.01223g，添加200ml蒸馏水充分溶解，用蒸馏水定容到250ml。
75.72％硫酸溶液：准确量取665ml 98％的浓h2s04缓慢添加至300ml蒸馏水中，再继续用蒸馏水定容至1l。
76.中性洗涤剂：准确称量edta 18.61g、四硼酸钠6.18g置于烧杯内，添加少量的蒸馏水并给予加热使其充分溶解，再添加十二烷基硫酸钠30g，磷酸氢二钠4.56g及10ml乙氧基乙醇，添加蒸馏水并加热烧杯，使所有固体溶解混合，继续添加蒸馏水定容至1l，使用75％硫酸溶液调节该洗涤剂的ph至中性。
77.酸性洗涤剂：准确量取浓硫酸27.2ml置于900ml蒸馏水中，充分混匀后添加十六烷基三甲基漠化胺20g，充分混匀后添加蒸馏水定容至1l。
78.果园废弃枝条来源：直径20mm桃树枝条来源于山东在源生态农业发展有限责任公司的桃园，直径20mm苹果枝条来源于山东泰安角峪的苹果园。将桃树枝条和苹果枝条分别
粉碎成木屑，待用。
79.腐熟剂：主要成分为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纤维素酶、木质素酶、半纤维素酶、维生素。
80.其他材料：蝗虫粪来源于山东在源生态农业发展有限责任公司，玉米芯购买于山东泰安南校区农户。
81.仪器：见表1。
82.表1主要实验仪器清单
[0083][0084][0085]
实施例1菌株的分离、鉴定、保藏
[0086]
一、分离
[0087]
从河南郑州惠济区绿源山水景区的桃树树干采集标本分离得到一株菌，命名为sdau-b。
[0088]
二、鉴定
[0089]
1.形态学鉴定
[0090]
菌株sdau-b菌落白色，薄，轻微升起的棉花絮状，在整个菌落表面放射状排列着一些密集的簇状和羽毛状的气生菌丝体。
[0091]
2.分子生物学鉴定
[0092]
对sdau-b进行its测序，经鉴定sdau-b为白囊耙齿菌。its序列(seq id no：1)如下：
[0093]
tgtgctttgacgggttgtagctggcctctcacgaggcatgtgcacgcctggctcatccactcttaacctctgtgcactttatgtaagagaaaaaaatggtggaagcttccaggatctcgcgagaggtcttcggttgaacaagccgtttttctttcttatgttttactacaaacgcttcagttatagaatgtcaactgtgtataacacatttatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcactccttggtattccgaggagtatgcctgtttgagtctcatggtattctcaacccctaaatttttgtaatgaaggtttagcgggcttggacttggaggttgtgtcggcccttgtcggtcgactcctctgaaatgcattagcgtgaatcttacggatcgccttcagtgtgataattatctgcgctgtggtgttgaagtatttatggtgttcatgcttcgaaccgtctccttgccgagacaatcatttgacaatctgagctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa。
[0094]
三、保藏
[0095]
菌株sdau-b保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23855，保藏日期为2021年11月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0096]
实施例2
[0097]
一、试验方法
[0098]
1.1对木质纤维素的降解能力测定
[0099]
cmc培养基刚果红染色试验：菌株sdau-b接种到cmc培养基，25℃培养5d后，向将含菌落的平板倒入刚果红显色剂，显色反应15min，倒去显色剂，再将平板放入1mol/l的氯化钠溶液中15min，纤维素被降解部分的刚果红就会被洗脱，形成透明圈，表明对应的菌种能分泌纤维素酶，能降解纤维素，测菌落直径(d，cm)和水解圈直径(d，cm)，采用dp表示水解能力dp＝(d/d)2。若透明圈的直径与菌落直径比值越大，则该菌的纤维素降解能力越强。
[0100]
pda-愈创木酚显色试验：菌株sdau-b接种到pda-愈创木酚培养基，25℃培养5d后，观察无色的愈创木酚是否能够被漆酶氧化为红棕色，如果产生红棕色氧化圈，则三种真菌能够产生漆酶，测菌落直径(d，cm)和水解圈直径(d，cm)，采用dp表示水解能力dp＝(d/d)2。若氧化圈的直径与菌落直径比值越大，判断出相应菌株产生漆酶活性的高低，进而定性的检测菌株是否能够去除木质素。
[0101]
1.2对果园废弃物降解效果
[0102]
1.2.1固体菌剂制备
[0103]
从4℃冰箱中取出实验室保存的sdau-b菌株，挑出少量菌丝接种至pda培养基上，于25℃培养箱内培养3-5d后取菌落边缘生长旺盛处再次接种于pda培养基上，25℃培养5d，用打孔器从pda培养基平板内菌落边缘直径为7mm厚度约为2mm的菌饼。将粉碎成20mm直径的苹果枝/桃树枝木屑与蝗虫粪和玉米芯按3:1:1的质量比例预湿并混匀，调整含水量到60％左右后装入聚丙烯菌袋(规格：12cm
×
24cm)中125℃条件下灭菌120min，冷却后每个菌袋接入一种真菌的8个菌饼置于25℃条件下培养20～30d，从而制备得固体菌剂。
[0104]
1.2.2对果园废弃物降解
[0105]
设置每堆降解料重5kg，每堆加入1kg蝗虫粪和1kg玉米芯，添加3kg苹果树枝或桃树枝木屑，搅拌均匀，于121℃温度条件下灭菌30min，根据表2分别对混有苹果数枝或桃树
枝的果园废弃物降解料接种50wt％、60wt％、70wt％不同菌剂量的1.2.1制备的固体菌剂，并将是否添加腐熟剂作为另一个变量，将不接入任何真菌的样品设为空白对照，同时每组样品设置3组重复。
[0106]
配置后的果园废弃物实验组和对照组均置于恒温25℃恒湿60％空调房中，连续降解30天，观察样品降解过程变化并对观察到的样品物理性状变化进行记录。
[0107]
表2固体菌剂接种量及样品组成设计表
[0108][0109]
注：bn表示白囊耙齿菌sdau-b，“/”表示不加腐熟剂、“+”表示加腐熟剂。
[0110]
1.2.3对果园废弃物降解中堆料温度的测定
[0111]
检测每组堆料样品的中心温度变化，采用温度计每隔5d于每天中午12点测量堆肥样品温度，每组样品取三个测样点同处理样品重复三次，获得温度测量平均值为样品温度值。
[0112]
1.2.4对果园废弃物降解前后废弃物重量的测定
[0113]
使用电子天平准确称量开始进行实验时所有实验组和空白组样品在完成接种和腐熟剂添加后的重量(记为初始重量)，在降解培养30天后再准确称取样品重量(记作最终重量)，获得所有实验样品3组平行实验数据。
[0114]
1.2.5对果园废弃物降解前后木质纤维素含量的测定
[0115]
对降解开始时与降解完成后的样品进行纤维素、木质素和半纤维素含量测定，测定方法如下：
[0116]
(1)准确称取样品重量0.500g置于80℃烘箱中充分烘干至重量恒定，移入规格为150ml的三角瓶内，添加中性洗涤剂50ml，而后将样品放入高压锅在高温100℃温度条件下保持1小时。
[0117]
(2)采用平底玻璃砂芯土(预先称量其重量，记作w0)进行过滤操作，过滤产生的滤渣进一步用热水清洗，直至清洗水的ph＝7.0左右。继续用无水乙醇、丙酮依次清洗两次，转移到烘箱内，设置烘箱温度为80℃进行烘干操作，直至样品重量保持恒定，称取过滤土及样品的总重量记作w1。
[0118]
(3)将上述步骤(2)中的带有过滤砂芯土的样品转移到150ml烧杯内，继续添加酸性洗涤剂50ml后，转移至高压锅在高温100℃温度条件下保持50min，取出后再用温水进行洗涤，直至清洗水的ph＝7.0左右。采用95％乙醇、无水乙醇和丙酮依次洗涤两次，移入80℃烘箱进行烘干操作，直至样品重量保持恒定，称取过滤土及样品的总重量记作w2。
[0119]
(4)继续将上述步骤(3)完成的带有过滤砂芯土的样品转移到150ml烧杯内，添加
预先制冷的75％硫酸溶液5ml，将样品置于室温条件下进行水解反应3h，而后继续加入蒸馏水45ml，置于室温条件下放置过夜，第二天采用蒸馏水洗涤样品，直至清洗水的ph＝7.0左右，将样品移入80℃烘箱进行烘干操作，直至样品重量保持恒定，称取过滤土及样品的总重量记作w3。
[0120]
(5)最终将上述步骤(4)完成的带有过滤砂芯土的样品转移到马弗炉，设置温度为550℃进行灰化操作，用时4h，而后冷却干燥器，称取样品重量记作w4。
[0121]
计算方法：
[0122]
纤维素百分含量c1(％)＝(w
2-w0)-(w
3-w0)-(w4–
w0)]/0.500
×
100％；
[0123]
木质素百分含量c2(％)＝(w
3-w4)/0.500
×
100％
[0124]
半纤维素百分含量c3(％)＝(w
2-w3)/0.500
×
100％
[0125]
纤维素降解率(％)＝(降解开始时c1-降解30天后的样品c1)/降解开始前c1
×
100％
[0126]
木质素降解率(％)＝(降解开始时c2-降解30天后的样品c2)/降解开始前c2
×
100％
[0127]
半纤维素降解率(％)＝(降解开始时c3-降解30天后的样品c3)/降解开始前c3
×
100％
[0128]
1.2.6对果园废弃物中的降解酶酶活力测定
[0129]
从经过降解培养完成的样品提取菌种，接入pdb培养基中进行培养，28℃，120rmp条件下进行培养，培养完成后在12000rmp转速条件下离心10min获得粗酶溶液。
[0130]
(1)木聚糖酶活检测：
[0131]
量取底物1％木聚糖溶液10ml，50℃预热3min，添加1ml粗酶溶液充分混合，在恒温水浴50℃条件下充分水解50min，继续添加1.5mldns试剂混合，沸水浴10min，冷却后将反应溶液定容至20ml，将样品至于波长λ＝540nm处测定吸光度值。
[0132]
标准曲线的绘制：取20ml比色管6支，编号1-6，依次添加1mg/ml木糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0ml，均添加dns试剂1.5ml，在沸水充分蒸煮5ml，冷却后添加蒸馏水定容至20ml，摇匀后静置20min，于波长λ＝540nm处测定吸光度值。
[0133]
(2)纤维素酶活测定：
[0134]
本实验测定的纤维素酶为糖苷酶(cmc)，量取底物1％葡萄糖溶液溶液10ml中，50℃预热3min，添加1ml粗酶溶液与cmc缓冲液的混合溶液，在恒温水浴40℃条件下充分水解60min，继续添加1.5mldns试剂混合，沸水浴10min，冷却后将反应溶液定容至20ml，将样品至于波长λ＝540nm处测定吸光度值。
[0135]
标准曲线的绘制：取20ml比色管8支，编号1-8，依次添加1mg/ml葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6ml，均添加dns试剂1.5ml，在沸水充分蒸煮5ml，冷却后添加蒸馏水定容至20ml，摇匀后静置20min，于波长λ＝540nm处测定吸光度值。
[0136]
1.2.7对果园废弃物降解前后相关营养元素含量测定
[0137]
利用火焰光度计法测定钾元素，分光光度计法测定磷元素，分光光度计法测定硝态氮，分光光度计法测定铵态氮。
[0138]
1.2.7.1火焰光度计法测定钾元素
[0139]
(1)1mol/l中性nh4oac溶液：称取化学纯ch3coonh477.09 g，用蒸馏水溶解后转移到1l容量瓶中定容近1l。用hoac和nh4oh调节ph＝7.0，然后稀释至1l。
[0140]
(2)钾标准溶液：准确称取烘干的分析纯kcl 1.9068g溶于水中，定容至1l，摇匀，即含钾1000mg/l。吸取上述溶液25ml，在250ml容量瓶中定容摇匀，即为含钾100mg/l的标准溶液。
[0141]
(3)样品的测定：用百分之一天平称取土样5g，放入150ml塑料浸提瓶中，用移液管加入50ml中性nh4oac溶液，盖好瓶盖后在振荡机上振荡30分钟，取出干过滤，滤液盛于一小三角瓶中，同钾标准系列一起在火焰光度计上测定，记录检流计读数，在标准曲线上查出相应的浓度，根据公式计算土壤速效钾含量。
[0142]
(4)标准曲线的绘制：用100mg/l k标准溶液分别在100ml容量瓶中配成5、10、20、30、50mg/l k标准系列溶液，均用1mol/l中性醋酸铵溶液定容。先用50mg/l k标准溶液供火焰光度计喷雾燃烧，调节光栅，使检流计的标尺上有最大读数，然后依次测定各级标准溶液。记下检流计读数，最后在方格纸上以浓度为横坐标，检流计读数为纵坐标，绘制标准曲线。
[0143]
1.2.7.2分光光度计法测定磷元素
[0144]
(1)0.5mol/l碳酸氢钠溶液：称取化学纯碳酸氢钠42g，溶于800ml蒸馏水中。冷却后，以0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph为8.5，洗入1000ml容量瓶中，定容至刻度，贮存于试剂瓶中。
[0145]
(2)7.5mol/l 1/2h2so4钼锑贮存液：取蒸馏水约400ml，放入1000ml烧杯中，将烧杯浸在冷水中，然后缓缓注入分析纯浓硫酸208.3ml，并不断搅拌，冷却至室温。另称取分析纯钼酸铵20g，溶于50℃的200ml蒸馏水中，冷却。然后将硫酸溶液徐徐倒入钼酸铵溶液中，不断搅拌，再加100ml 0.5％酒石酸锑钾溶液，用蒸馏水稀释至1000ml，摇匀，贮于棕色试剂瓶中。
[0146]
(3)钼锑抗混合显色剂：于100ml钼锑贮存液中，加入1.5g左旋抗坏血酸，摇匀，贮于试剂瓶中，该液现用现配。
[0147]
(4)磷(p)标准溶液：准确称取45℃烘干4-8小时的分析纯磷酸二氢钾0.2197g于小烧杯中，以少量蒸馏水溶解，将溶液全部洗入1000ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分摇匀，此溶液即为含50mg/l磷的标准溶液。精确吸取50ml此溶液，用蒸馏水稀释定容至500ml，摇匀，即为5mg/l的磷标准溶液(此溶液不能长久保存)，比色时按标准曲线系统配制。
[0148]
(5)0.5mol/l氢氧化钠溶液：溶解20g氢氧化钠于1000ml蒸馏水中，摇匀，静置后使用。
[0149]
(6)土壤浸提：用百分之一天平称取过1mm筛孔的风干土5g，置于250ml塑料浸提瓶中，准确加入0.5mol/l碳酸氧钠溶液100ml，再加入一勺无磷活性炭，加盖后在振荡机上振荡30分钟，然后用于燥无磷滤纸过滤，滤液承接于100ml干燥的三角瓶中。
[0150]
(7)待测液中磷的测定：吸取滤液10ml于50ml容量瓶中，然后沿容量瓶壁慢慢加入硫酸钼锑抗混合显色剂5ml，充分摇匀，排出二氧化碳后，加蒸馏水至刻度，再充分摇匀。放置30分钟后在分光光度计上以波长660nm光和1cm光经比色杯进行比色测定。颜色稳定时间
为24小时。比色测定同时做空白试验(即用0.5mol/l碳酸氢钠试剂代替试液，其他步骤与上相同)。从测得的消光度值，对照标准曲线查出待测液中磷的含量，然后计算出土壤中速效磷的含量。
[0151]
(8)标准曲线的绘制：分别吸取5mg/l磷标准溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml的容量瓶中，再逐个加入0.5mol/l碳酸氢钠溶液10ml。并沿容量瓶壁慢慢加入硫酸钼锑抗混合显色剂5ml，充分摇匀，排出co2后，加蒸馏水定容至刻度，充分摇匀。此系列溶液磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/l。静置30分钟，然后同待测液一样进行比色。以溶液浓度为横坐标光密度的读数为纵坐标，在方格纸上绘制标准曲线。
[0152]
1.2.7.3分光光度计法测定氮元素—硝态氮的测定
[0153]
(1)硝酸根标准贮备溶液，0.1mg/ml：称取0.1631g已在105℃～110℃烘干1h的硝酸钾，用蒸馏水溶解。移入1000ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀。此溶液1.00ml含0.10mg硝酸根。
[0154]
(2)硝酸根标准溶液，10.0μg/ml：吸取10.00ml硝酸根标准贮备溶液(100μg/ml)于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。此溶液1.00ml含10.0μg硝酸根。
[0155]
(3)标准曲线的绘制：准确分取0、10.0、20.0、50.0、100、200、400、600、800、1000μg硝酸根标准溶液于一系列100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至50ml，比色。
[0156]
(4)称取相当于10.00g干土的新鲜土样准确到0.01g，置于200ml三角瓶中，加入氯化钾溶液100ml，塞紧塞子，在振荡机上振荡1h。取出静置(约30min)，用滤纸过滤悬浊液，吸取一定量上层清液进行分析。将滤液储存在冰箱中备用。
[0157]
测定浸提液在220nm和275nm处吸光度a
220
和a
275
。按下式计算校正吸光度a:
[0158]
a＝a
220-fa
275
(f取2.0)
[0159]
采用文献“norman r j,edberg j c,stucki j w.determination ofnitrate in soil extract by dual-wavelength ultraviolet spectrophotometry[j].soil science society of america journal abstract,1985,49(5):1182-1185”的方法去除浸提液中的硝态氮，测定处理后的溶液在220nm和275nm处的吸光度，计算二者的比值，即为f。建立a值与硝态氮浓度之间的相关曲线后，就可算出浸提液中硝态氮浓度。
[0160]
1.2.7.4分光光度计法测定氮元素—铵态氮的测定
[0161]
(1)2mol/l kcl溶液：称kcl 149.1g溶解于1l水中。
[0162]
(2)苯酚溶液。称取苯酚10g和硝普钠100mg稀释至1l。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。注意硝普钠有剧毒！
[0163]
(3)次氯酸钠碱性溶液：称取naoh10 g、磷酸氢二钠7.06g、磷酸钠31.8g和52.5g/l次氯酸钠10ml溶于水中，稀释至1l，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
[0164]
(4)掩蔽剂：将400g/l的酒石酸钾钠与100g/l的edta二钠盐溶液等体积混合。每100ml混合液中加入10mol/l氢氧化钠溶液0.5ml。
[0165]
(5)2.50μg/ml铵态氮(nh
4+-n)标准溶液：称取干燥的硫酸铵0.4717g溶于水中，洗入容量瓶中定溶至1l，制备成含铵态氮100μg/ml的贮存溶液，使用前将其加水稀释20倍，即配置成含铵态氮(n)5μg/ml的标准溶液备用。
[0166]
(6)浸提。称取相当于10.00g干土的新鲜土样准确到0.01g，置于200ml三角瓶中，加入氯化钾溶液100ml，塞紧塞子，在振荡机上振荡1h。取出静置(约30min)，待土壤—氯化
钾悬浊液澄清后，吸取一定量上层清液进行分析。
[0167]
(7)吸光度测量。吸取土壤浸出液2ml-10ml放入50ml容量瓶中，用氯化钾溶液补充到10ml，然后依次加入苯酚溶液5ml和次氯酸钠碱性溶液5ml，摇匀。在20℃左右的室温下放置1h后，加掩蔽剂1ml以溶解可能产生的沉淀物，然后用水定溶至刻度。用1cm比色槽在625nm波长处进行比色，读取吸光度。
[0168]
(8)工作曲线。分别吸取0.00ml，0.50ml，1.00ml，2.00ml，3.00ml，4.00ml，5.00ml nh
4+-n标准溶液于50ml容量瓶中，各加10ml氯化钾溶液，后比色测定。各瓶标准液的浓度相应地为铵态n 0mg/l，0.05mg/l，0.1mg/l，0.2mg/l，0.3mg/l，0.4mg/l，0.5mg/l。
[0169]
1.3数据处理
[0170]
所有实验均设有3组平行实验，数据采用软件spss 22.0计算平均值和标准差，使用duncan's分析各个处理之间的差异显著性。所有数据图均由origin 8.5软件制作。
[0171]
二、试验结果
[0172]
2.1对木质纤维素的降解能力
[0173]
2.1.1对纤维素的降解能力
[0174]
sdau-b菌株对纤维素的降解能力测定结果见表3，可见sdau-b菌株具有降解纤维素的能力。
[0175]
表3对纤维素的降解能力
[0176][0177]
2.1.2对木质素的降解能力
[0178]
sdau-b菌株对纤维素的降解能力测定结果见表4，可见sdau-b菌株具有降解木质素的能力。
[0179]
表4对木质素的降解能力
[0180][0181][0182]
注：同列数值后不同小写字母表示在p《0.05水平上差异显著
[0183]
2.2对果园废弃物降解结果
[0184]
2.2.1对桃树枝废弃物降解结果
[0185]
按表2设计的各试验组对桃树枝废弃物降解30天的降解变化观察结果如图1所示。
[0186]
未接入任何菌种的空白对照组(图1)，样品在降解培养了25天时也能够观察到明显的白色菌落，主要是因为桃树枝随着发酵降解时间的延续，其本身发生腐烂病变表现出降解物理性状。
[0187]
由图2-图7可以看出，接种量50％sdau-b的样品中，添加腐熟剂后在培养第20天时出现显著菌落，而未加腐熟剂的样品在降解11天时便能观察到显著菌落，表明腐熟剂的添加可能一定程度上抑制了白囊耙齿菌的生长；但是相对而言，添加腐熟剂的样品在降解30天是腐殖化程度更加明显，废弃物变色程度较未添加腐熟剂的样品更显著；接种了60％sdau-b的苹果树枝废弃物样品降解情况与50％接种量时基本一致；接种了70％三种真菌的样品均未因添加腐熟剂表现出显著的促进降解现象，相反的，未添加腐熟剂的样品菌落生长状态更加显著。由此可知，腐熟剂的添加仅能够促进接种60％sdau-b中真菌菌落的生长，而在其他情况下并无显著促进作用；接种70％sdau-b的试验组，未因添加腐熟剂表现出显著的促进降解现象，相反的，未添加腐熟剂的样品菌落生长状态更加显著。因此，利用sdau-b进行苹果树枝废弃物降解时，建议不添加腐熟剂。
[0188]
2.2.2对苹果树枝废弃物降解结果
[0189]
由图9-图13可以看出，接种量为50％,的样品在添加腐熟剂条件下，在降解进行到20天以后，样品上菌落生长情况较为显著。未添加腐熟剂的样品，白囊耙齿菌的菌落生长较为显著，腐熟剂的添加对于70％真菌接种量的苹果树枝废弃物样品的降解作用存在一定抑制作用。白囊耙齿菌随着接种量的提升，其菌落生长程度逐渐提升，接种量为50％和60％时，菌落覆盖较完全的降解时间是培养30天左右，但接种量达到70％时，在降解培养的第25天便出现了大面积白色菌落。白囊耙齿菌的菌落生长在无腐熟剂环境中更优，而接种量的提高，对白囊耙齿菌是促进作用。分析其原因为：白囊耙齿菌的添加量未达到饱和状态，随着接种量的增加苹果树枝废弃物环境利于接种后更多菌的生长。
[0190]
2.3对果园废弃物降解温度的影响
[0191]
2.3.1对桃树枝废弃物降解温度的影响
[0192]
sdau-b对桃树枝废弃物降解温度的影响见图14-16。添加了白囊耙齿菌sdau-b和腐熟剂的桃树枝废弃物样品都在降解培养的第20天发生了温度下降的情况，分析原因是在前期培养过程中，在腐熟剂的促进作用下白囊耙齿菌好氧反应激烈，而后在降解三周左右，堆料中的氧气含量逐渐减少，导致料堆中的厌氧吸热反应发生，所以堆料温度开始出现下降。通过及时翻堆通风操作可以解决这一问题，进而使白囊耙齿菌继续保持快速降解反应趋势。
[0193]
2.3.2对苹果树枝废弃物堆料温度的影响
[0194]
sdau-b对苹果树枝废弃物堆料温度的影响见图17-19。sdau-b对苹果树枝废弃物堆料中的温度影响和桃树枝废弃物堆料温度变化趋同，表现为随着降解培养时间的推移，苹果树枝的废弃物料堆温度也在随之升高，且升温速度逐渐加快现象。苹果树枝废弃物堆料中，接种量70％的样品堆料温度都在第20天出现下降现象，较桃树枝温度下降现象出现的更多。分析其原因为：苹果树枝废弃物料堆中的降解反应较桃树枝料堆中的更为剧烈，好氧真菌的降解活动更旺盛，因此对料堆中氧气消耗更快，且降解产生的腐殖质使苹果树枝废弃物堆的物料密度更高，料堆内氧气不足加之通风不畅，造成压氧菌生长、降解作用减缓，从而导致温度较桃树枝废弃物堆料下降的更为明显。实验过程中及时发现了该问题并通过翻堆通风操作进行解决。并未影响后续真菌的降解反应。
[0195]
2.4降解酶酶活力
[0196]
2.4.1 sdau-b在桃树枝废弃物中的降解酶活力
[0197]
sdau-b在桃树枝废弃物中的木聚糖酶和cmc酶活力分别见图20和图21，添加腐熟剂的白囊耙齿菌能够表现出更高的降解酶活力。
[0198]
2.4.2 sdau-b在苹果树枝废弃物中的降解酶活力
[0199]
sdau-b在苹果树枝废弃物中的木聚糖酶和cmc酶活力分别见图22和图23，在添加了腐熟剂条件下，当苹果树废弃物接种了白囊耙齿菌后，废弃物料堆体系的木聚糖酶显著提高。
[0200]
2.5果园废弃枝条降解前后质量变化
[0201]
2.5.1桃树枝废弃物降解前后质量变化
[0202]
通过称量所有样品降解前后的重量，可以从桃树枝废弃物堆料的质量减少情况分析sdau-b菌株对堆料的降解程度。由图24可知，添加了腐熟剂的堆料降解率较未添加腐熟剂的降解率更高，说明腐熟剂的添加的确起到了促进降解的效果。其中降解程度最显著的是添加腐熟剂且接种了60％白囊耙齿菌的桃树枝废弃物体系，堆料减重率达到35％，对比未添加腐熟剂且白囊耙齿菌接种量相同的样品体系，减重率仅有5％，能够得到腐熟剂的添加对白囊耙齿菌降解效果有明显的促进作用。
[0203]
2.5.2苹果树枝废弃物降解前后质量变化
[0204]
分析苹果树枝废弃物堆料的质量减少情况进一步分析sdau-b菌株对该料堆的降解情况。由图25可知，降解程度最显著的是添加腐熟剂且接种了60％白囊耙齿菌的苹果树枝废弃物体系，堆料减重率达到33％，且对比未添加腐熟剂且白囊耙齿菌接种量相同的样品体系，减重率仅有8％，得出添加腐熟剂能够显著促进白囊耙齿菌的降解作用。
[0205]
2.6树枝废弃物中木质纤维素含量变化
[0206]
根据图26可知，白囊耙齿菌对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为35％、43％和46％，说明白囊耙齿菌对木质素的降解作用显著，且相比较而言，白囊耙齿菌木质素具有一定的选择降解能力，具备将果园废弃物进行饲料化降解的优势。
[0207]
2.7 sdau-b菌株对果园废弃物降解前后相关营养元素含量测定
[0208]
2.7.1 sdau-b菌株对堆肥中钾元素含量的影响
[0209]
桃树枝堆肥和苹果树枝堆肥中钾元素的含量变化分别见图27和图28，钾的含量基本不具变化趋势，树枝堆体钾的含量始终处于58.6-58.7之间，变化极微，证明sdau-b菌株和有无腐熟剂对于桃树、苹果树枝条堆肥中钾的含量基本不具作用效果。
[0210]
2.7.2 sdau-b菌株对堆肥中磷元素含量的影响
[0211]
桃树枝堆肥和苹果树枝堆肥中磷元素的含量变化分别见图29和图30，磷的含量呈上升的趋势，白囊耙齿菌的作用效果较好。
[0212]
2.7.3 sdau-b菌株对堆肥中硝态氮含量的影响
[0213]
桃树枝堆肥和苹果树枝堆肥中硝态氮的含量变化分别见图31和图32，堆体中基本不含硝态氮，腐熟剂对增加堆肥中硝态氮的含量具有一定作用。
[0214]
2.7.4 sdau-b菌株对堆肥中铵态氮含量的影响
[0215]
桃树枝堆肥和苹果树枝堆肥中铵态氮的含量变化分别见图33和图34，经白囊耙齿菌处理的桃树枝堆肥，添加腐熟剂的处理比不加腐熟剂的处理效果好。
[0216]
综上，白囊耙齿菌表现出对木质素较高的降解效率，其在废弃物堆料物中对木质素的降解率高达46％；添加腐熟剂、接种量达到60％会有效提升白囊耙齿菌降解酶的活力；
腐熟剂的添加能够显著提升接种白囊耙齿菌的废弃物样品降解效果，腐熟剂能够和白囊耙齿菌之间实现菌落间的协同增效作用，腐熟剂的添加不仅促进了废弃物中木质纤维素等有机营养物质的降解，还能够引导和辅助白囊耙齿菌快速进入旺盛的降解反应状态，引导其更好地进行代谢活动；白囊耙齿菌能够发挥降解作用促进堆体铵态氮含量增加，添加了腐熟剂的白囊耙齿菌对铵态氮更有影响(分析原因，可能是由于一方面树枝中木质素含量较多，白囊耙齿菌降解木质素效果较好，所以对铵态氮含量影响最显著，另一方面由于腐熟剂中含由多种微生物，与白囊耙齿菌共同作用能够促进树枝的降解，使其中的有机氮得到分解)。
[0217]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。