GT1/HB13基因在调控玉米雌穗下位花不退化及抗倒伏中的应用

gt1/hb13基因在调控玉米雌穗下位花不退化及抗倒伏中的应用
技术领域
1.本发明涉及玉米遗传育种技术领域，更具体地，涉及gt1和hb13基因在调控玉米雌穗下位花不退化及抗倒伏中的应用。


背景技术：

2.玉米(拉丁学名：zea mays l.)是世界范围经济价值最高的农作物，是重要的粮食、饲料和生物能源兼用资源，对保障我国的粮食安全与经济发展尤为重要。而花序是植物的生殖器官，是花及果实的载体，其结构及形态建成直接影响植物的花朵数目、果实数量、大小、繁育系统，进而影响作物的产量。早期的研究认为玉米性别分化涉及多种内源激素、性别分化等相关基因、外部环境因素，以及它们之间的相互作用等的精细调控。然而，玉米雌穗和雄穗的性别分化的决定基因及相关激素如何影响玉米雌雄穗形成的分子机理尚不完全清楚。因此，深入解析玉米性别分化的分子机理，特别是揭示玉米花序建成的调控网络将为玉米的现代分子遗传育种提供新靶点，为禾本科花序结构的进化提供新视角。
3.hd-zip家族蛋白是植物中特有的一大类转录因子，含有60(或61)个保守氨基酸同源异型结构域(homeodomain，hd)，是同源异型盒(homeobox)蛋白，60(或61)个保守的氨基酸折叠为三螺旋结构与dna特异性结合。hd-zip家族包含4个亚家族(hd-zip i～iv)，其中hd-zip i亚家族成员参与光信号转导、器官发育，能整合脱落酸和乙烯等激素信号以响应干旱、低温以及渗透压等非生物胁迫。例如，拟南芥中的athb6、athb7、athb12通过气孔关闭、增加水分吸收和一系列应激相关基因的调控等途径来抵抗干旱和冷害胁迫条件导致的不良反应。水稻hd-zip i亚族基因oshox22也被证明影响脱落酸的合成，并依赖于脱落酸信号传导通路从而调节植物对干旱和盐胁迫的应答反应。
4.中国专利cn111909936a公开了玉米中的hd-zip i亚族基因grassy tillers1(gt1)突变后，植株雄穗小花中的心皮不退化而长出花丝，但花丝数量不多，表明雌穗小花心皮发育异常，而关于gt1和它的同源基因hb13同时发生突变对于玉米性状的影响，现有技术中还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供gt1/hb13基因在调控玉米花序雌穗下位花不退化及抗倒伏中的应用。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
7.本发明利用crispr/cas9转基因技术对玉米中的gt1和hb13基因的两个靶点进行了基因编辑，再pcr扩增gt1/hb13转基因玉米植株的gt1/hb13基因，pcr产物测序后与野生型的序列进行比对。显示gt1基因的靶位点有碱基的插入及大片段缺失，具体为seq id no:7所示，gt1基因第145bp处有1bp碱基的插入，第177bp～408bp碱基大片段缺失，导致移码突变，而hb13基因有碱基的删除，具体为seq id no:8所示hb13基因第307～336bp有碱基的删
除，第728bp有1碱基的插入。突变体植株结果显示，gt1和hb13双突变体植株的的分蘖数增多，且根系发达，抓地稳，能提升玉米的抗倒伏能力，果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗，表现出多穗性，下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗，且观察到gt1和hb13双突变体的雌穗小花心皮发育异常，有的下位花心皮未发生败育而长出正常的花丝，后期继续发育形成额外的小籽粒。同时与野生型和gt1和hb13基因两个单突材料相比，gt1和hb13双突变体植株的表型更为剧烈，雄穗花丝数量明显增多，分蘖数明显增多，根系更加发达。表明敲除gt1和hb13基因后，可使玉米突变体植株表现出雌穗下位花不退化表型及更强的抗倒伏性。
8.因此，本发明首先保护gt1/hb13基因在调控玉米雌穗下位花不退化和/或抗倒伏中的应用。
9.本发明还提供gt1/hb13基因在调控玉米分蘖数、雄穗雌化和/或雌穗多穗性中的应用。
10.具体地，所述gt1(zm00001d028129)基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，hb13(zm00001d021934)基因的核苷酸序列如seq id no:2所示
11.具体地，为gt1和hb13基因的双突变在调控玉米雌穗下位花不退化、抗倒伏、玉米分蘖数、雄穗雌化和/或雌穗多穗性中的应用。
12.具体地，为gt1/hb13基因为gt1和hb13基因的双敲除突变在调控玉米雌穗下位花不退化、抗倒伏、玉米分蘖数、雄穗雌化和/或雌穗多穗性中的应用。
13.具体地，为seq id no:7所述的gt1基因突变型和seq id no:8所述的hb13基因突变在在调控玉米雌穗下位花不退化、抗倒伏、玉米分蘖数、雄穗雌化和/或雌穗多穗性中的应用。
14.本发明还提供gt1/hb13基因在培育雌穗下位花不退化、抗倒伏、分蘖数增多、雄穗雌化和/或雌穗多穗性的玉米品种中的应用。
15.具体地，为敲除玉米中的gt1和hb13基因，得到gt1/hb13双突变转基因玉米植株。
16.优选地，所述敲除突变为利用crispr/cas9基因编辑技术进行，具体为构建gt1和hb13基因的crispr/cas9双敲除载体并转化玉米，得到gt1/hb13双突变转基因玉米植株。
17.进一步优选地，所述crispr/cas9基因编辑载体中gt1基因的sgrna序列如seq id no:3～4所示，hb13基因的sgrna序列如seq id no:5～6所示；具体为，将含有seq id no:3～6所示sgrna的crispr/cas9基因编辑载体通过农杆菌介导法转化玉米，得到gt1/hb13转基因玉米植株。
18.具体地，为删除玉米中seq id no:1所示gt1基因第145bp处有1bp碱基的插入，第177bp～408bp碱基大片段缺失及seq id no:2所示hb13基因第307～336bp有碱基的删除，第728bp有1碱基的插入，从而获得如seq id no:7和seq id no:8所述的gt1和hb13基因双突变玉米植株。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明提供了gt1/hb13基因在调控玉米雌穗下位花不退化、抗倒伏、玉米分蘖数、雄穗雌化和/或雌穗多穗性中的应用。本发明利用crispr/cas9转基因技术对玉米中的gt1和hb13这两个靶点进行了基因编辑，使gt1基因的靶位点有碱基的插入及大片段缺失，而hb13基因有碱基的删除，得到gt1和hb13双突变体植株；结果显示，gt1和hb13双突变体植株
的的分蘖数增多，且根系发达，抓地稳，能提升玉米的抗倒伏能力，果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗，表现出多穗性，下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗，且观察到gt1和hb13双突变体的雌穗小花心皮发育异常，有的下位花心皮未发生败育而长出正常的花丝，后期继续发育形成额外的小籽粒。同时与野生型和gt1和hb13基因两个单突材料相比，gt1和hb13双突变体植株的表型更为剧烈，雄穗花丝数量明显增多，分蘖数明显增多，根系更加发达。表明敲除gt1和hb13基因后，可使玉米突变体植株表现出雌穗下位花不退化表型及更强的抗倒伏性，可使玉米突变体植株表现出心皮发育异常表型，培育转基因玉米植株；同时对揭示玉米花序建成的调控网络提供了理论依据。
附图说明
21.图1为gt1/hb13转基因植株的基因型鉴定，pcr产物测序后与野生型的序列进行比对。
22.图2为gt1/hb13调控玉米植株分蘖数、雄穗雌化、雌穗多穗性、雌穗下位花不退化等表型。
具体实施方式
23.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
24.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
25.实施例1玉米gt1和hb13基因的crispr/cas9转基因植株的构建
26.1、方法
27.gt1(seq id no:1)和hb13基因(seq id no:2)的crispr/cas9敲除载体的构建过程为：首先，利用snapgene viewer软件及同源序列比对设计和筛选gt1/hb13基因特异的靶标序列(sgrna)，为了保证基因编辑效率，每个基因选取两个最优的靶标序列：
28.gt1：gacgccccgcaaggtgcagctgg(seq id no:3)，
29.gctgaagatgaaggacaggctgg(seq id no:4)；
30.hb13：agcaggtcgccgtctggttc(seq id no:5)，
31.tctgcagcgggagcccgagc(seq id no:6)；
32.之后将这些靶标序列引入到sgrna表达盒中。同时，将人类中的hspcas9序列用商业化的pcr cloning kit试剂盒克隆到pcpb载体中，构建成为pcpb-zmubi:hspcas9载体。接着，将两个sgrna表达盒通过hdcloning kit试剂盒插入到pcpb-zmubi:hspcas9的hindiii酶切位点间。最终构建成的crispr/cas9基因编辑载体经过pcr测序验证无误后用于后续的遗传转化。
33.所构建的crispr/cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系kn5585，得到gt1/hb13转基因玉米植株。
34.2、结果
35.(1)基因型鉴定
36.pcr扩增gt1/hb13转基因玉米植株的gt1/hb13基因，pcr产物测序后与野生型的序
列进行比对。结果如图1所示，显示gt1基因的靶位点有碱基的插入及大片段缺失，具体为seq id no:1所示的gt1基因第145bp处有1bp碱基的插入，第177bp～408bp碱基大片段缺失，导致移码突变；而hb13基因有碱基的删除，具体为seq id no:2所示的hb13基因第307～336bp有碱基的删除，第728bp有1碱基的插入；得到突变的gt1基因序列如seq id no:7所示，突变的hb13基因序列如seq id no:8所示。
37.(2)转基因植株表型观察
38.结果如图2所示，相较于野生型，gt1和hb13双突变体植株的分蘖数增多，且根系发达，抓地稳，能提升玉米的抗倒伏能力，果穗数增加，主穗的穗柄上长出新的雌穗，表现出多穗性，下部的腋生分生组织也脱抑制发育成雌穗，且在雌穗中下位花不退化，下位花的心皮继续发育，形成花丝，有的下位花还会形成两根花丝，表现为多花丝现象，后期继续发育形成额外的小籽粒。同时与野生型和gt1和hb13基因两个单突材料相比，gt1和hb13双突变体植株的表型更为剧烈，雄穗花丝数量明显增多，分蘖数明显增多，根系更加发达。