一种抗人源CD146的特异性单克隆抗体的制作方法

一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体
技术领域
1.本发明属于抗体研究技术领域，具体涉及一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体。


背景技术：

2.噬菌体抗体库技术（phage antibody library）是近年发展的一项分子生物学新技术，近年来越来越多的学者利用这项技术获得目标抗体以应用于医疗制药及安全检测等多个领域。噬菌体抗体库技术的发展和应用，为抗体技术领域带来了巨大的变化，极大地推动了各种性能优良基因工程抗体的开发和应用。获得大容量的抗体库是筛选获得特异性抗体的前提条件。
3.因单克隆抗体在癌症、感染性疾病和许多其它的人类疾病中具有诊断和治疗价值，最终选择可广泛应用于临床的单克隆抗体，基于cd146在早期肺癌中的诊断价值，筛选制备特异性cd146单克隆抗体，该抗体能够在分子, 肺癌细胞水平特异性识别人源cd146，为恶性肺结节的早期诊断及治疗提供研究基础。


技术实现要素：

4.本发明通过构建人源cd146特异的fab噬菌体展示文库，筛选出了一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体，该抗体能够在分子，肺癌细胞水平特异性识别人源cd146。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体，所述抗体的氨基酸序列为：轻链可变区氨基酸序列为seq id no：1；重链可变区氨基酸序列为seq id no：2。
6.进一步，所述抗体能够在分子, 肺癌细胞水平特异性识别人源cd146。
7.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过构建人源cd146特异的fab噬菌体展示文库，筛选出了一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体，亲和力高，能够在分子，肺癌细胞水平特异性识别人源cd146。
附图说明
8.图1为单克隆抗体mm01-mm05的亲和力；图2为a549和h460细胞cd146的表达；图3为单克隆抗体mm01与h460和a549细胞表面cd146抗原的亲和力。
具体实施方式
9.下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案及效果做进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
10.实施例1一种抗人源cd146的特异性单克隆抗体，所述抗体的氨基酸序列为：
抗体轻链可变区氨基酸序列为seq id no：1，diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppwtfgqgtkveik；抗体重链可变区氨基酸序列为seq id no：2，evqlvesggglvqpggslrlsceasgftvgnsymswvrqapgkglewvslmysggstnyaasvkgrftisrdnskntlnlqmtslraedtavyycvrvvygsgiawgqgtlvtvss。
11.抗体fab轻链氨基酸序列为seq id no：3，diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhklyacevthqglsspvtksfnrgec；抗体fab重链氨基酸序列为seq id no：4，evqlvesggglvqpggslrlsceasgftvgnsymswvrqapgkglewvslmysggstnyaasvkgrftisrdnskntlnlqmtslraedtavyycvrvvygsgiawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkt。
12.本发明抗人源cd146的特异性单克隆抗体的获取方法包括以下步骤：1）采用噬菌体库筛选cd146 fab抗体单克隆抗体在癌症、感染性疾病和许多其它的人类疾病中具有诊断和治疗价值。我们基于噬菌体展示技术，从天然噬菌体库中筛选展示在噬菌体表面，高亲和力的特异性cd146 fab抗体片段。cd146抗原购自百普赛斯生物科技股份有限公司，大肠杆菌tg1，购自英韦创津（invitrogen)公司。
13.方法为：取1ml噬菌体库，孵以不同浓度的cd146抗原进行4轮淘选，第一轮筛选抗原浓度为10ug/ml,第二轮筛选抗原浓度为1ug/ml，第三轮筛选抗原浓度为1ug/ml，第四轮筛选抗原浓度为1ug/ml。从上述淘选结果中随机挑选克隆进行elisa实验，根据od405读数排序，以三个最低读数的平均值作为对照，判定od405＞3倍对照的克隆为阳性克隆，依据od405数值高低排序，送适量样品测序，分析序列多样性，记录独特抗体序列。
14.2）哺乳动物细胞表达系统制备载体片段的制备，哺乳动物细胞表达选用flp-in tm(invitrogen, tm)系统。表达结构包括启动子（cmv）、带有pdgfr跨膜序列（tm）的人抗体全长基因，其可在哺乳动物细胞基因组的特定位点引入flp重组靶点 (frt)，通过flp重组酶介导基因重组，将含有目的基因的表达载体整合进入基因组的单一frt位点。载体中的选择性潮霉素基因不包括起始密码子和启动子，而宿主细胞基因组的frt位点含有atg密码子及上游的启动子。只有当载体在frt位点精确整合使潮霉素基因与atg密码子及上游的启动子形成正确的阅读框架，潮霉素基因才能够表达。在pcdna5/frt载体中，平行插入两个基因表达框，能同时表达重链和轻链，生成flp载体。使用sfii和esp3i对载体进行酶切，并经1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用，可分别得到3kb和5kb目的片段。
15.单克隆抗体轻链、重链片段的制备，以cdna第一条链为模板，设计引物，分别用pcr扩增抗体轻链和重链可变区基因。pcr条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环的pcr扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，随后在延长温度下反应7min，以确保全长
目的片段的合成。用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。将回收得到的0.65kb轻链和0.35kb重链片段与3kb和5kb载体片段按照1:1:1:1的比例混合后连接、转化大肠杆菌，得到质粒dna备用。
16.3）哺乳动物细胞表面展示单克隆抗体将抗体的重链和轻链的编码序列插入载体，生成的载体瞬时转染fcho细胞进行抗体表达。转染48小时后，用荧光标记的特异性抗原和针对人的轻链抗体对细胞染色，用流式细胞仪分析抗体在细胞表面的表达和与cd146抗原的结合情况。
17.方法为：用cell dissociation buffer(invitrogen)消化转染后的细胞，然后取分散的细胞与荧光标记的特异性抗体进行反应。在50ul反应体系中含有5x105细胞和2ul pe标记的鼠抗人kappa链的特异性抗体，混匀后于冰上孵育30min，用染色缓冲液洗涤细胞1次，然后将细胞重悬于400ul的染色缓冲液，用流式细胞仪分析抗体基因在细胞表面的表达情况。用fcs express v3对表达抗体进行量化分析。本实验以pe-kappa来检测全长抗体的表达，因为在表达质粒中抗体的重链基因末端融合了跨膜序列，轻链只有当其与相应的重链配对组合才能在细胞表面被检测到，所以仅检测轻链信号就可代表全长抗体的表达。在数据分析时，pe-kappa阳性率低于1％则判定为全长抗体表达阴性。以fitc-标记抗原来检测抗体与抗原的亲和力。
18.4）单克隆抗体亲和力分析为了测试单克隆抗体的亲和力，收集哺乳动物细胞培养上清液，采用ammag
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protein a magnetic beads（genscript）纯化回收抗体。设计elisa实验分析抗体亲和力：相同抗原浓度包被96孔酶标板（抗原浓度为2ug/ml），梯度浓度稀释抗体，以10ug/ml作为孵育抗体起始浓度，10倍梯度稀释，共稀释4个浓度梯度至抗原浓度为0.01ug/ml。酶标板在450nm/630nm处检测吸光度，使用graphpad prism 7.0对数据进行分析。
19.因elisa实验包被抗原为cd146重组蛋白，不能确保抗原空间结构的完整性，为了进一步验证我们制备的单克隆抗体与细胞表面具有天然结构的cd146抗原的结合力，选取亲和力最高的单克隆抗体mm01作为实验组抗体，购买cd146单克隆抗体作为阳性对照抗体，抗人igg作为阴性对照抗体；选取cd146抗原低表达的a549细胞系作为阴性对照细胞，cd146抗原高表达的h460细胞系作为阳性对照细胞。通过流式细胞仪分析单克隆抗体mm01与细胞表面cd146抗原的结合力。
20.5）筛选获得cd146单克隆抗体基于噬菌体展示技术，通过孵以不同浓度的cd146抗原进行4轮淘选，获得cd146单克隆抗体。第一轮筛选抗原浓度为10ug/ml,扩增后滴定库容为1.2
×
10
12
/ml；第二轮筛选抗原浓度为1ug/ml，滴定库容为8
×
105/ml；第三轮筛选抗原浓度为1ug/ml，滴定库容为8
×
104/ml；第四轮筛选抗原浓度为1ug/ml，滴定库容为2
×
103/ml。
21.从上述淘选结果中随机挑选克隆进行elisa实验，根据od405读数排序，以三个最低读数的平均值作为对照，判定od405＞3倍对照的克隆为阳性克隆，依据od405高低排序，送适量样品测序，分析序列多样性，共得到独特抗体序列14个。
22.6）哺乳动物细胞表面展示全长抗体将筛选获得的独特抗体序列，通过扩增、纯化、esp3i或sfii酶切、再纯化回收，与可将全长抗体展示在细胞表面的载体连接后转入fcho细胞，结合流式细胞分选技术（facs）
进行筛选分析，通过fitc和pe双染细胞，筛选表达量和亲和力较高的单克隆抗体。fitc的荧光强度代表抗-igg fc段抗体，提示抗体与抗原的结合力，与pe的荧光强度代表抗-kappa链标记抗体数量，提示抗体表达量。
23.流式分析结果提示，抗体的重链和轻链均可表达在哺乳动物细胞表面，因为只有重链的羟基末端带有pdgfr跨膜序列，在细胞表面检测到抗轻链抗体结合的荧光信号不仅表明轻链的表达，同时表明轻链与互补的重链在细胞表面的组合。用抗kappa链抗体和特异性抗原对经过稳定筛选的有抗体展示的细胞群进行双染即可提示抗体的表达量和亲和力。根据抗体在细胞表面的表达及亲和力，最终选取5个独特序列作为候选抗体，编号为mm01-mm05。
24.mm01轻链可变区氨基酸序列为seq id no：1，diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppwtfgqgtkveik；重链可变区氨基酸序列为seq id no：2，evqlvesggglvqpggslrlsceasgftvgnsymswvrqapgkglewvslmysggstnyaasvkgrftisrdnskntlnlqmtslraedtavyycvrvvygsgiawgqgtlvtvss。
25.mm02轻链可变区氨基酸序列为seq id no：5，diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppwtfgqgtkveik；重链可变区氨基酸序列为seq id no：6，evqlvesgggvvqpgrslrlacatsgftfnkygihwvrqapgkglewvalissdgdnkyyadsvrgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycakdrmgvgyifdfwgrgtlvtvss。
26.mm03轻链可变区氨基酸序列为seq id no：7，syeltqplsvsaapgqmvtmscsgsssnignnyvfwhqqlpgtapklliydnnkrpsgipdrfsgsksgtsatlaitglqtgdeadyycgtwdsslsggvfgggtkltvl；重链可变区氨基酸序列为seq id no：8，qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsissssyywgwirqppgkglewigsiyysgstyynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycarlirgafdiwgqgtlvtvss。
27.mm04轻链可变区氨基酸序列为seq id no：9，diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppwtfgqgtkveik；重链可变区氨基酸序列为seq id no：10，evqlvesgggvvqpgrslrlacatsgftfnkygihwvrqapgkglewvalissdgdnkyyadsvrgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycakdrmgvgyifdfwgrgtlvtvss。
28.mm05轻链可变区氨基酸序列为seq id no：11，
diqmtqspssvsasvgdrvtitcratqdirpwlawyqqkpgkapqlliyrtstlhsgvpsrfsgsgsgtdftltisrlqpedfatyycqhaklfpitfgqgtrleik；重链可变区氨基酸序列为seq id no：12，qvqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfstyamhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyvdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardwliagdmdvwgqgtlvtvss。
29.7）单克隆抗体亲和力及基于肿瘤细胞表面结合分析elisa结果表明单克隆抗体与cd146抗原的结合呈剂量依赖性。在包被抗原浓度相同的情况下（2ug/ml），所需孵育的抗体浓度越高，提示抗体与抗原的亲和力越低。根据剂量依赖性结合实验原理，计算单克隆抗体抗体ec50：mm01的ec50为0.2143ug/ml，mm02 的ec50为1.708ug/ml，mm03的ec50为2.545ug/ml，mm04的ec50为5.162ug/ml，mm05的ec50为2.269ug/ml。结果表明，单克隆抗体mm01亲和力最高 (图1)。
30.为了进一步验证单克隆抗体mm01与细胞表面cd146抗原的结合情况。选取cd146抗原低表达的a549细胞系作为阴性对照细胞，cd146抗原高表达的h460细胞系作为阳性对照细胞（图2）；以购买的cd146单克隆抗体作为阳性对照抗体（control antibody），抗人igg抗体作为同型对照抗体，结合流式细胞分选技术（facs）进行，fitc和pe荧光染料双染细胞，验证单克隆抗体mm01的亲和力，如图3所示。通过facs 分析单克隆抗体 mm01 与 h460 细胞（高表达cd146）和a549 细胞（低表达cd146）表面 cd146 抗原的亲和力。结果示：mm01可与h460细胞表面cd146抗原结合。
31.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。