裂殖壶菌的表达载体、表达载体的构建方法及应用与流程

1.本公开属于基因工程领域，特别涉及一种裂殖壶菌的表达载体、表达载体的构建方法及应用。


背景技术：

2.裂殖壶菌属于破囊壶科的异养型真核生物，具有快速的二分裂和释放游动孢子的能力，且能利用多种碳源作为底物进行高密度发酵生产多种不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(docosatetraenoic acid，dha)。近年来发现某些裂殖壶菌还能合成类胡萝卜素，如β-胡萝卜素和虾青素(astaxanthin)。类胡萝卜素可作为抗氧化剂或着色剂用于食品、保健品、化妆品及动物养殖领域，具有可观的应用前景。由于裂殖壶菌虾青素及其类胡萝卜素的合成机制和代谢调控机理尚未揭示，相关的研究进入瓶颈期。现阶段主要采用随机诱导突变、优化培养方式等手段来提高裂殖壶菌的类胡萝卜素合成。
3.目前已有研究将电穿孔转化法、基因枪转化法、农杆菌介导的转化法应用于构建裂殖壶菌的遗传操作系统。例如利用电穿孔转化法、基因枪法或农杆菌转化法已成功将目的基因以同源臂整合的方式插入染色体进行基因过表达，或是利用crispr/cas 9系统对裂殖壶菌染色体中相关基因敲除。但相较于模式菌株，裂殖壶菌的遗传操作系统还处于不成熟的阶段，仍存在基因编辑元件较少、转化子筛选复杂等问题，制约了裂殖壶菌的基因编辑效率，从而阻碍了裂殖壶菌应用的扩展。


技术实现要素：

4.本公开实施例提供了一种裂殖壶菌的表达载体、表达载体的构建方法及应用，可以进行基因编辑元件的测试和转化子的快速筛选。所述技术方案如下：
5.本公开实施例提供了一种表达载体，所述表达载体包括：psc-18s rdna载体、裂殖壶菌的启动子和终止子的组合、抗性基因和含有荧光基因的基因盒；
6.所述启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子pt和终止子tt的组合、启动子pa1和终止子ta1的组合、启动子pa2和终止子ta2的组合、以及启动子pe2和终止子te的组合。
7.在本公开的又一种实现方式中，所述抗性基因为g418抗性基因nptⅱ。
8.在本公开的又一种实现方式中，所述荧光基因为egfp荧光基因或者dsred荧光基因。
9.在本公开的又一种实现方式中，所述启动子pt、所述启动子pa1、所述启动子pa2、所述启动子pe2，所述终止子tt、所述终止子ta、所述终止子te的引物扩增序列(该引物包含部分载体部分序列以便基因元件的组装)如srq id no:1-8所示。
10.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种适用于裂殖壶菌的表达载体的构建方法，所述构建方法包括：
11.获取裂殖壶菌的启动子和终止子的组合，所述启动子和终止子的组合包括以下组
合中的至少一种：启动子pt和终止子tt的组合、启动子pa1和终止子ta1的组合、启动子pa2和终止子ta2的组合、以及启动子pe2和终止子te的组合；
12.将所述启动子和终止子的组合组装在psc-18s rdna载体中，得到包含启动子和终止子元件的psc-18s rdna-p-t载体；
13.将荧光基因和抗性基因组装至所述psc-18s rdna-p-t载体中，得到所述表达载体。
14.在本公开的又一种实现方式中，所述获取裂殖壶菌的启动子和终止子的组合，包括：
15.从所述裂殖壶菌中选取基因actin、基因elongation和基因tubulin；
16.分别获取所述基因actin、所述基因tubulin和所述基因elongation的上下游2000bp的基因序列作为基因元件分析序列；
17.根据各个所述基因序列，分析得到所述裂殖壶菌的启动子和终止子的组合。
18.在本公开的又一种实现方式中，所述psc-18s rdna载体通过以下方式获得：
19.获取pylxp’载体上的复制元件和氨苄抗性基因和18s rdna上下游基因序列；
20.对所述pylxp’载体进行双酶切；
21.将双酶切之后的所述pylxp’载体上的复制元件和氨苄抗性基因与所述18s rdna上下游基因序列进行组装，得到所述psc-18s rdna载体。
22.在本公开的又一种实现方式中，所述将所述启动子和终止子的组合组装在psc-18s rdna载体中，得到包含启动子和终止子元件的psc-18s rdna-p-t载体，包括：
23.将所述启动子和终止子的组合中的启动子和终止子进行扩增；
24.将扩增后的所述启动子和终止子的组合克隆到所述psc-18s rdna载体中，得到所述包含启动子和终止子元件的psc-18s rdna-p-t载体。
25.在本公开的又一种实现方式中，所述抗性基因为g418抗性基因nptⅱ，所述荧光基因为egfp荧光基因或者dsred荧光基因。
26.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种裂殖壶菌的表达载体的应用，所述表达载体应用在所述裂殖壶菌的基因编辑中。
27.本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
28.通过本公开实施例提供的裂殖壶菌的表达载体应用在裂殖壶菌的基因编辑中时，由于该表达载体中包括抗性基因和含有荧光基因的基因盒，所以，在进行基因编辑时，可以通过抗性基因和荧光基因以融合蛋白的表达形式作为双筛标记，以此便于基因元件测试和筛选转化子，简化筛选程序，进而使得转化学系统简化。
附图说明
29.为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本公开实施例提供的一种用于裂殖壶菌的表达载体的构建方法的流程图；
31.图2是本公开实施例提供的另一种用于裂殖壶菌的表达载体的构建方法的流程
图；
32.图3为psc-18s rdna载体的组装示意图；
33.图4为psc-18s rdna-p-t载体的组装示意图；
34.图5为启动子和终止子的检测示意图；
35.图6为表达载体的组装示意图；
36.图7为8个载体的pcr检测结果示意图；
37.图8为psc-pa2-yreis-pe2-egfp的组装示意图。
具体实施方式
38.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
39.本公开实施例提供了一种裂殖壶菌的表达载体，表达载体包括：psc-18s rdna载体、裂殖壶菌的启动子和终止子的组合、抗性-荧光双筛选标记的基因序列。
40.启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子pt和终止子tt的组合、启动子pa1和终止子ta的组合、启动子pa2和终止子ta的组合以及启动子pe2和终止子te的组合。
41.通过本公开实施例提供的裂殖壶菌的表达载体应用在裂殖壶菌的基因编辑中时，由于该表达载体中包括启动子和终止子的组合、抗性-荧光双筛标记的基因序列，所以，在进行基因编辑时，可以通过启动子和终止子的组合作为基因的表达元件，同时又可以通过抗性基因和荧光基因以融合蛋白的表达形式作为双筛标记，以此便于基因元件测试和筛选转化子，简化筛选程序，进而使得转化学系统简化。
42.可选地，抗性-荧光双筛选标记的基因序列所对应的抗性基因为g418抗性基因nptⅱ。g418是一种氨基糖苷类抗生素。裂殖壶菌在2mg/ml的g418平板是完全无法生长的，因此可以将g418抗性基因nptⅱ作为抗性基因。
43.本实施例中，将2mg/ml的g418作为筛选表达载体在裂殖壶菌进行转化后形成转化子的筛选浓度。
44.可选地，抗性-荧光双筛选标记的基因序列所对应的荧光基因为egfp荧光基因或者dsred荧光基因。
45.dsred荧光基因是一种来自于香菇珊瑚(discosoma sp.)的荧光基因，在进行表达之后，能在560nm及红外下被激发红色荧光，而egfp基因在进行表达之后，能在488nm以及紫外下被激发出绿色荧光。
46.可选地，启动子pa1、启动子pt、启动子pe2、启动子pa2，终止子tt、终止子ta、终止子te的扩增引物序列如srq id no:1-8所示或者参见下表。
47.表1扩增引物序列表
[0048][0049]
本公开实施例提供了一种用于裂殖壶菌的表达载体的构建方法，如图1所示，构建方法包括：
[0050]
s101：获取裂殖壶菌的启动子和终止子的组合，启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子pt和终止子tt的组合、启动子pa1和终止子ta的组合、启动子pa2和终止子ta的组合以及启动子pe2和终止子te的组合。
[0051]
s102：将启动子和终止子的组合组装在psc-18s rdna载体上，得到包含启动子和终止子元件的psc-18s rdna-p-t载体。
[0052]
s103：将抗性-荧光双筛选标记的基因序列组装至psc-18s rdna-p-t载体上，得到表达载体。
[0053]
通过本公开实施例提供的裂殖壶菌的表达载体应用在裂殖壶菌的基因编辑中时，由于该表达载体中包括psc-18s rdna载体序列、启动子和终止子的组合、抗性-荧光双筛选标记的基因序列，所以，在进行基因编辑时，可以通过更换不同的基因表达元件来表达抗性-荧光双筛选标记的融合蛋白来测试表达元件的功能，同时又可以将目的基因组装在该表达载体上，进行内源基因表达时，可以通过抗性基因和荧光基因作为双筛标记，以此便于筛选转化子，简化筛选程序，进而使得转化系统简化。
[0054]
图2是本公开实施例提供的另一种用于裂殖壶菌的表达载体的构建方法的流程图，结合图2，构建方法包括：
[0055]
s201：获取裂殖壶菌的启动子和终止子的组合，启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子pt和终止子tt的组合、启动子pa1和终止子ta的组合、启动子pa2和终止子ta的组合以及启动子pe2和终止子te的组合。
[0056]
示例性地，s201包括：
[0057]
2011：从裂殖壶菌中选取基因actin、基因elongation和基因tubulin。
[0058]
通过对裂殖壶菌生长对数期和稳定期的基因转录水平进行分析，选择管家基因中转录水平持续较高的actin、elongation和转录水平中等的tubulin作为基因表达元件的目的基因。
[0059]
2012：分别获取基因actin、基因tubulin和基因elongation的上下游2000bp的基因序列，得到启动子和终止子元件分析的序列。
[0060]
通过对转录水平高表达的基因的基因组序列分析，分别获取基因actin、基因tubulin和基因elongation的上下游2000bp的序列。
[0061]
2013：根据启动子和终止子元件分析的序列，分析得到裂殖壶菌的启动子和终止子的组合。
[0062]
通过tssp软件对基因序列的上游进行启动子初步预测，再结合具体分析得到启动子序列。通过ribex软件对基因序列的终止子进行初步预测，根据基因序列是否能形成发夹结构来得到终止子。
[0063]
s202：构建psc-18s rdna载体。
[0064]
示例性地，s202包括：
[0065]
2021：获取pylxp’载体上的复制元件和氨苄抗性基因和18s rdna上下游基因序列。
[0066]
pylxp'载体和18s rdna基因序列均来自中国农业科学院油料作物研究所应用微生物课题组实验室。
[0067]
18s rdna基因序列中间设计avrii、xhoi、nhei和sali等酶切位点和2个同向的loxp位点，这样方便后续启动子和终止子组装以及基因迭代整合。
[0068]
2022：对pylxp’载体进行双酶切。
[0069]
通过sspi酶和sali酶双酶切pylxp’，整个反应体系如表2，在37℃反应1小时。
[0070]
表2 sspi和sali双酶切pylxp’反应体系
[0071]
composition(组分)v(μl)sspi1sali1cut smart(酶切缓冲液)3ddh2o(双蒸馏水)15plasmid(载体，pylxp'载体)10
[0072]
本实施例中，当双酶切反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳切胶后回收3674bp的目的条带。
[0073]
2023：将pylxp’双酶切之后的复制子和氨苄抗性基因与18s rdna上下游基因序列进行组装，得到psc-18s rdna载体。
[0074]
具体组装体系参见表3，其中，组装体系的反应条件为50℃，反应时间为60min。
[0075]
表3 psc-18s rdna载体的组装体系
[0076][0077]
图3为psc-18s rdna载体的组装示意图，结合图3，可以看到，整个载体序列通过
①
、
②
、
③
三段序列组装完成，
①
、
②
二段序列通过基因合成得到，
③
则通过sspi和sali双酶切pylxp’载体得到的复制元件和氨苄抗性基因。重组过程中破坏
③
中的sali并引入bamhi酶切位点。
[0078]
s203：将启动子和终止子的组合组装在psc-18s rdna载体中，得到包含启动子和终止子元件的psc-18s rdna-p-t载体。
[0079]
示例性地，s203包括：
[0080]
2031：将启动子和终止子的组合中的启动子和终止子进行pcr扩增(聚合酶链式反应)。
[0081]
示例性地，将预测得到的裂殖壶菌的启动子pt(tubulin)和终止子tt(tubulin)、启动子pa1(actin)和终止子ta(actin)、启动子pa2(actin)、终止子ta(actin)、启动子pe2(elongation)、终止子te(elongation)分别进行扩增并克隆到psc-18s rdna载体。
[0082]
启动子和终止子扩增按照以下表4扩增体系进行。
[0083]
表4启动子和终止子扩增的反应体系
[0084]
pcr扩增v(μl)f-primer(正向引物)2r-primer(反向引物)2genomic dna(待扩增的启动子或者终止子)52x clonexpress mix(缓冲液)25h2o16
[0085]
本实施例中，pcr检测引物为下表5所示。
[0086]
表5 pcr检测引物
[0087][0088]
2032：将扩增后的启动子和终止子的组合克隆到psc-18s rdna载体中，得到包含启动子和终止子的psc-18s rdna-p-t载体。
[0089]
示例性地，扩增后的启动子和终止子的组合组装至psc-18s rdna载通过以下反应体系进行。
[0090]
表6启动子和终止子的组合组装至psc-18s rdna载体
[0091][0092]
图4为psc-18s rdna-p-t载体的组装示意图，结合图4，可以看到，psc-18s rdna-p-t载体是在psc-18s rdna载体的基础上，将对应的启动子和终止子组装在18s rdna载体的nhei和sali酶切位点之间。
[0093]
本实施例中，分别扩增启动子pa1(749bp)、pa2(1530bp)、pt(603bp)、pe2(1229bp)和终止子te(140bp)、ta(154bp)、tt(150bp)。
[0094]
将得到的启动子(pa1、pt)和终止子(ta和tt)分别组装至nhei和sali双酶切的psc-18s rdna载体，其检测结果如图5，结果显示序号9、10和15、16的载体大小正确，之后送测序检测序列正确。
[0095]
之后在psc-18s rdna-pa1-ta载体的基础上，分别将pa2、ta和pe2、te替换至该载体，这样便可得到psc-18s rdna-pa2-ta载体和psc-18s rdna-pe2-te载体。
[0096]
s204：抗性-荧光双筛选标记的基因序列组装至包含启动子和终止子的psc-18s rdna-p-t载体中，得到表达载体。
[0097]
抗性基因为g418抗性基因nptⅱ，荧光基因为egfp或者dsred基因。
[0098]
裂殖壶菌在2mg/ml的g418平板是完全无法生长的，因此可以将g418抗性基因nptⅱ作为表达载体的抗性基因。
[0099]
选择g418抗性基因nptⅱ分别和egfp、dsred荧光基因以融合蛋白形式表达，该融合蛋白对应的基因序列经过密码子优化后直接合成得到。
[0100]
本实施例中，分别用pt启动子、pa1启动子、pa2启动子、pe2启动子分别起始nptⅱ加egfp、dsred组成的基因转录表达。
[0101]
整个重组体系如(表7)，整个重组反应体系在50℃，反应1个小时，具体组装过程如图6。
[0102]
表7荧光基因和抗性基因组装至psc-18s rdna-p-t载体。
[0103]
[0104]
图6为表达载体的组装示意图，结合图6，可以看到g418抗性基因nptⅱ、荧光基因egfp、dsred组装在装在18s rdna载体的nhei和sali酶切位点之间。
[0105]
最后将合成的荧光基因和抗性基因的盒子连接至含有启动子和终止子的psc-18s rdna上，分别构建了psc-pa1-dsred、psc-pa1-egfp、psc-pt-dsred、psc-pt-egfp、psc-pa2-dsred、psc-pa2-egfp、psc-pe2-dsred、psc-pe2-egfp，总共8个载体，其pcr检测结果显示如图7，其中psc-pa1-dsred(12)、psc-pa1-egfp(15)、psc-pt-dsred(21)、psc-pt-egfp(37)、psc-pa2-dsred(1)、psc-pa2-egfp(23)、psc-pe2-dsred(34)、psc-pe2-egfp(46)目的条带大小正确，并进一步测序验证正确后，将含有正确表达载体的dh5α在amp抗性培养基中37℃培养过夜并提取质粒，随后将质粒通过基因枪或电转化转至裂殖壶菌中，进行启动子功能验证。
[0106]
通过构建psc-pt-dsred、psc-pa1-dsred、psc-pa2-dsred、psc-pe2-dsred和psc-pt-egfp、psc-pa1-egfp、psc-pa2-egfp、psc-pe2-egfp这8个载体，将预测的启动子和终止子通过表达融合蛋白进行启动子功能验证。除了pt启动子没有成功启动荧光基因表达外，pa1和pa2以及pe2都成功启动荧光基因表达。
[0107]
具体基因枪的转化效率如表8，裂殖壶菌通过基因枪转化的效率在60％-100％之间。
[0108]
转了psc-pe2-dsred的裂殖壶菌在红外光下可以被激发出强荧光，而转了psc-pe2-egfp的裂殖壶菌在紫外下可以被激发出绿色荧光，而野生型(wt)的裂殖壶菌是没有荧光被激发。
[0109]
表8启动子验证及转化效率统计
[0110][0111]
本实施例中，还通过实验对启动子的强弱进行验证。
[0112]
通过将预测的启动子及终止子分别启动egfp或dsred与nptⅱ组成的融合蛋白来对启动子进行验证，并跟据表达的荧光强度判断启动子的强弱。野生型(wt)裂殖壶菌在曝光时间在400msec时，在各种信号通道下无明显可见光。psc-pe2-dsred表达的裂殖壶菌的红色荧光蛋白非常强，当曝光时间在40msec就和曝光时间在400msec的psc-pa2-dsred表达的荧光相当，说明pe2启动子是强于pa2启动子的。当psc-pa2-egfp和psc-pa1-egfp分别表达绿色荧光蛋白，在曝光时间在400msec，pa2启动的绿色荧光蛋白的荧光强度强于pa1启动的绿色荧光蛋白的荧光。总共验证4对启动子，由于预测pt启动子未成功启动基因表达，启动子的强度比较为：pe2》pa2》pa1。
[0113]
另外，本实施例中通过以上方法构建裂殖壶菌mva路径(甲羟戊酸途径)的相关基因的表达载体。
[0114]
首先，将裂殖壶菌mva路径中4种主要的酶，crte、hmgr、hmgs、idi通过密码子优化后合成，得到对应的目标基因。
[0115]
然后，通过gibson assembly，将目标基因分别克隆到xbai和sphi双酶切的psc-pa2-ta载体。
[0116]
接着，通过hpai和snabi双酶切含有启动子和终止子区域的目标基因，并再次以gibson assembly方式连接至avrii单酶切的psc-pe2-egfp载体上，得到psc-pa2-hmgs-pe2-egfp、psc-pa2-hmgr-pe2-egfp、psc-pa2-crte-pe2-egfp、psc-pa2-idi-pe2-egfp。
[0117]
此外，再将这4个酶和crtiby基因通过linker连接，以同样的方式连接至psc-pa1-ta载体，将其命名为psc-pa1-yreis-pe2-egfp。整个重组体系如(表3.6)，整个重组反应体系在50℃，反应为60min，具体组装过程如图8。
[0118]
可选地，以上表达载体可以应用在裂殖壶菌的基因编辑中，比如，用于类胡萝卜素等高附加值产物的合成。
[0119]
本发明建立了一种高效的裂殖壶菌基因组编辑及转化子筛选技术，将抗性-荧光双筛选标记以融合蛋白的形式通过基因枪高效的整合至裂殖壶菌染色体，该技术可应用于测试新的裂殖壶菌基因编辑元件，以及阳性转化子的快速筛选。
[0120]
利用该系统表达裂殖壶菌内源基因时，优势非常突出，原因如下：利用抗性-荧光双筛选标记，阳性转化子既能在抗性平板上生长，又能观察到荧光。由于设计载体时，内源基因和双筛选标记基因在一个表达载体，且先起始内源基因的表达，再启动抗性-荧光双基因的表达。理论上，排在后面的抗性-荧光基因如果能表达，前面的内源基因也已表达。因此，当进行内源基因的过表达时，只需要挑去抗性平板上能生长且有荧光的转化子，不需要进行额外的转化子验证工作，显著节省时间和成本。
[0121]
一般情况下，将内源或外源基因转化至宿主体内，即使挑选到在抗性平板上筛选可以生长的转化子，也存在一定比例的假阳性菌株，所以需要对挑选的转化子进一步检测。在表达内源基因的时候，因为宿主已经包含该基因，只能扩增载体上抗性标记或者扩增基因整合位置来判断目的基因是否整合至基因组，从而鉴别假阳性转化子。此外，阳性转化子中还可能存在基因序列整合至基因组，但是基因不一定表达的情形。如果表达的是外源基因，可以通过qrt-pcr或者western blot判断外源基因是否转录或表达；如果表达内源基因，由于宿主已经包含该基因，通过上述方法只能基于宿主中该基因转录或蛋白水平量的变化来判断该基因是否成功表达。但是有一些基因本身表达就比较弱，再加上转内源基因时候还会带抗性基因会给宿主菌增加负担，且在菌株培养和实验操作等过程中存在多种不可控因素，这种转录或表达量的变化有可能不显著，还是不能判断基因是否成功表达，一套流程下来费时费力。相较而言，本发明的方法显著节省阳性转化子筛选的时间和人力成本。
[0122]
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。