1.本研究涉及基因检测领域，具体涉及基于共轭聚合物的个性化高血压用药相关的基因检测方法与应用。
背景技术：2.在临床治疗中，药物反应的个体差异极为普遍，产生这种差异的原因包括性别、年龄、遗传、疾病状况等多种因素，都可导致不同个体对同一药物的反应出现量和质的差别。遗传药理学和临床药理学的研究均表明，在所有因素中，绝大多数情况下最主要的因素是遗传因素，及药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因多态性导致了其编码蛋白的功能改变，导致其对药物的转化、运输及反应能力发生改变，进一步使靶点的药物浓度和药物敏感性发生改变，从而导致了对药物反应的个体差异。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。
4.以高血压疾病为例，目前临床常用的抗高血压药物有钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素ii受体拮抗剂和利尿降压药及其它。随着人类基因组计划的实施和完成，许多遗传性疾病的相关基因被相继定位。经过国内外的长期研究，目前已发现许多个基因的突变位点尤其是单碱基错配与抗高血压药物的反应性密切相关，其中主要有下列位点：
5.表1：与抗高血压药物反应性相关的等位基因
6.药物类别相关等位基因钙拮抗剂cyp3a5*3、cyp3a4*17、cacna1c血管紧张素转换酶抑制剂ace(i\d)、agt(m235t)、ace2β-受体阻滞剂edn1(g5665t)、adrb1(c1165g)、cyp2d6*10血管紧张素ii受体拮抗剂agtr1(a1166c)apob(100c711t)、cyp2c9*3、cyp2c9*13利尿降压药及其他add1(gly460trp)、scnn1g、enosa
7.药物反应性包括了疗效和安全性两个方面，即：同种同剂量的药物作用于不同基因型的患者，对于药物的代谢酶功能变化、作用靶点敏感性以及受体敏感性，有的人用药后恰好有效，有的人根本无效。在很多疾病治疗过程中，常发生用药不当而导致的副作用或因剂量不足无法达到治疗目的。因此针对这些病患的基因型进行个体化用药具有特别重要的意义。
8.目前，很多基因分型检测技术包括限制酶切分析、异源双链杂交分析、分子信标、焦磷酸测序技术以及质谱法均有应用。但这些方法也存在操作繁琐，成本高，难以实现高通量分析等问题。为了解决这些问题，开发高灵敏度的生物传感系统来检测疾病相关等位基因的位点信息尤为重要。因此，设计制备基于光学性能的高血压相关基因位点检测方法是
id no.6所示的单链dna，所述cyp2c9*3-s是seq id no.9所示的单链dna，所述cyp2c9*13-s是seq id no.12所示的单链dna，所述adrb3(w64r)-s是seq id no.15所示的单链dna，所述scnn1g(t》a)-s是seq id no.18所示的单链dna，所述cyp3a5*3-s是seq id no.21所示的单链dna，所述cacna1c-s是seq id no.24所示的单链dna。
22.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述引物组合物还包括单碱基延伸引物对应的荧光标记的dntp，所述abcb1(s893a)-s对应的荧光标记的dntp为datp；edn1(g5665t)-s对应的荧光标记的dntp为dctp；cyp2c9*3-s对应的荧光标记的dntp为dutp；cyp2c9*13-s对应的荧光标记的dntp为dutp；adrb3(w64r)-s对应的荧光标记的dntp为dgtp；scnn1g(t》a)-s对应的荧光标记的dntp为dgtp；cyp3a5*3-s对应的荧光标记的dntp为dutp；cacna1c-s对应的荧光标记的dntp为dctp。
23.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述单碱基延伸引物对应的荧光标记为荧光素或cy3。
24.上述的试剂或试剂盒中，所述引物组合物可组合使用，也可单独使用。
25.上述的试剂或试剂盒中，所述pcr引物对的两个引物可以分别单独包装，也可以包装在一起。
26.上述的试剂或试剂盒中，所述pcr引物对abcb1(s893a)-fr、edn1(g5665t)-fr、cyp2c9*3-fr、cyp2c9*13-fr、adrb3(w64r)-fr、scnn1g(t》a)-fr、cyp3a5*3-fr和cacna1c-fr可以分别单独包装，也可以两个一组包装在一起。
27.上述的试剂或试剂盒中，所述引物组合物中引物abcb1(s893a)-fw、abcb1(s893a)-rw、edn1(g5665t)-fw、edn1(g5665t)-rw、cyp2c9*3-fw、cyp2c9*3-rw、cyp2c9*13-fw、cyp2c9*13-rw、adrb3(w64r)-fw、adrb3(w64r)-rw、scnn1g(t》a)-fw、scnn1g(t》a)-rw、cyp3a5*3-fw、cyp3a5*3-rw、cacna1c-fw和cacna1c-rw的物质的量可以相同也可以不同。
28.上述的试剂或试剂盒中，所述单碱基延伸引物abcb1(s893a)-s、edn1(g5665t)-s、cyp2c9*3-s、cyp2c9*13-s、adrb3(w64r)-s、scnn1g(t》a)-s、cyp3a5*3-s和cacna1c-s10的物质的量可以相同、也可以不同。
29.上述的试剂或试剂盒中，所述阳离子共轭聚合物为聚芴衍生物；
30.上述的试剂或试剂盒中，所述单碱基延伸引物及其对应的荧光标记的dntp可以分别单独包装也可包装在一起；
31.上述的试剂或试剂盒中，所述8组单碱基延伸引物和单碱基延伸引物的对应的荧光标记的dntp可以分为8组分别包装，也可两两组合包装在一起。
32.上述的试剂或试剂盒中，所述pcr引物对两两组合和单碱基延伸引物两两组合的原则是：单碱基延伸引物对应的dntp碱基类型不同的pcr引物对和单碱基延伸引物可以两两组合。
33.上述的试剂或试剂盒中，所述两两组合中的单碱基延伸引物对应的dntp分别采用不同的荧光标记物质进行标记，比如分别一个选择荧光素作为标记物质，另一个就选择cy3作为荧光标记物质。
34.为解决上述技术问题，本发明还提供鉴定或辅助鉴定待测样品snp的多态性或基因型多态性的引物组合物，所述引物组合物含有上述的pcr引物对。
35.进一步地，上述的引物组合物还包括上述的单碱基延伸引物和/或上述的单碱基
延伸引物对应的荧光标记的dntp。
36.为解决上述技术问题，本发明还提供上述的试剂或试剂盒或上述的引物组合物在鉴定或辅助鉴待测样品snp的多态性或基因型多态性中的应用。
37.为解决上述技术问题，本发明还提供鉴定或辅助鉴定待测样品snp的多态性或基因型多态性的方法，所述snp选自rs2032582、rs5370、rs1057910、rs72558187、rs4994、rs5729、rs776746和rs2283274这8种snp中的全部或部分；所述方法包括如下步骤：
38.步骤1)、以待测样品的基因组dna为模板dna，分别加入上述的pcr引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；
39.步骤2)、用上述的单碱基延伸引物和上述的dntp与步骤1)获得的扩增产物进行单碱基延伸反应，得到荧光标记的pcr产物；
40.步骤3)、得到的荧光标记pcr产物与阳离子共轭聚合物反应，得到荧光共振能量转移比值。
41.进一步地，上述的方法中，步骤1)中pcr扩增反应可分为4个pcr扩增反应体系进行，同一个pcr扩增反应体系中两个引物组合物中的单碱基延伸引物的下游核苷酸碱基种类不同；
42.步骤2)中所述单碱基延伸反应分为4个反应体系，反应体系中分别加入与步骤1)的扩增产物对应的单碱基延伸引物与dntp。
43.在本发明的一个实施例中，所述4个pcr扩增反应体系分别为cyp2c9*3-fr-scnn1g(t》a)-fr体系、cyp2c9*13-fr-adrb3(w64r)-fr体系、cyp3a5*3-fr-cacna1c-fr体系、abcb1(s893a)-fr-edn1(g5665t)-fr体系，所述cyp2c9*3-fr-scnn1g(t》a)-fr体系含有上述的pcr引物对cyp2c9*3-fr和上述的pcr引物对scnn1g(t》a)-fr，cyp2c9*13-fr-adrb3(w64r)-fr体系含有上述的pcr引物对cyp2c9*13-fr和上述的pcr引物对adrb3(w64r)-fr，cyp3a5*3-fr-cacna1c-fr体系含有上述的pcr引物对cyp3a5*3-fr和上述的pcr引物对cacna1c-fr，abcb1(s893a)-fr-edn1(g5665t)-fr体系含有上述的pcr引物对abcb1(s893a)-fr和上述的pcr引物对edn1(g5665t)-fr；
44.步骤2)中所述单碱基延伸反应分为4个反应体系，所述4个反应体系分别为cyp2c9*3-s-scnn1g(t》a)-s体系、cyp2c9*13-s-adrb3(w64r)-s体系、cyp3a5*3-s-cacna1c-s体系、abcb1(s893a)-s-edn1(g5665t)-s体系，所述cyp2c9*3-s-scnn1g(t》a)-s体系包括上述单碱基延伸引物cyp2c9*3-s和scnn1g(t》a)-s及上述的荧光物质标记的dutp和荧光物质标记的dgtp，所述cyp2c9*13-s-adrb3(w64r)-s体系包括上述单碱基延伸引物cyp2c9*13-s和adrb3(w64r)-s及上述的荧光物质标记的dutp和荧光物质标记的dgtp，所述cyp3a5*3-s-cacna1c-s体系包括上述单碱基延伸引物cyp3a5*3-s和cacna1c-s及上述的荧光物质标记的dutp和荧光物质标记的dctp，所述abcb1(s893a)-s-edn1(g5665t)-s体系包括上述单碱基延伸引物abcb1(s893a)-s和edn1(g5665t)-s及上述的荧光物质标记的datp和荧光物质标记的dctp。
45.同一反应体系中，选择不同的荧光物质标记dntp。
46.在本发明的一个实施例中，所述pcr扩增反应的pcr引物对的两两组合可为：
①
cyp2c9*3-fr和scnn1g(t》a)-fr共同进行双重pcr扩增反应；
②
cyp2c9*13-fr和adrb3(w64r)-fr共同进行双重pcr扩增反应；
③
cyp3a5*3-fr和cacna1c-fr共同进行双重pcr扩增
反应；
④
abcb1(s893a)-fr和edn1(g5665t)-fr共同进行双重pcr扩增反应；
47.pcr扩增产物与单碱基延伸反应的双重标记的两两组合可为
①
单碱基延伸引物cyp2c9*3-s及荧光素标记的dutp、scnn1g(t》a)-s及cy3标记的dgtp为一组；
②
单碱基延伸引物cyp2c9*13-s及荧光素标记的dutp、adrb3(w64r)-s及cy3标记的dgtp为一组；
③
单碱基延伸引物cyp3a5*3-s及荧光素标记的dutp、cacna1c-s及cy3标记的dctp为一组；
④
单碱基延伸引物abcb1(s893a)-s及荧光素标记的datp、edn1(g5665t)-s及cy3标记的dctp为一组。
48.上述方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的。
49.它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
50.进一步地，上述的试剂或试剂盒、引物组合物、应用、方法中，所述待测样品为高血压患者的血液。
51.本发明的实验证明，本发明所提供的多色单碱基多态性基因检测方法同时检测多个基因突变位点，克服现有基因突变检测技术的不足，检测通量高、灵敏度高、特异性高的特征，灵敏度可以达到2％，样本的dna浓度可以低至0.2～2ng/μl，通过分析荧光共振转移能量fret比值，可对患病者的血液样本进行基因突变的量化分析。根据不同的病患的基因突变情况，快速精准的对心血管疾病个性化用药基因多态性进行检测分析，对病人具有一定的辅助诊断和指导用药的意义。
附图说明
52.图1为基因组中cyp2c9*3基因、cyp2c9*13基因、scnn1g(t》a)基因、cyp3a5*3基因的pcr反应结果。
53.图2为应用pfp检测16个高血压病人的血液样本的基因组cyp2c9*3基因、cyp2c9*13基因、scnn1g(t》a)基因、cyp3a5*3基因、edn1(g5665t)基因、abcb1(s893a)基因、cacna1c-rs2283274基因、adrb3(w64r)基因的突变情况。
54.图3为特异性探针进行单碱基延伸的荧光光谱。
55.图4为应用pfp检测基因cyp2c9*3基因、cyp2c9*13基因、scnn1g(t》a)基因、cyp3a5*3基因、edn1(g5665t)基因、abcb1(s893a)基因、cacna1c-rs2283274基因、adrb3(w64r)基因的未突变与突变的荧光共振能量转移比例变化。
56.图5为验证样本荧光检测情况的测序结果。
具体实施方式
57.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
58.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
59.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
60.实施例中所述pfp按照下列步骤合成：
[0061][0062]
pfp的结构如上式所示，合成方法如下：
[0063]
向100ml的单口瓶加入50ml甲苯、5.2克新戊二醇和0.5克对甲苯磺酸，回流24小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂：二氯甲烷)后得到4.8克1,4-苯二硼酸新戊二酯。
[0064]
向50ml的单口瓶加入10ml干燥的四氢呋喃和0.65克2,7-二溴芴，低温冷却至-78℃后加入2ml 2m丁基锂溶液低温搅拌1小时，加入0.67克1,6-二碘己烷于室温反应过夜，结束反应。向反应液加入10ml水和15ml氯仿，分液，有机层经水洗、无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂，硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯：20/1，v/v)得到0.6克2,7-二溴-9,9-二(6-碘己基)芴。
[0065]
向25ml的二口瓶中加入5.4ml甲苯和3.6ml 2m碳酸钾，鼓入氮气30分钟后，加入325毫克2,7-二溴-9,9-二(6-溴己基)芴，165毫克1,4-苯二硼酸新戊二酯和20毫克四(三苯基膦)钯，于氮气下95℃搅拌反应24小时，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩，丙酮沉淀，得到210毫克浅黄色固体。将固体溶于20毫升二氯甲烷，加入1毫升三甲胺于室温搅拌24小时后离心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚合物pfp。
[0066]
实施例1.待测样本的dna提取
[0067]
收集16个高血压患者的血液样本(样本来自于中国人民解放军总医院，患者已签署知情同意书)，用全血基因组dna提取试剂盒(吸附柱法)(北京索莱宝科技有限公司)提取全血基因组dna，具体步骤如下：
[0068]
取0.6ml血液样本，加入2-3倍体积的红细胞裂解液，涡旋混匀，12000rpm离心1min，重复2次至离心出的沉淀为白色或淡红色，倒掉上清液体。向沉淀中加入0.2ml溶液a，震荡至混匀。再加入0.02ml的rnase a(10mg/ml)，混合均匀，室温放置10min。随后加入0.02ml的蛋白酶k(10mg/ml)混合均匀，置于65℃水浴消化45min。消化完全后加入0.24ml溶液b，涡旋混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。加0.6ml漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，此步骤重复2次。将吸附柱敞口置于50℃温箱放置10min，去除吸附柱中残余的漂洗液。换一个干净的离心管，将吸附柱置于离心管上，加入0.05ml洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min，此步骤重复2次，得到所需的dna样品。
[0069]
基因组dna浓度使用nanodrop光度计根据260nm处的吸光度定量。
[0070]
实施例2.扩增引物和单碱基延伸引物的组合设计及使用
[0071]
用primer3 plus设计扩增基因的pcr引物对，通过调整引物的长度，保证溶解温度(tm)在55-65℃之间。
[0072]
2.1.用于检测β－受体阻滞剂的相关基因引物和单碱基延伸引物组合
[0073]
abcb1(s893a)-fw：gcatagtaagcagtagggagtaac(seq id no.1)；
[0074]
abcb1(s893a)-rw：tgtctggacaagcactgaaaga(seq id no.2)；
[0075]
abcb1(s893a)-s：tttgactcaccttcccagc(seq id no.3)；
[0076]
edn1(g5665t)-fw：ctcttatcttgctttattaggtcgg(seq id no.4)；
[0077]
edn1(g5665t)-rw：cttcagacaggccccgaag(seq id no.5)；
[0078]
edn1(g5665t)-s：ccaagctgaaaggcaat(seq id no.6)；
[0079]
上述基因的引物和单碱基延伸引物具体检测的是abcb1(s893a)基因-rs2032582、edn1(g5665t)基因-rs5370的多态性。
[0080]
2.2.用于检测血管紧张素ii受体阻滞剂的相关基因引物和单碱基延伸引物组合
[0081]
cyp2c9*13-fw：ctctcaaaggtctatggccct(seq id no.7)；
[0082]
cyp2c9*13-rw：cccaagacagatgctgaaacag(seq id no.8)；
[0083]
cyp2c9*13-s：tgaaggaagccctgattgatcc(seq id no.9)；
[0084]
cyp2c9*3-fw：agagattgaacgtgtgattggc(seq id no.10)；
[0085]
cyp2c9*3-rw：ttgcagtgtaggagaaacaaac(seq id no.11)；
[0086]
cyp2c9*3-s：tgcacgaggtccagagatacc(seq id no.12)；
[0087]
上述基因的引物和单碱基延伸引物具体检测的是cyp2c9*13基因-rs72558187、cyp2c9*3基因-rs1057910的多态性。
[0088]
2.3.用于检测利尿剂或其它的相关基因引物和探针组合
[0089]
adrb3(w64r)-fw：cacgttggtcatggtctgga(seq id no.13)；
[0090]
adrb3(w64r)-rw：caggggttccgtgggagg(seq id no14)；
[0091]
adrb3(w64r)-s：ctggagtctcggagtccg(seq id no.15)；
[0092]
scnn1g(t》a)-fw：agaaaggtgtcctccatgcc(seq id no.16)；
[0093]
scnn1g(t》a)-rw：catgccccaaagtgaggaca(seq id no.17)；
[0094]
scnn1g(t》a)-s：tggtggagatcagagtgccga(seq id no.18)；
[0095]
上述基因的引物和单碱基延伸引物具体检测的是adrb3(w64r)基因-rs4994、scnn1g-(t》a)-rs5729基因的多态性。
[0096]
2.4.用于检测钙拮抗剂的相关基因引物和单碱基延伸引物组合
[0097]
cyp3a5*3-fw：tctagttcattagggtgtgacaca(seq id no.19)；
[0098]
cyp3a5*3-rw：gagtggcataggagatacccac(seq id no.20)；
[0099]
cyp3a5*3-s：tggtccaaacagggaagagatac(seq id no.21)；
[0100]
cacna1c-rs2283274-fw：tgtttatggagccctgactc(seq id no.22)；
[0101]
cacna1c-rs2283274-rw：agaggtccccacttcatcaa(seq id no.23)；
[0102]
cacna1c-rs2283274-s：atgggacctgctcatcat(seq id no.24)；
[0103]
上述基因的引物和单碱基延伸引物具体检测的是cyp3a5*3基因-rs776746、cacna1c基因-rs2283274的多态性。
[0104]
实施例3.含有突变位点的dna片段扩增
[0105]
3.1.基因组dna进行单重pcr扩增
[0106]
分别针对cyp2c9*3基因，cyp2c9*13基因，scnn1g(t》a)基因和cyp3a5*3基因的pcr引物对进行扩增反应，反应体系分为4个体系进行：
[0107]
体系1反应液包括10
×
ex taq buffer(3μl)，dntp混合物(各2.5mm)，ex taq(0.025u/μl)，cyp2c9*3-fw和cyp2c9*3-rw；
[0108]
体系2反应液包括10
×
ex taq buffer(3μl)，dntp混合物(各2.5mm)，ex taq(0.025u/μl)，cyp2c9*13-fw和cyp2c9*13-rw；
[0109]
体系3反应液包括10
×
ex taq buffer(3μl)，dntp混合物(各2.5mm)，ex taq(0.025u/μl)，scnn1g(t》a)-fw和scnn1g(t》a)-rw；
[0110]
体系4反应液包括10
×
ex taq buffer(3μl)，dntp混合物(各2.5mm)，ex taq(0.025u/μl)，cyp3a5*3-fw和cyp3a5*3-rw；
[0111]
反应条件：94℃变性2分钟后，进行28个循环(94℃-30s，63℃-30s，72℃-30s)，得到各个基因的扩增产物，琼脂糖凝胶电泳验证产物是否为目标dna片段。琼脂糖凝胶电泳验证结果如图1所示，图1中泳道1表示cyp2c9*3扩增产物、泳道2表示cyp2c9*13扩增产物、泳道3表示scnn1g(t》a)扩增产物、泳道4表示cyp3a5*3扩增产物。以上结果表明：实施例1中提取的基因组dna经过特异性引物pcr扩增反应可得到目标dna片段。
[0112]
3.2.基因组dna进行双重pcr扩增
[0113]
将上述基因以基因组dna为模板做双重pcr扩增，同时扩增两个突变位点的dna片段。
[0114]
分别以编号1-16的dna为模板，加入上述相关基因的pcr引物对进行pcr扩增。pcr扩增反应分为4组进行：
[0115]
体系1添加扩增cyp2c9*3基因和scnn1g(t》a)基因的引物cyp2c9*3-fw、引物cyp2c9*3-rw、引物scnn1g(t》a)-fw、引物scnn1g(t》a)-rw；
[0116]
体系2添加扩增cyp2c9*13基因和adrb3(w64r)基因的引物cyp2c9*13-fw、引物cyp2c9*13-rw、引物adrb3(w64r)-fw、引物adrb3(w64r)-rw；
[0117]
体系3添加扩增cyp3a5*3基因和cacna1c基因的引物cyp3a5*3-fw、引物cyp3a5*3-rw、引物cacna1c-fw、引物cacna1c-rw；
[0118]
体系4添加扩增abcb1(s893a)基因、edn1(g5665t)基因的引物abcb1(s893a)-fw、引物abcb1(s893a)-rw、引物edn1(g5665t)-fw、引物edn1(g5665t)-rw；
[0119]
上述4组pcr扩增的多重反应体系组成均为：基因组dna样本(2ng)、pcr buffer(10
×
)3μl、mgcl2 3μl、taq酶0.15μl、dntps 3μl。
[0120]
上述4组pcr扩增的反应体系进行多重pcr扩增反应程序均为：
[0121]
预热阶段：94℃预热变性2分钟；
[0122]
扩增阶段：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，并进行28个循环。
[0123]
3.3.双重特异性探针的标记特异性引物单碱基延伸反应
[0124]
将3.2获得的4个体系的pcr产物分别进行消化，消化反应体系及反应条件为：10
×
sap buffer(1.2μl)、核酸外切酶(1u)、虾碱基磷酸酶(1u)、酵母焦磷酸酶(0.05u)，将反应管转移到热循环器中，37℃反应60min，再加热到80℃恒温15min，最后4℃保持；
[0125]
将消化后的产物按组进行特异性引物单碱基延伸反应，具体可为：
[0126]
向3.2体系1消化产物中加入单碱基延伸引物cyp2c9*3-s、scnn1g(t》a)-s和荧光素标记的dutp-f、cy3标记的dgtp-cy3；
[0127]
向3.2体系2消化产物中加入单碱基延伸引物cyp2c9*13-s、adrb3(w64r)-s和荧光
素标记的dutp-f、cy3标记的dgtp-cy3；
[0128]
向3.2体系3消化产物中加入单碱基延伸引物cyp3a5*3-s、cacna1c-s和荧光素标记的dutp-f、cy3标记的dctp-cy3；
[0129]
向3.2体系4消化产物中加入单碱基延伸引物abcb1(s893a)-s、edn1(g5665t)-s和荧光素标记的datp-f、cy3标记的dctp-cy3；
[0130]
具体的多重反应体系及反应条件均为：
[0131]
反应中含有1.5μl的消化后pcr产物，加入0.75μl 40μm荧光素标记的dntp-f1和0.75μl 40μm cy3标记的dntp-cy3以及1.5单位的热启动酶，1.5μl 10μm上述对应的特异性探针，最终反应体积为15μl。
[0132]
根据以上反应体系进行多重pcr扩增反应程序：
[0133]
预热阶段：94℃预热变性4分钟；
[0134]
扩增阶段：94℃变性30s，63℃退火30s，并进行60个循环。
[0135]
编号为1-16的dna基因样本最后获得双重的特异性探针标记产物共计4组。
[0136]
3.4.基于阳离子共轭聚合物进行fret检测
[0137]
将10μl pfp储备液(1mm，溶剂为二甲基亚砜)加入到490μl二甲基亚砜(dmso)、500μl的n-2-羟乙基哌嗪-n
’‑
2-乙磺酸hepes缓冲液(25mm)中配成pfp工作液。
[0138]
在96孔板中加入90μl的pfp工作液分别和上述得到的4组荧光标记产物混合。然后将96孔板放入multi-mode酶标仪中进行检测，380nm激发波长，425nm、530nm和574nm发射波长，检测各个样本各基因突变位点的情况。
[0139]
如图3所示，加入特异性探针的反应产物可以发生有效的荧光共振能量转移。
[0140]
如图4所示，未突变的cyp2c9*3基因、cyp2c9*13基因、scnn1g(t》a)基因、cyp3a5*3基因、edn1(g5665t)基因、abcb1(s893a)基因、cacna1c-rs2283274基因、adrb3(w64r)基因荧光共振能量转移的比例低于0.05或0.1，突变的cyp2c9*3基因、cyp2c9*13基因、scnn1g(t》a)基因、cyp3a5*3基因、edn1(g5665t)基因、abcb1(s893a)基因、cacna1c-rs2283274基因、adrb3(w64r)基因荧光共振能量转移的比例高于0.05或0.1。
[0141]
荧光标记物质为荧光素时，fret选取i
530nm
/i
425nm
的比值作为fret检测的结果；荧光标记物质为cy3时，选取i
574nm
/i
425nm
的比值作为fret检测的结果，16个样本的fret检测结果如表2所示。
[0142]
表2：16个样本的fret检测结果
[0143]
[0144][0145]
fret检测的结果的判断标准如下：
[0146]
1)若待测基因的荧光物质标记为荧光素，其fret比值小于0.05，则对应的待测样本为或候选为非基因突变样本；待测患者可按剂量用此基因对应的相关药物；
[0147]
2)若待测基因的荧光物质标记为荧光素，其fret比值大于或等于0.05，则对应的待测样本为或候选为基因突变样本；待测患者需调整用药剂量或换成其它药物；
[0148]
3)若待测基因的荧光物质标记为cy3，其fret比值小于0.1，则对应的待测样本为或候选为非基因突变样本；待测患者可按剂量用此基因对应的相关药物；
[0149]
4)若待测基因的荧光物质标记为cy3，其fret比值大于或等于0.1，则对应的待测样本为或候选为基因突变样本；待测患者需调整用药剂量或换成其它药物。
[0150]
16个高血压病人的检测结果如图2所示，图2中a、b表示血管紧张素ii受体阻滞剂和利尿降压药的相关基因检测结果，结果表明，测定的患者样本中16个患者样本的cyp2c9*3基因的fret比值低于0.05，基因cyp2c9*13的fret比值低于0.05，15个患者样本的scnn1g(t》a)基因的fret比值低于0.1，基因adrb3(w64r)的fret比值低于0.1，其中样本3的scnn1g(t》a)的fret比值高于0.1，基因adrb3(w64r)的fret比值高于0.1；
[0151]
图2中c表示钙拮抗剂的相关基因的检测结果，结果表明：测定的患者样本中12个患者样本的cyp3a5*3基因的fret比值低于0.05，16个患者样本的基因cncan1c的检测fret比值低于0.1，4个患者样本的cyp3a5*3基因的fret比值高于0.05；
[0152]
图2中d表示β-受体阻滞剂的相关基因的检测结果，结果表明：测定的患者样本中16个患者样本的abcb1(s893a)基因的fret比值低于0.05，15个患者样本的edn1(g5665t)基因的fret比值低于0.1，1个患者样本的edn1(g5665t)基因的fret比值高于0.1；
[0153]
每个病人都有不同的基因突变情况。根据荧光标记产物的阈值判定药物相关的基因突变结果。根据所得到的结果对病人进行指导用药，辅助医生为患者制定个性化治疗方
案。给予患者最适合的治疗方案。
[0154]
3.5.fret检测的验证实验
[0155]
采用随机抽样测序验证fret检测的的结果。
[0156]
抽取dna样本3送去测序，结果表明：
[0157]
编号3的样本的体系1突变为t》a，为snn1g(t》a)基因的核苷酸位点突变；体系2突变为a》g，为adrb3(w64r)基因的核苷酸位点突变，体系3突变为t》c，为cyp3a5*3基因的核苷酸位点突变(图5)；
[0158]
结果与本发明所述方法的检测结果一致。
[0159]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但不以本发明为限制，任何本领域的技术人员凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。