一种诱导禾谷镰刀菌大量产孢及制备孢子液方法

1.本发明属于植物保护技术领域，具体为麦麸在诱导禾谷镰刀菌产生分生孢上的应用及制备一定浓度的孢子液方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.禾谷镰刀菌是一种农业中重要的病原菌，侵染小麦、玉米、水稻等，引起植物病害，造成粮食减产甚至绝产，是世界性农业难题。
4.禾谷镰刀菌侵染作物后产脱氧雪腐镰刀烯醇(呕吐毒素，简称don)，引起人畜中毒。
5.禾谷镰刀菌在许多培养基上，只进行营养生长，不产分生孢子。不利于禾谷镰刀菌的鉴定，及发生规律的研究。在研究禾谷镰刀菌防治技术时，需要首先制备禾谷镰刀菌孢子菌悬液注射到作物中，因此需要大量的孢子液。
6.目前，现有的机种绿豆培养基、康乃馨培养基产孢子量较少，周期长，容易发生变异。


技术实现要素：

7.针对上述所存在的问题，本发明提出了一种诱导禾谷镰刀菌大量产孢及制备孢子液方法。
8.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一个方面，提供了一种诱导禾谷镰刀菌大量产孢及制备孢子液方法，包括：
10.将禾谷镰刀菌活化，得到菌饼；
11.将活化后的菌饼接种到麦麸培养基，进行培养；
12.对产孢后培养基进行过滤，取滤液进行固液分离，去掉上清液，用无菌水对孢子进行稀释，得到孢子悬液；
13.其中，所述麦麸培养基的制备方法为：麦麸过筛子，去掉面粉和次粉；加水，大火煮10-15min；过滤除去滤渣；将滤液定容，灭菌，冷却后加入双抗，即得。
14.麦麸是面粉生产过程中的副产物，原料来源简单易得，成本低廉。研究发现：小麦本身是禾谷镰刀菌的寄主，利用麦麸等天然培养基诱导禾谷镰刀菌产孢，有利于保持禾谷镰刀菌的性状和生理活性特征，避免在传代过程中产毒活性减弱，减少变异情况。
15.本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的孢子液。
16.本发明的第三个方面，提供了上述的孢子液在植物病害防治中的应用。
17.本发明的有益效果在于：
18.(1)本发明利用麦麸培养基可以促进禾谷镰刀菌大量产孢，培养3-5天，菌丝体呈红色(赤霉病小麦粒颜色)，过滤菌丝即可得到大量的禾谷镰刀菌孢子液，血球计数板计数后，利用无菌水调整孢子液浓度，即可得到合适浓度的禾谷镰刀菌孢子液。原料易得，成本低廉，操作简单。可以获得大量的形态均一的孢子。
19.(2)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
21.图1.显微镜400
×
放大图(产孢结构，分生孢子座和分生孢子梗)；
22.图2.(a)显微镜400
×
放大图(产孢结构)；(b)显微镜10
×
放大图(菌丝及孢子)；
23.图3.显微镜100
×
放大图(孢子)；
24.图4.显微镜400
×
放大图(孢子)；
25.图5.液体培养。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.一种诱导禾谷镰刀菌大量产孢及制备孢子液方法，包括：
28.将禾谷镰刀菌活化，得到菌饼；
29.将活化后的菌饼接种到麦麸培养基，进行培养；
30.对产孢后培养基进行过滤，取滤液进行固液分离，去掉上清液，用无菌水对孢子进行稀释，得到孢子悬液；
31.其中，所述麦麸培养基的制备方法为：麦麸过筛子，去掉面粉和次粉；加水，大火煮10-15min；过滤除去滤渣；将滤液定容，灭菌，冷却后加入双抗，即得。
32.在一些实施例中，所述麦麸培养基的浓度为0.8％～1.2％。
33.在一些实施例中，所述活化的具体步骤为：将禾谷镰刀菌活化到pda培养基上，室温下培养2-5天。
34.在一些实施例中，所述培养采用摇床培养。
35.在一些实施例中，所述摇床培养的条件为：25-28℃，150～180rpm，培养12～16天。
36.在一些实施例中，孢子液浓度1
×
105～5
×
105个/ml。
37.在一些实施例中，所述pda培养基的组成如下：马铃薯浸出粉6～8g/l，葡萄糖20～23g/l，琼脂15～16g/l。
38.在一些实施例中，所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，优选地，121～123℃高压蒸汽灭菌15～18min。
39.在一些实施例中，双抗为hyclone青链霉素，双抗的加入可以抑制在液体培养的过程中细菌过度繁殖，避免细菌过度繁殖对后续实验的影响。
40.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施
例是对本发明的解释而不是限定。
41.实施例1
42.1、供试禾谷镰刀菌菌株：菌株由山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室于2021年从赤霉病小麦粒中分离所得，目前保存于山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室。
43.2、培养基：
44.pda培养基：马铃薯浸出粉6g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l。121℃高压蒸汽灭菌15min，待温度降到50℃左右倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
45.1％麦麸培养基：麦麸过40目筛子，去掉面粉和次粉。称取10g麦麸加入1l水，大火煮10-15min。四层纱布过滤除去滤渣。滤液补足至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入1％双抗。(双抗的商品名称，hyclone青链霉素；厂家，thermo。)
46.(1)禾谷镰刀菌活化：将禾谷镰刀菌活化到pda培养基上，室温下培养2-5天。
47.(2)接种：待菌落直径3-5cm时，无菌打孔器在菌落边缘打孔(打孔器直径6mm)得到直径为6mm的菌饼，利用无菌接种针挑取一枚菌饼接种到1％麦麸培养基中。
48.(3)摇床培养：摇床25-28℃，150rpm。
49.(4)结果：液体培养基下培养一周左右，取上清液在显微镜下可检出孢子，2周孢子量可达10^8－10^9个/ml，产生的孢子为形态大小一致的镰孢形大型分生孢子，两端尖，孢子隔膜以3－5个隔膜的孢子居多，大小，(2－6)μm
×
(20－60)μm，基部有明显足细胞。菌丝颜色玫红色。pda培养基上不产孢，菌丝白色，棉絮状。
50.(5)制备孢子悬液：液体培养基培养2周后，四层无菌纱布过滤菌丝，滤液经离心机12000转/分钟，离心5-10min。去掉上清液，加入无菌水重悬后，血球计数板计数，用无菌水调整孢子液浓度1-5
×
10^5个/ml。备用。
51.液体培养基下产孢结构和分生孢子具体如图1至图4所示。
52.实施例2
53.1、供试禾谷镰刀菌菌株：菌株由山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室于2021年从赤霉病小麦粒中分离所得，目前保存于山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室。
54.2、培养基：
55.pda培养基：马铃薯浸出粉8g/l，葡萄糖23g/l，琼脂15g/l。121℃高压蒸汽灭菌15min，待温度降到50℃左右倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
56.1.2％麦麸培养基：麦麸过40目筛子，去掉面粉和次粉。称取12g麦麸加入1l水，大火煮10-15min。四层纱布过滤除去滤渣。滤液补足至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入1％双抗。(双抗的商品名称，hyclone青链霉素；厂家，thermo。)
57.(1)禾谷镰刀菌活化：将禾谷镰刀菌活化到pda培养基上，室温下培养2-5天。
58.(2)接种：待菌落直径3-5cm时，无菌打孔器在菌落边缘打孔(打孔器直径6mm)得到直径为6mm的菌饼，利用无菌接种针挑取一枚菌饼接种到1.2％麦麸培养基中。
59.(3)摇床培养：摇床25-28℃，150rpm。
60.(4)结果：液体培养基下培养一周左右，取上清液在显微镜下可检出孢子，2周孢子量可达10^8－10^9个/ml，产生的孢子为形态大小一致的镰孢形大型分生孢子，两端尖，孢子
隔膜以3－5个隔膜的孢子居多，大小，(2－6)μm
×
(20－60)μm，基部有明显足细胞。菌丝颜色玫红色。pda培养基上不产孢，菌丝白色，棉絮状。
61.(5)制备孢子悬液：液体培养基培养2周后，四层无菌纱布过滤菌丝，滤液经离心机12000转/分钟，离心5-10min。去掉上清液，加入无菌水重悬后，血球计数板计数，用无菌水调整孢子液浓度1-5
×
10^5个/ml。备用。
62.实施例3
63.1、供试禾谷镰刀菌菌株：菌株由山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室于2021年从赤霉病小麦粒中分离所得，目前保存于山东省农科院作物所谷物营养与质量安全实验室。
64.2、培养基：
65.pda培养基：马铃薯浸出粉6g/l，葡萄糖20g/l，琼脂16g/l。121℃高压蒸汽灭菌15min，待温度降到50℃左右倒入9cm的一次性培养皿中，冷却凝固后待用。
66.0.8％麦麸培养基：麦麸过40目筛子，去掉面粉和次粉。称取8g麦麸加入1l水，大火煮10-15min。四层纱布过滤除去滤渣。滤液补足至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入1％双抗。(双抗的商品名称，hyclone青链霉素；厂家，thermo。)
67.(1)禾谷镰刀菌活化：将禾谷镰刀菌活化到pda培养基上，室温下培养2-5天。
68.(2)接种：待菌落直径3-5cm时，无菌打孔器在菌落边缘打孔(打孔器直径6mm)得到直径为6mm的菌饼，利用无菌接种针挑取一枚菌饼接种到0.8％麦麸培养基中。
69.(3)摇床培养：摇床25-28℃，150rpm。
70.(4)结果：液体培养基下培养一周左右，取上清液在显微镜下可检出孢子，2周孢子量可达10^8－10^9个/ml，产生的孢子为形态大小一致的镰孢形大型分生孢子，两端尖，孢子隔膜以3－5个隔膜的孢子居多，大小，(2－6)μm
×
(20－60)μm，基部有明显足细胞。菌丝颜色玫红色。pda培养基上不产孢，菌丝白色，棉絮状。
71.(5)制备孢子悬液：液体培养基培养2周后，四层无菌纱布过滤菌丝，滤液经离心机12000转/分钟，离心5-10min。去掉上清液，加入无菌水重悬后，血球计数板计数，用无菌水调整孢子液浓度1-5
×
10^5个/ml。备用。
72.需要说明的是，以上实施例中，本技术的方法并不特定适用于该供试菌株，仅以其作为示例说明：本技术中，麦麸诱导禾谷镰刀菌大量产孢的效果。实际应用中，任何市售的禾谷镰刀菌皆可适用于本技术的方法，例如：武汉睿辰标物科技有限公司的bncc113713禾谷镰刀菌(斜面)，采用本技术的方法也获得了大量产孢的效果。
73.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。