1.本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及mirna应用技术领域，特别指一种用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒。
背景技术：
2.川崎病(kawasaki disease，kd)于1967年由日本川崎富作首先报告，曾被称为皮肤黏膜淋巴结综合征(mucocutaneous lymphnode syndrome ,mcls)，是一种原因未明的急性、自限性全身免疫性血管炎。它主要发病年龄为6个月～4岁，其特征为广泛的中小血管炎，以心血管系统的损害最为严重，主要累及冠状动脉，大约15％～25％未经治疗的儿童最终发展为冠状动脉损害，使其成为发达国家儿童获得性心脏病最常见的原因。研究认为，kd急性期、恢复期均存在长期的血管内皮功能紊乱，成为成人易患冠状动脉粥样硬化的危险因素。2004年美国心脏病协会提出：kd恢复后血管内皮功能持续性障碍，可能是冠心病发生的新的危险因素。
3.川崎病作为一种急性、自限性的全身性血管炎，主要临床表现为发热、口腔黏膜改变、皮疹、颈部淋巴结肿大、球结膜充血和肢端改变等。其特征为广泛的中、小血管炎症，以心血管系统损害最为严重，组织病理表现包括全血管炎、内皮坏死、单核细胞浸润中、小血管等。如果未及时经正规治疗，25％～30％的患儿会出现冠状动脉病变；而早期应用静脉大剂量丙种球蛋白(ivig)～将冠状动脉瘤的发生率降低到3％～5％左右。由于川崎病的早期最主要的症状是高者热程超过5天，易与颈淋巴结炎、猩红热、荨麻疹、败血症等其他发热性疾病混淆而产生误诊，据相关文献报道，川崎病的早期误诊率可高达26.7％，使误诊患儿不能在川崎病早期及时使用ivig进行联合治疗而导致后期的冠状动脉损伤。
4.血小板作为血液中第二丰富的细胞类型，血小板是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生。多功能造血干细胞在造血组织中经过定向分化形成原始的巨核细胞，又进一步成为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞膜表面形成许多凹陷，伸入胞质之中，相邻的凹陷细胞膜在凹陷深部相互融合，使巨核细胞部分胞质与母体分开。最后这些被细胞膜包围的与巨核细胞胞质分离开的成分脱离巨核细胞，经过骨髓造血组织中的血窦进入血液循环成为血小板。存在于外周血液循环中的血小板,在机体中起着止血和伤口愈合作用。
5.近年来研究发现，血小板已成为全身和局部反应的中心分子，在细胞交流和免疫反应中扮演了重要作用，并且由于血小板没有细胞核，在研究其rna时不会存在rrna的背景干扰。血小板在免疫反应中也起到了信号交流和转移传播的作用，由于川崎病是一种全身性的免疫性疾病，所以研究血小板rna对川崎病的早期诊断有着理论基础和实际意义，而目前关于这方面的研究报道非常少见。
6.专利cn 106701962 a用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒提供一种用于川崎病检测的核酸序列组合，包括反转录引物、扩增引物和探针序列，所述核酸序列组合能够有效定性/定量检测人血清中的hsa-mir-197、hsa-mir-671、hsa-mir1246和hsa-mir4436。该专利从血清样品获取外泌体mirna进行检测，而血液中的血清获取需要等待一定时间，且外
泌体本身不易获取，外泌体mirna的含量较少，提取外泌体mirna操作复杂，提取成本较高，且外泌体mirna的检测难度大。该专利中并未设置内参基因，在后期实验中可能存在个体差异。
7.专利cn104450901a快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒公开了hsa-mir-197、hsa-mir-671、hsa-mir-1246和hsa-mir-4436可以作为川崎病的分子标志，并具体公开了mir-1246、mir-4436b-5p、mir-197-3p和mir-671-5p的染料法荧光定量pcr引物序列，共计4组8条核酸序列，其检测精度仍存在改进的需要。
技术实现要素：
8.本发明的目的在于提出一种用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒，采集的是血小板中的mirna，血小板相较于外泌体而言更易获得，且含量丰富，提取方法简单。本发明设置了特异性的mirna内参基因，方法更为合理。选取的4种mirna来自于第二代高深度测序的结果，并结合临床信息综合分析评分所得，联合分析4种mirna，准确度远远大于单一生物标准物的检测，降低假阳性的发生。更易区分川崎病与普通发热等情况。具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点。
9.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种用于川崎病检测的核酸序列组合，包括反转录引物、扩增引物和探针序列，所述核酸序列组合能够有效定性/定量检测人血液血小板中的mir-125a-5p、hsa-mir-3182、hsa-mir-3675-5p、mir-4433b-5p和mir-126，其中mir-126作为内参标志物；其中，反转录引物序列如下：mir-125a-5p-sl：cagggcatcagcctgaaccctgaaccctgaataacctg aaactgatgccctgtcacag；hsa-mir-3182-sl：acgggaaactgagttcagttcccagcgtccatatcagt tcccagtttcccgtgactac；hsa-mir-3675-5p-sl：cagggcatcagcctgaaccctgaaccctgaataac ctgaaactgatgccctggaaatc；mir-4433b-5p-sl：cttgatggctgcccgtcaagccagtcaagtatccagt caagtcagccatcaagacagga；mir-126-sl：ttagggtcaggcctgaaccctgaaccctgaatgcgaactg acctgaccctaacgcatt；扩增引物序列如下：正向引物：mir-125a-5p-f：cctgaaccctgaaccctga；hsa-mir-3182-f：agttcagttcccagcgtcc；hsa-mir-3675-5p-f：cctgaaccctgaaccctga；mir-4433b-5p-f：cccgtcaagccagtcaagt；mir-126-f：cctgaaccctgaaccctga；反向引物：mir-125a-5p-r：ggtccctgagaccctttaac；
hsa-mir-3182-r：tgcgcgcttctgtagt；hsa-mir-3675-5p-r：cctctatggggcttctgtaga；mir-4433b-5p-r：gatgtcccacccccac；mir-126-r：gagctcgtaccgtgagtaat；探针序列如下：mir-125a-5p-p：aacctgaaactgatgccctg；hsa-mir-3182-p：atcagttcccagtttcccgt；hsa-mir-3675-5p-p：aacctgaaactgatgccctg；mir-4433b-5p-p：ccagtcaagtcagccatcaag；mir-126-p：gcgaactgacctgaccctaa。
10.本发明进一步保护一种用于川崎病检测的试剂盒，包括反转录试剂、扩增试剂和如上述的探针序列，所述探针核苷酸序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述探针核苷酸序列的荧光报告基团为fam、hex、vic、rox、cy5中的至少一种，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、mgb中的至少一种；所述反转录引物序列为上述的反转录引物；扩增引物为上述的正向引物和反向引物。
11.本发明进一步保护一种检测芯片或装置，其包括上述的反转录引物、扩增引物和探针序列。
12.本发明进一步保护上述的反转录引物、扩增引物和探针序列在制备川崎病的预测、辅助诊断川崎病的试剂或工具中的应用。
13.本发明进一步保护上述的核酸序列组合在制备定性和/或定量检测mir-125a-5p、hsa-mir-3182、hsa-mir-3675-5p、mir-4433b-5p和mir-126试剂中的用途。
14.本发明进一步保护一种检测目的基因mir-125a-5p、hsa-mir-3182、hsa-mir-3675-5p、mir-4433b-5p和内参基因mir-126的方法，包括如下步骤：1)从样品中提取血小板mirna，加入反转录引物mir-125a-5p-sl、hsa-mir-3182-sl、hsa-mir-3675-5p-sl、mir-4433b-5p-sl和mir-126-sl进行反转录，得到cdna；2)以cdna为模板，使用正向引物和反向引物进行扩增反应，扩增反应的同时加入探针序列，对扩增产物进行rt-qpcr分析，判断目的基因和内参基因的mirna的荧光定量反应ct值，计算核酸标志物的表达量r；所述正向引物包括mir-125a-5p-f、hsa-mir-3182-f、hsa-mir-3675-5p-f、mir-4433b-5p-f、mir-126-f；所述反向引物包括mir-125a-5p-r、hsa-mir-3182-r、hsa-mir-3675-5p-r、mir-4433b-5p-r、mir-126-r；所述探针序列包括mir-125a-5p-p、hsa-mir-3182-p、hsa-mir-3675-5p-p、mir-4433b-5p-p、mir-126-p；其中，反转录引物、扩增引物和探针序列如上述。
15.作为本发明的进一步改进，所述扩增反应体系和条件如下：premix ex taq（probe qpcr）（2x）：10μl；引物：f/r各0.4μl；探针：0.8μl；
cdna：1μl；ddh2o：补足至20μl；反应条件：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。
16.作为本发明的进一步改进，所述反转录包括：基因组dna去除步骤和cdna合成步骤；其中，基因组dna去除步骤中反应体系如下：5x gdna wiper mix：2μl；template rna：50ng；无酶无菌水（rnase-free water）：补足至10μl。
17.反应条件如下：42℃，2min；4℃，∞；所述cdna合成步骤中反应体系如下：反转录引物（10um）：1μl；上一步的混合液：10μl；无酶无菌水（rnase-free water）：5μl；10x rt mix：2μl；hiscript
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enzyme mix：2μl；反应条件如下：25℃，5min；50℃，15min；85℃，5min；4℃，∞。得到反转录产物，即cdna。
18.作为本发明的进一步改进，所述核酸标志物的表达量r为目的基因的ct值与内参基因的ct值的比值。
19.作为本发明的进一步改进，所述核酸标志物的表达量r满足以下至少三种时，即可判断为川崎病阳性；所述核酸标志物的表达量r满足以下两种时，判断为不确定；所述核酸标志物的表达量r满足以下少于两种时，判断为阴性；目标基因为mir-125a-5p时，r125a≤ 1.2；目标基因为hsa-mir-3182时，r3182《 1；目标基因为hsa-mir-3675-5p时，r3675《 1.3；目标基因为mir-4433b-5p时，r4433b≤ 1。
20.本发明具有如下有益效果：血小板相较于血小板外泌体更易于获得，且血小板含量高。通过收集血液中的血小板来提取血小板mirna，将mirna进行反转录，通过rt-qpcr检测目的基因和内参基因的ct值，通过计算来获得相应结果。本发明方法能及时、精准地将川崎病患儿与其他发热性疾病（如麻疹、热疹、肠胃炎、手足口病、疱疹等）患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。
21.本发明采集的是血小板中的mirna，血小板相较于外泌体而言更易获得，且含量丰富，提取方法简单。本发明设置了特异性的mirna内参基因，方法更为合理。本发明选取的4种mirna来自于第二代高深度测序的结果，并结合临床信息综合分析评分所得，联合分析4种mirna，准确度远远大于单一生物标准物的检测，降低假阳性的发生。更易区分川崎病与普通发热等情况。本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为m125a核酸标志物的roc曲线；图2为m4433b核酸标志物的roc曲线；图3为m3182核酸标志物的roc曲线；图4为m3675核酸标志物的roc曲线；图5为四种核酸标志物联合分析的roc曲线。
具体实施方式
24.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.mirna：microrna，是一类由内源基因编码的长度约为20-30 个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。
26.实施例1 用于川崎病检测的核酸序列组合包括反转录引物、扩增引物和探针序列。
27.川崎病检测样本为：人血液血小板。
28.川崎病检测标记物为：mir-125a-5p、hsa-mir-3182、hsa-mir-3675-5p、mir-4433b-5p和mir-126，其中mir-126作为内参标志物。
29.反转录引物序列如下：mir-125a-5p-sl：cagggcatcagcctgaaccctgaaccctgaataacctg aaactgatgccctgtcacag；hsa-mir-3182-sl：acgggaaactgagttcagttcccagcgtccatatcagt tcccagtttcccgtgactac；hsa-mir-3675-5p-sl：cagggcatcagcctgaaccctgaaccctgaataac ctgaaactgatgccctggaaatc；mir-4433b-5p-sl：cttgatggctgcccgtcaagccagtcaagtatccagt caagtcagccatcaagacagga；mir-126-sl：ttagggtcaggcctgaaccctgaaccctgaatgcgaactg acctgaccctaacgcatt；扩增引物序列如下：正向引物：mir-125a-5p-f：cctgaaccctgaaccctga；hsa-mir-3182-f：agttcagttcccagcgtcc；hsa-mir-3675-5p-f：cctgaaccctgaaccctga；
mir-4433b-5p-f：cccgtcaagccagtcaagt；mir-126-f：cctgaaccctgaaccctga；反向引物：mir-125a-5p-r：ggtccctgagaccctttaac；hsa-mir-3182-r：tgcgcgcttctgtagt；hsa-mir-3675-5p-r：cctctatggggcttctgtaga；mir-4433b-5p-r：gatgtcccacccccac；mir-126-r：gagctcgtaccgtgagtaat；探针序列如下：mir-125a-5p-p：aacctgaaactgatgccctg；hsa-mir-3182-p：atcagttcccagtttcccgt；hsa-mir-3675-5p-p：aacctgaaactgatgccctg；mir-4433b-5p-p：ccagtcaagtcagccatcaag；mir-126-p：gcgaactgacctgaccctaa。
30.所述探针核苷酸序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述探针核苷酸序列的荧光报告基团为fam、hex、vic、rox、cy5中的至少一种，优选地，为fam、hex，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、mgb中的至少一种，优选地，为bhq1。
31.实施例2一种用于川崎病检测的试剂盒包括反转录试剂、扩增试剂和探针序列。
32.所述探针序列包括mir-125a-5p-p、hsa-mir-3182-p、hsa-mir-3675-5p-p、mir-4433b-5p-p、mir-126-p；探针核苷酸序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述探针核苷酸序列的荧光报告基团为fam、hex、vic、rox、cy5中的至少一种，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、mgb中的至少一种。
33.所述反转录引物序列包括mir-125a-5p-sl、hsa-mir-3182-sl、hsa-mir-3675-5p-sl、mir-4433b-5p-sl和mir-126-sl；扩增引物为正向引物和反向引物；所述正向引物包括mir-125a-5p-f、hsa-mir-3182-f、hsa-mir-3675-5p-f、mir-4433b-5p-f、mir-126-f；所述反向引物包括mir-125a-5p-r、hsa-mir-3182-r、hsa-mir-3675-5p-r、mir-4433b-5p-r、mir-126-r。
34.实施例3川崎病的检测方法（1）血小板mirna的提取方法：采用提取试剂盒对血小板mirna进行提取，提取试剂盒为life品牌的mirvanamirnaisolationkit（货号：am1561）。具体步骤如下：1）从-80℃冰箱中取出需抽提的血小板样本，使用移液枪缓慢吸取细胞悬浮于冷的pbs溶液，然后置于冰上。
35.2）向离心管中加入300ullysis/bindingbuffer，涡旋30s，至无沉淀，瞬时离心。
36.3）向离心管中加入30ulmirnahomogenateadditive，涡旋混匀，瞬时离心，冰上孵育10min。
37.4）向离心管中加入300ul酸酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1），涡旋混匀。
38.5）在4℃，10000
×
g离心5min。
39.6）取上清，转移到一个新的1.5ml离心管中，加入375ul100%乙醇，颠倒混匀，瞬
时离心。
40.7）将溶液转移至离心柱中，在10000
×
g离心15s，将收集柱中的液体弃去。
41.8）向离心柱中加入700ul wash solution 1，在10000
×
g离心15s，将收集柱中的液体弃去。
42.9）向离心柱中加入500ul wash solution 2/3，在10000
×
g离心15s，将收集柱中的液体弃去。
43.10）在10000
×
g空转2min，室温晾干2min。
44.11）将收集柱转移至新的1.5ml 离心管中，向其中加入100ul 95℃ elution solution，孵育2min，在10000
×
g离心2min，得到血小板mirna。
45.（2）反转录：加入反转录引物（mir-125a-5p-sl、hsa-mir-3182-sl、hsa-mir-3675-5p-sl、mir-4433b-5p-sl和mir-126-sl）进行反转录，得到cdna；1）基因组dna去除：反应体系：5x gdna wiper mix：2μl；template rna：50ng；无酶无菌水（rnase-free water）：补足至10μl。
46.反应条件：42℃，2min；4℃，∞。
47.2）cdna合成反应体系：反转录引物（10μm）：1μl；上一步的混合液：10μl；无酶无菌水（rnase-free water）：5μl；10x rt mix：2μl；hiscript
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enzyme mix：2μl；反应条件：25℃，5min；50℃，15min；85℃，5min；4℃，∞。得到反转录产物，即cdna。
48.（3）扩增反应：以cdna为模板，使用正向引物和反向引物进行pcr扩增反应，扩增反应的同时加入探针序列。
49.扩增反应体系如下：premix ex taq（probe qpcr）（2x）：10μl；引物：f/r各0.4μl；探针：0.8μl；cdna：1μl；ddh2o：补足至20μl；扩增反应条件如下：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s，40个循环。
50.（4）结果分析：对扩增产物进行rt-qpcr分析，判断目的基因和内参基因的mirna的荧光定量反应ct值，计算核酸标志物的表达量r，目的基因的ct值与内参基因的ct值的比值。
51.核酸标志物的表达量r满足以下至少三种时，即可判断为川崎病阳性；核酸标志物的表达量r满足以下两种时，判断为不确定，需要一定周期后复测；核酸标志物的表达量r满足以下少于两种时，判断为阴性；目标基因为mir-125a-5p时，r125a≤1.2；目标基因为hsa-mir-3182时，r3182《1；目标基因为hsa-mir-3675-5p时，r3675《1.3；目标基因为mir-4433b-5p时，r4433b≤1。
52.实施例4特异性试验本试验取6例正常人样本和17例川崎患者样本。将川崎病患者和健康人的血小板按照实施例3中的提取方法进行提取，构建mirna文库，进行二代测序，进行生物信息学分析。经测序结果分析可知，mir-125a-5p、hsa-mir-3182、hsa-mir-3675-5p、mir-4433b-5p4个mirna在川崎病患者的血小板中的表达远高于健康人的血小板（表1），并得到正常人与川崎病患者核酸标志物r值（表2）；mir-126作为内参基因来说，在川崎病患者和健康人的血小板中稳定表达。
53.表1正常人与川崎病患者核酸标志物r的比较表2正常人与川崎病患者核酸标志物r值 医生诊断mir-125a-5p与内参物比值（r125a）mir-4433b-5p与内参物比值（r4433b）hsa-mir-3182与内参物比值（r3182）hsa-mir-3675-5p与内参物比值（r3675）病例1川崎阴性1.21221.32610.93061.2775病例2川崎阴性1.29690.92891.06631.3256病例3川崎阴性1.41921.01451.00621.3790病例4川崎阴性1.39100.88740.98071.3487病例5川崎阴性1.45180.92670.94071.3558病例6川崎阴性1.71040.99481.05971.2801病例7川崎阳性1.01390.95820.80331.1251病例8川崎阳性1.26920.80830.85420.6376病例9川崎阳性1.69960.97301.04030.6816病例10川崎阳性0.95730.93300.77271.0434病例11川崎阳性0.98320.93580.76821.0367
病例12川崎阳性1.02490.95430.78811.1045病例13川崎阳性0.95780.95121.14451.2076病例14川崎阳性0.92980.91691.07881.1656病例15川崎阳性1.33550.99320.97961.4960病例16川崎阳性1.29670.94990.96910.4306病例17川崎阳性1.30760.84650.90791.2913病例18川崎阳性1.38220.84400.77561.1684病例19川崎阳性1.39020.82270.88651.1466病例20川崎阳性1.03920.96911.10361.2097病例21川崎阳性1.01301.01351.22831.2757病例22川崎阳性0.91430.91031.07101.1583病例23川崎阳性1.42590.81800.82431.1314
表3正常人与川崎病患者判定结果 医生诊断mir-125a-5p与内参物比值（r）mir-4433b-5p与内参物比值（r）hsa-mir-3182与内参物比值（r）hsa-mir-3675-5p与内参物比值（r）试剂盒判断结果病例1川崎阴性阴性阴性阳性阳性不确定病例2川崎阴性阴性阳性阴性阴性阴性病例3川崎阴性阴性阴性阴性阴性阴性病例4川崎阴性阴性阳性阳性阴性不确定病例5川崎阴性阴性阳性阳性阴性不确定病例6川崎阴性阴性阳性阴性阳性不确定病例7川崎阳性阳性阳性阳性阳性阳性病例8川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性病例9川崎阳性阴性阳性阴性阳性不确定病例10川崎阳性阳性阳性阳性阳性阳性
病例11川崎阳性阳性阳性阳性阳性阳性病例12川崎阳性阳性阳性阳性阳性阳性病例13川崎阳性阳性阳性阴性阳性阳性病例14川崎阳性阳性阳性阴性阳性阳性病例15川崎阳性阴性阳性阳性阴性不确定病例16川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性病例17川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性病例18川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性病例19川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性病例20川崎阳性阳性阳性阴性阳性阳性病例21川崎阳性阳性阴性阴性阳性不确定病例22川崎阳性阳性阳性阴性阳性阳性病例23川崎阳性阴性阳性阳性阳性阳性
23例roc曲线分析结果：分别以m125a，m4433b，m3182，m3675核酸标志物作为判定标准，并统计真阳性，假阳性，真阴性，和假阴性得到灵敏度和特异性。结果如表4所示。在其roc曲线（图1-5）中，roc曲线下的面积分别为0.8137，0.6764，0.6274，0.9215，0.9411，预示着良好的判定结果。roc曲线为受试者工作特征曲线，纵坐标（灵敏度）是真阳性率，横坐标（1-特异度）是假阳性率。roc曲线的auc值表示曲线下面积，一般在0.5-1之间，值越大代表曲线的分类效果越好。四种rna联合分析的auc(曲线下面积）为0.9411，表示对健康人和川崎病人的良好分类效果。四种核酸标志物联合分析中，当有三个及以上核酸标志物的r值符合判定标准，该样本会被
极大可能地认为是川崎病阳性。结果显示，四种核酸标志物检验的灵敏度，特异度和准确度为100.00%，66.67%和86.96%，说明检测方法具有良好的检测能力。
54.表4 核酸标志物灵敏度和特异度核酸标志物m125am4433bm3182m3675四种标志物联合分析灵敏度100.00%80.00%82.35%90.00%100.00%特异度42.86%66.67%25.00%44.44%66.67%准确度65.22%78.26%73.91%95.65%86.96%与现有技术相比，血小板相较于血小板外泌体更易于获得，且血小板含量高。通过收集血液中的血小板来提取血小板mirna，将mirna进行反转录，通过rt-qpcr检测目的基因和内参基因的ct值，通过计算来获得相应结果。本发明方法能及时、精准地将川崎病患儿与其他发热性疾病（如麻疹、热疹、肠胃炎、手足口病、疱疹等）患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。
55.本发明采集的是血小板中的mirna，血小板相较于外泌体而言更易获得，且含量丰富，提取方法简单。本发明设置了特异性的mirna内参基因，方法更为合理。本发明选取的4种mirna来自于第二代高深度测序的结果，并结合临床信息综合分析评分所得，联合分析4种mirna，准确度远远大于单一生物标准物的检测，降低假阳性的发生。更易区分川崎病与普通发热等情况。本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。