一种胰岛细胞诱导剂、培养基和获得胰岛β细胞的方法及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种胰岛细胞诱导剂、培养基和获得胰岛β细胞的方法及其应用。

背景技术：

1、糖尿病(diabetes mellitus，dm)是一类以高血糖为特征的慢性代谢病，其所导致的持续高水平血糖，会对病人的心脏、肾脏和神经器官组织产生普遍性损伤，进而引起多种并发症。目前，糖尿病已成为世界性重要公共卫生问题，对经济发展产生严重的影响。

2、胰岛移植是一种治疗糖尿病的有效方法，但其受到了胰腺供体严重缺乏的限制，如何获得有功能的胰岛细胞是目前利用细胞替代疗法治疗糖尿病所面临的难题之一。其中胰腺类器官培养体系的成功构建，可作为解决器官移植供者来源稀少的问题。类器官(organoid)是指利用干/祖细胞的多能性，将其在体外进行培养，使其不断进行自我更新和自我组织，形成在结构和功能上与原始器官相似的组织。hans clever等基于成体干细胞以及类器官技术，成功建立了胰腺导管类器官，并能使其向胰腺内分泌分化为胰岛素阳性的细胞，但目前其分化效率受限，因此如何增加胰腺β细胞分化效率是一个急需解决的重要问题。

3、中药黄芪为我国传统常用中药，其药用历史迄今已有2000多年，是豆科植物蒙古黄芪 astragalus membranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao或膜荚黄芪astragalus membranaceus(fisch.)bge.的干燥根。现代药理学研究证实，黄芪药材中主要含有皂苷、黄酮和多糖等化学成分，此外还有多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素，有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和广泛的抗菌作用。研究证明，黄芪中所含的黄芪皂苷具有改善胰岛素抵抗、调节脂代谢和糖原代谢、缓解糖尿病并发肾病等作用，近年来成为治疗糖尿病的重要方向。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供利用黄芪皂苷小分子和上皮细胞体外获得胰岛细胞的方法。本发明的又一个目的是提供具有生理功能的大量胰岛细胞，特别是β细胞的方法，用于制备人工胰岛以及体内应用治疗糖尿病。

2、本发明提供了一种胰岛细胞的诱导剂，所述诱导剂的有效成分是黄芪皂苷。

3、进一步地限定，所述胰岛细胞为胰岛α细胞、胰岛β细胞、胰岛δ细胞或胰岛pp细胞。

4、进一步地限定，所述诱导剂的有效成为黄芪皂苷(astragaloside)ⅰ～ⅷ、异黄芪皂苷 (isoastragaloside)ⅰ、ⅱ和ⅳ、乙酰黄芪皂苷(acetylastragaloside)、环黄芪苷(cyclosieversioside)e、f和g、agroastragalosideⅰ～ⅳ和大豆皂苷ⅰ中的任意一种或多种以及它们的衍生物的任意一种或多种。

5、进一步地限定，诱导剂的有效成分为异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ。

6、本发明提供一种生产胰岛细胞的培养基，所述培养基含有黄芪皂苷。

7、进一步地限定，所述培养基还含有类器官增殖培养基。

8、进一步地限定，所述胰岛细胞为胰岛α细胞、胰岛β细胞、胰岛δ细胞或胰岛pp细胞。

9、进一步地限定，，所述培养基含有异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ。

10、进一步地限定，所述黄芪皂苷的浓度为0.1-8μm。

11、本发明提供一种获得胰岛β细胞的方法，将上皮细胞培养在含有黄芪皂苷的培养基中进行分化获得胰岛β细胞。

12、进一步地限定，所述上皮细胞为人或哺乳动物的肝、胆、胰、胃和肠道上皮细胞。

13、进一步地限定，所述黄芪皂苷的体系的有效成分为黄芪皂苷(astragaloside)ⅰ～ⅷ、异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ、ⅱ和ⅳ、乙酰黄芪皂苷(acetylastragaloside)、环黄芪苷 (cyclosieversioside)e、f和g、agroastragalosideⅰ～ⅳ和大豆皂苷ⅰ中的任意一种或多种以及它们的衍生物的任意一种或多种。

14、进一步地限定，所述黄芪皂苷的体系的有效成分为异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ。

15、进一步地限定，所述黄芪皂苷的浓度为0.1-8μm。

16、本发明提供上述的获得胰岛β细胞的方法获得的胰岛β细胞。

17、本发明提供上述胰岛β细胞在制备治疗糖尿病的细胞药物中的应用。

18、进一步地限定，所述细胞药物的剂型包括注射剂。

19、进一步地限定，所述细胞药物含有与细胞相容性的细胞外基质和药学载体。

20、进一步地限定，所述药学载体为纳米材料或微流体。进一步地限定，所述培养基还含有类器官增殖培养基或基础培养基。

21、所述基础培养基为advanced dmem/f12，细胞培养基础添加成分包括谷氨酰胺和抗生素，其中在advanced dmem/f12中1×谷氨酰胺的使用浓度为2mm，抗生素为青-链霉素，使用浓度为100u/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素。

22、其中所述类器官增殖培养基为在基础培养基基础上包含选自wnt激动剂、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，tgf-β)抑制剂、表皮生长因子egf，及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)的至少1种。

23、wnt激动剂可选一种或多种由以下自由组成的分子：wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、 wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、r-spondin1。

24、bmp信号传导途径抑制剂包括noggin、dorsomorphin、ldn189、dmh-1和其组合，优选noggin。

25、fgf包括：fgf1、fgf2、fgf3、fgf4、fgf10、fgf11、fgf12、fgf13、fgf14、 fgf15、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf20、fgf21、fgf22、fgf23和其组合，优选fgf10。

26、进一步地限定，所述培养基含有胞外基质。

27、所述细胞外基质(extracellular matrix，ecm)包含各种各样的多糖、水、弹性蛋白、及糖蛋白，所述作为糖蛋白如胶原、巢蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。

28、进一步地限定，所述胰岛细胞为胰岛α细胞、胰岛β细胞、胰岛δ细胞或胰岛pp细胞。

29、本发明提供了一种体外获得胰岛β细胞的方法，将上皮细胞在含有黄芪皂苷的体系中进行分化获得胰岛β细胞。

30、进一步地限定，所述上皮细胞为人或哺乳动物的肝、胆、胰、胃、和肠道上皮细胞。

31、上皮细胞起始细胞接种在细胞外基质中，用em培养基在37℃，5％co2培养箱条件下培养5天后形成类器官，同时其可以连续传代培养和冻存。

32、进一步地限定，所述黄芪皂苷为黄芪皂苷(astragaloside)ⅰ～ⅰ、异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ、ⅱ和ⅳ、乙酰黄芪皂苷(acetylastragaloside)、环黄芪苷(cyclosieversioside)e、f和g、agroastragalosideⅰ～ⅳ和大豆皂苷ⅰ中的任意一种或多种以及它们的衍生物的任意一种或多种。

33、进一步地限定，所述黄芪皂苷的浓度为0.1-8μm。

34、本发明提供了上述方法获得的胰岛β细胞用于在体外制备治疗糖尿病的细胞药物中的应用。

35、本发明提供上述制备胰岛β细胞的方法在制备用于动物体内诱导胰岛β细胞的药剂中的应用。

36、进一步地限定，所述药物的剂型包括注射剂。

37、进一步地限定，所述注射剂包括氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠和注射液用水。

38、进一步地限定，所述细胞药物还含有与细胞相容性的药学载体。

39、进一步地限定，所述药物还含有医学上可接受的辅料，所述医学上可接受的辅料包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、抗氧剂、矫味剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。细胞和生理学上可接受的赋形剂或稀释剂，包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

40、进一步地限定，所述药物还含有药用载体，药用载体包括细胞外基质、纳米材料和微流体，所述细胞外基质为各种各样的多糖、水、弹性蛋白、及糖蛋白，所述作为糖蛋白如胶原、巢蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。所述纳米材料如介孔硅、脂质体、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、白蛋白、外泌体。

41、本发明提供了一种诱导上皮细胞的诱导剂，所述诱导剂含有黄芪皂苷。

42、本发明提供了一种诱导上皮细胞分化的方法，将上皮细胞在含有黄芪皂苷的体系中进行分化。

43、进一步地限定，所述上皮细胞为人或哺乳动物的肝、胆、胰、胃、和肠道上皮细胞。

44、进一步地限定，所述黄芪皂苷为黄芪皂苷(astragaloside)ⅰ～ⅰ、异黄芪皂苷(isoastragaloside)ⅰ、ⅱ和ⅳ、乙酰黄芪皂苷(acetylastragaloside)、环黄芪苷(cyclosieversioside)e、f和g、agroastragalosideⅰ～ⅳ和大豆皂苷ⅰ中的任意一种或多种以及它们衍生物的任意一种或多种。

45、进一步地限定，所述黄芪皂苷的浓度为0.1-8μm。

46、包括黄芪皂苷的化学小分子组合物，所述化学小分子组合物是药物组合物，还包括：药学上可接受的载体或赋形剂；较佳地，所述载体或赋形剂包括选自下组的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；dmso、甘油和乙醇或其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；胶体型载药系统或高分子载药系统；防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、ph缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂；或所述的化学小分子组合物可制备的药物剂型包括：固体剂型，包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂，或其他固体剂型；液体剂型，包括注射剂、输液剂、混悬剂，或其它液体剂型；气体剂型；或半固体剂型。

47、包括黄芪皂苷的用途，用于制备胰岛细胞的制剂、试剂或培养基；或用于制备体内诱导原位上皮细胞分化为胰岛细胞，以及原位分化胰腺导管细胞促进胰岛β细胞再生，降低血糖，达到治疗糖尿病相关疾病(如糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病引起的皮肤愈合差、糖尿病心血管疾病等)的药物/药物前体/药物组合物；或用于制备体外诱导上皮细胞分化的胰岛细胞。

48、包括黄芪皂苷的化学小分子的用途，可以用于制备诱导体内外胰岛细胞的药盒或试剂盒，或基于该小分子添加药学上可接受的载体或赋形剂，用于体内诱导原位或胃肠道细胞直接转化为胰岛细胞，以其原位分化效应而减少或降低组织/器官病变，而研发或制备成治疗临床糖尿病(如糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病引起的皮肤愈合差、糖尿病心血管疾病等)的药物或前体药物/药物组合物；或添加有机溶剂/生理盐水/缓冲液/细胞基础培养基等载体或赋形剂制备的诱导上皮细胞直接分化为胰岛细胞的分化培养基或试剂盒。

49、包括黄芪皂苷的药盒或试剂盒，所述的上皮细胞包括但不限于：人或哺乳动物胃肠道上皮细胞；包括但不限于人的：肝外和肝内胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、胃上皮细胞、小肠和大肠上皮细胞或人体其他组织或器官的上皮细胞；更佳地为人胰管和胆管上皮细胞。

50、有益效果：本发明公开用于诱导肝内胆管上皮、肝外胆管上皮、胰腺导管上皮、胃上皮、肠上皮细胞产生胰岛细胞的黄芪皂苷和方法。通过构建上皮类器官(epithelialorganoids， epos)，经黄芪皂苷类物质处理后，可以发现黄芪提取物中异黄芪皂苷i能够显著促进epos 的分化，其明显促进胰岛细胞相关基因的表达，这种促分化过程中观察到胰腺内分泌祖细胞标志性基因ngn3的上调表达。分化后的细胞能响应葡萄糖刺激，改善糖尿病鼠血糖及葡萄糖耐量，具有成熟β细胞的生理功能。

51、异黄芪皂苷i不仅能够显著促进小鼠胰腺导管类器官(mouse pancreatic ductalorganoid， mpdos)胰岛素相关基因insulin 1和insulin 2的表达，并且β细胞分化比例可以达到45％，相较此前文献报道的1.5％的分化效率(loomans cjm,et al.,stem cellreports 2018；10:712-724)，提高了30倍。分化后的mpdos在葡萄糖刺激下可检测到合成胰岛素标志物c肽的分泌，证明其具有与成熟β细胞相同的葡萄糖刺激的生理响应。加入低于8μmol/l 浓度的异黄芪皂苷i对类器官生长和细胞活性没有任何影响，证明其是一种安全、有效，具有很好应用潜能的活性黄芪分子。同时，通过体内移植经异黄芪皂苷i预处理的人胆管类器官(human extrahepatic bile duct organoid，hbdos)实验，结果证明其具有缓解糖尿病鼠高血糖症状、改葡萄糖耐量等体内活性作用。异黄芪皂苷i单独添加到类器官培养基中就有促进β细胞分化的显著效果，暗示其在体内或有促进胰腺再生等更为综合的作用。