一种太平洋芽孢杆菌及其降解污废水中硫化物的应用的制作方法

1.本发明涉及一种太平洋芽孢杆菌，具体涉及一种能够降解污废水中硫化物的太平洋芽孢杆菌、发酵方法及包含其的微生物菌剂，属于环境微生物技术领域。


背景技术：

2.随着我国化工、煤矿、食品加工、石油精炼和造纸等行业的迅速发展，在生产过程中产生的越来越多的硫化物被溶解在废水中进行排放，这些高浓度且难以降解的含硫有机废水的处理成为了这些行业需要处理的一大新难题。这类废水中含硫化合物的浓度高，毒性大，对环境污染严重，导致自然灾害的产生，甚至会对人体健康产生危害，例如酸雨。我国酸雨的主要类型是硫酸性酸雨，其成因是源于人工排放大量的含硫化合物，与雨水结合形成酸性降水。这些酸性降水滴落到地面，造成土壤酸化，改变土壤结构，使得土壤中的营养大量流失，从而导致土壤贫瘠化，影响植物的生长发育；还可能造成虫害爆发，影响农作物产量，导致食物供给不足；除此之外，对于人体健康也有直接和潜在的危害，例如呼吸道疾病的发病率的增加。因此排放的硫化物变成我国灾难性生态破坏的主要污染源之一。
3.目前行业内对于此类废水的处理方法普遍存在“实用性处理技术缺乏，工艺复杂，工程投资大，运行成本高”等问题，含硫化合物难以被有效去除，废水排放达标困难。目前常见的化学除硫法成本高，且化学药剂的投放不利于环保，因此生物脱硫逐渐成为处理含硫废水的主要研究方向。
4.与其他的硫化物处理方法相比，生物脱硫具有成本低，耗能少，不产生二次污染等众多优点，利用微生物自身的代谢机制将废水中游离的硫离子转化为不溶于水且可以被沉降的硫单质进行废水的除硫，避免了对环境进行二次污染。
5.通过从污水中分离出具有较强硫离子氧化功能的硫氧化菌，深入研究其生长特性和最适发酵条件，以及其在污水脱硫中的应用，充分发挥该菌株的脱硫能力，对污水治理及环境保护具有重要的实际意义。


技术实现要素：

6.本发明针对化学法脱除废水中的硫化物所存在的不足，提供一种能够将废水中的硫化物氧化为硫单质沉降下来从而完成脱硫的太平洋芽孢杆菌、发酵方法、包含其的微生物菌剂及其在污废水处理中的应用。
7.一种降解污废水中硫化物的太平洋芽孢杆菌(bacillus pacificus)sob-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所，保藏号为cgmcc no.22084，保藏日期为：2021年3月29日，其16s rdna序列如seq id no:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的太平洋芽孢杆菌即是指sob-8菌株。
8.本发明还要求保护包含上述太平洋芽孢杆菌的微生物菌剂。
9.本发明提供的太平洋芽孢杆菌的有益效果如下：
10.1)能够高效降解污废水中存在的硫化物，经实验证实，在施加量为100ppm、温度为30℃条件下，针对68-265mg/l的硫化物底物浓度，72h的降解效率均为100％；
11.2)耐盐，经实验证实，该菌株中度耐盐，在5％以下的盐度条件下均能生长，但最适宜生长繁殖的盐度为4％以下；
12.3)包含该太平洋芽孢杆菌的微生物菌剂易生产，成本低，产量高，适合在市面上推广。
13.本发明所述太平洋芽孢杆菌的发酵方法包括如下步骤：
14.(1)一级种子培养：无菌条件下取太平洋芽孢杆菌接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；
15.(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；
16.(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)和转速150-300rpm的条件下发酵，发酵过程中调节ph为6-7.5，待溶氧开始上升时停止发酵，得太平洋芽孢杆菌的发酵液。
17.优选的，所述富集培养基的组成为：氯化钠5g/l，牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8；
18.优选的，所述发酵培养基的组成为：碳源30-50g/l、氮源15-30g/l、po
43-0.5-0.8g/l、mg
2+
0.01-0.03g/l、mn
2+
0.05-0.10g/l、ca
2+
0.1-0.3g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8。
19.进一步优选的，所述碳源选自葡萄糖或蔗糖中的一种或二者的复配，所述氮源选自酵母浸粉或蛋白胨中的一种或二者的复配。
20.所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
21.优选的，所述po
43-的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的一种或二者的复配，所述mg
2+
的来源为硫酸镁、氯化镁、硝酸镁中的一种或多种，所述mn
2+
的来源为一水硫酸锰、硝酸锰、氯化锰中的一种或多种，所述ca
2+
的来源为氯化钙、硝酸钙、磷酸氢钙中的一种或多种。
22.在实际应用过程中，可根据实际的使用和存储需要来确定产品的形态，当需要使用液态产品时，将发酵液稀释至所需要的浓度即可直接使用，当需要使用固态产品时，可将发酵液离心后获得菌泥，然后采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺制得固态菌粉。
23.本发明还要求保护使用上述太平洋芽孢杆菌的活化液或包含太平洋芽孢杆菌的微生物菌剂净化污废水的方法，包含向污水或废水中施加上述太平洋芽孢杆菌的活化液或包含该太平洋芽孢杆菌的微生物菌剂的步骤。
24.优选的，太平洋芽孢杆菌的活化液和微生物菌剂的施加量为100ppm以上，更优选100-5000ppm，进一步优选200-2000ppm，最优选500-1000ppm。
25.优选的，净化过程中控制温度为10-45℃，优选25-35℃。
26.优选的，污水或废水中硫化物的浓度为1000ppm以下，更优选500ppm以下，最优选300ppm以下。
27.优选的，硫化物为h2s、hs-和s
2-。
28.本发明还要求保护上述的太平洋芽孢杆菌和包含该太平洋芽孢杆菌的微生物菌剂在污废水净化领域的应用。
29.优选的，用于降解污废水中的硫化物。
30.更优选的，用于降解污废水中的h2s、hs-和s
2-。
具体实施方式
31.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
32.实施例1：菌株的筛选与分离
33.1.富集培养：
34.采集某地生物反应器内的污泥及泥悬液，取泥水混合液10ml接种至含有100ml富集液体培养基(氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min)的250ml顶空瓶中，在30℃、200r/min的恒温摇床上振荡培养一个星期，得富集液。
35.2.初筛：
36.配制无菌水，取富集液逐级稀释至10-3
，10-4
，10-5
和10-6
倍，后将各稀释液涂布于sob固体选择培养基(kh2po
4 1g，nh4cl 0.8g，mgcl2·
6h2o 0.8g，cacl2·
2h2o 0.01g，fecl3·
6h2o 0.01g，mncl2·
4h2o 0.04g，na2s
·
9h2o 1.2g，牛肉膏2g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min)上，将涂布后的平板放置于30℃的恒温培养箱中培养至长出单菌落，挑取形态相异的单菌落转接至试管斜面培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
37.按照上述方法共分离得到九株菌株，分别命名为sob1、sob2、sob3、sob4、sob5、sob6、sob7、sob8和sob9。
38.3.复筛：
39.将得到的九株菌株分别接种至活化液体培养基中(氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0)，在摇床200r/min，30℃的条件下培养48小时得活化液，后准备盛有100ml液体选择培养基(kh2po
4 1g，nh4cl 0.8g，mgcl2·
6h2o 0.8g，cacl2·
2h2o 0.01g，fecl3·
6h2o 0.01g，mncl2·
4h2o0.04g，na2s
·
9h2o 1.2g，牛肉膏2g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min)的顶空瓶(250ml)，将各菌株的活化液分别接种至顶空瓶中，菌液接种量为100ppm，在摇床200r/min、30℃的条件下培养，使用北京连华永兴科技发展有限公司生产的lh-s3h型硫化物测定仪配合专用测量试剂测量0、24、48、72、96和120小时后硫化物含量的变化，结果如表1所示。
40.表1筛选所得的各菌株对选择培养基中硫化物的去除率
[0041] sob1sob2sob3sob4sob5sob6sob7sob8sob924h0％10.1％0％0％30％0％12％50％0％48h0％11.2％0％0％37.2％1％19.3％89％0％72h0％12％0％1％41.1％1.3％24.8％100％0％96h0％12.6％0％4％48％1.3％25.1％100％3％120h0％13％0％5.3％53.6％0.7％26％100％3.2％
[0042]
由表1中的数据可以看出，sob8菌株与其他菌株相比，针对硫化物的去除起效快、效果好，评价培养基中约160ppm的硫化物浓度，72h即可完全去除，重新接种该菌株至营养培养基中制作活化液，后进行甘油管-80℃保藏。
[0043]
实施例2.sob8菌株的鉴定：
[0044]
1、实验方法
[0045]
1.1细菌基因组dna的提取
[0046]
(1)用2ml离心管收集1.0
×
109(1ml菌液od
600
为1-1.5)的细菌培养物，12,000
×
g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入rnase a的buffer s悬浮沉淀。
[0047]
(2)加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。
[0048]
(3)加入30μl 0.25mol/l edta(ph 8.0)，混合均匀，冰浴5min。
[0049]
(4)加入450μl buffer g-a，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
[0050]
(5)加入400μl buffer g-b和1ml buffer dv(4℃预冷)，用力混合，12,000
×
g离心2min。
[0051]
(6)尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷buffer dv，用力混合，12,000
×
g离心2min。
[0052]
(7)丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)，12,000
×
g离心1min。
[0053]
(8)弃滤器，在滤液中加入400μl buffer bv，混合均匀。
[0054]
(9)将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000
×
g离心1min。
[0055]
(10)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl buffer w1，12,000
×
g离心1min。
[0056]
(11)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min。
[0057]
(12)以同样的方法再用700μl buffer w2洗涤一次。
[0058]
(13)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000
×
g离心1min。
[0059]
(14)将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μl eluent或去离子水，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱dna。
[0060]
2、细菌基因组pcr扩增
[0061]
表2 pcr扩增引物设计
[0062]
引物名称序列27f5-agagtttgatcctggctcag-31492r5-ctacggctaccttgttacga-3
[0063]
pcr扩增反应体系
[0064]
在0.2ml离心管中加入以下成分：
[0065]
表3 pcr扩增反应体系
[0066]
试剂体积基因组dna(20ng/μl)1.0μl10
×
buffer(含2.5mmol/l mg
2+
)5.0μltaq聚合酶(5u/μl)1.0μldntp(10mm)1.0μl27f引物(10um)1.5μl1492r引物(10um)1.5μl
ddh2o39.0μl总体积50.0μl
[0067]
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在pcr扩增仪上进行pcr反应，反应参数如表4所示：
[0068]
表4 pcr扩增反应程序
[0069]
预变性变性退火延伸终延伸循环数95℃，5min95℃，30s58℃，30s72℃，1min30s72℃，7min35
[0070]
反应完成后，取3μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认pcr扩增片段。
[0071]
3、pcr产物的回收
[0072]
pcr产物用axyprep dna凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
[0073]
(1)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量。
[0074]
(2)加入3个凝胶体积的buffer de-a，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化。
[0075]
(3)加0.5个buffer de-a体积的buffer de-b，混合均匀；当分离的dna片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
[0076]
(4)将混合液转移到dna制备管12,000
×
g离心1min，弃滤液。
[0077]
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl buffer w1，12,000
×
g离心30s，弃滤液。
[0078]
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12,000
×
g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min。
[0079]
(7)将制备管置回2ml离心管中，12,000
×
g离心1min。
[0080]
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱dna。
[0081]
4、序列测定与分析
[0082]
取各个菌种纯化后的pcr产物，使用测序仪abi3730-xl进行dna测序，菌株sob8的16s rdna基因序列测定结果如seq id no:1所示。
[0083]
5、序列分析
[0084]
将测序得到的序列在ncbi(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果，鉴定结果为太平洋芽孢杆菌bacillus pacificus。
[0085]
实施例3：太平洋芽孢杆菌的耐受度及生长条件探究
[0086]
1、菌株生长最佳碳源的确定
[0087]
实验方法：以lb培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，无菌水1l，121℃灭菌20min)作为基础培养基，额外向100ml的基础培养基中加入葡萄糖2.5g、蔗糖2.38g和乙酸钠3.33g作为碳源，另设立一组在纯lb培养基中培养的实验组作为对照，分别接种sob8菌株后均在摇床30℃，180r/min的条件下培养，定期测定其od
600
(od
600
表示溶液在600nm波长处的吸光值，用该值来测量细菌培养液的浓度，通常用来指菌体细胞密度，细菌的生长情况可通过od
600
的值来监测)值和活菌数确定菌种的生长程度，结果如表5所示。
[0088]
表5 sob8菌株在不同碳源的培养基中培养的od
600
值和活菌数
[0089][0090]
由表5中的数据可知，sob8菌株在培养基中的碳源为蔗糖时生长程度最佳，因此确定蔗糖为太平洋芽孢杆菌的最优碳源。
[0091]
2、菌株生长最佳氮源的确定
[0092]
实验方法：以lb培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，无菌水1l，121℃灭菌20min)作为基础培养基，额外向100ml的基础培养基中加入酵母浸粉11.1g、蛋白胨7.69g和尿素2.13g作为氮源，另设立一组在纯lb培养基中培养的实验组作为对照，分别接种sob8菌株后在摇床30℃，180r/min的条件下培养，定期测定其od
600
值和活菌数确定菌种的生长程度，结果如表6所示。
[0093]
表6 sob8菌株在不同氮源的培养基中培养的od
600
值和活菌数
[0094][0095]
由表6中的数据可知，sob8菌株在培养基中的氮源为酵母浸粉时生长程度最佳，因此确定酵母浸粉为太平洋芽孢杆菌的最优氮源。
[0096]
3、菌株生长最佳碳氮比的确定
[0097]
实验方法：以lb培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，无菌水1l，121℃灭菌20min)作为基础培养基，使用蔗糖为碳源，酵母浸粉为氮源，向100ml的基础培养基中额外加酵母浸粉1.23g，分别加蔗糖0.45、0.57和0.68g，进而获得c:n＝8:1、c:n＝10:1、c:n＝12:1的三组实验培养基来确定最佳碳氮比，另设立一组未额外添加碳源和氮源的lb培养基作为空白对照，分别接种sob8菌株后在摇床30℃，180r/min的条件下培养，定期测定其od
600
值和活菌数确定菌种的生长程度。
[0098]
表7 sob8菌株在不同碳氮比的培养基中培养的od
600
值和活菌数
[0099][0100]
由表7中的数据可见，菌株sob8在培养基的碳氮比为10:1时菌种的生长程度最佳，因此碳氮比10:1是该菌株的最适生长碳氮比。
[0101]
4、菌株生长最佳盐度的确定
[0102]
实验方法：以lb培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，无菌水1l，121℃灭菌20min)作为基础培养基，设立一组未额外增加盐度的实验组作为空白对照，其余实验组在lb培养基的基础上向100ml培养基中额外添加nacl 1g，2g，3g，4g，5g，6g，7g，8g，9g后设置为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的盐度梯度，分别接种sob8菌株后在摇床30℃，180r/min的条件下培养，定期测定其od
600
值和活菌数确定菌种的生长程度。
[0103]
表8 sob8菌株在不同盐度的培养基中培养后的od
600
值及活菌数
[0104][0105]
由表8可见，菌株sob8中度耐盐，在5％以下盐度时均可生长，但在培养基盐度为4％以下时生长状况最优。
[0106]
实施例4：太平洋芽孢杆菌的生产及后处理工艺
[0107]
1、菌株发酵
[0108]
1)一级摇瓶活化
[0109]
无菌环境中，挑取1环太平洋芽孢杆菌sob8菌种接入装有100ml富集培养基(氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min)的250ml三角瓶中，置于30℃、180r/min条件下培养24h，得到一级活化液。
[0110]
2)二级摇瓶培养
[0111]
无菌环境中，将一级活化液分别转接10ml至四个装有500ml富集培养基(氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min)的1l三角瓶中，置于30℃、180r/min条件下培养24h，得到二级活化液。
[0112]
3)1t罐发酵培养
[0113]
将发酵培养基置于121℃下灭菌20min，发酵培养基的配方为：蔗糖40g/l，酵母浸粉20g/l，mgso
4 0.1g/l，mnso
4 0.2g/l，cacl
2 0.57g/l，k2hpo
4 1.2g/l，将二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐装量70％，初始调ph＝7.0，于通气比1:1.25(m3·
min/m3)、180rpm、30℃下发酵培养，发酵过程中通过补加氨水控制ph＝6.5，发酵周期约24h，溶氧开始回升时，立即停止发酵，此时发酵处于对数期末期，活菌数高达300亿cfu/ml，菌体活力最强，发酵营养物质残余最少，存放活菌数衰减较少。
[0114]
2、发酵液的后处理工艺
[0115]
为制得菌粉，可对发酵液采用喷雾干燥和冷冻干燥两种后处理工艺进行处理，比较两种工艺处理后的菌量，喷雾干燥处理后的活菌量依然可以保持在300多亿，且喷雾干燥相比冷冻干燥的工艺成本更低，活菌量保持更好，从而优选后处理工艺为喷雾干燥处理。
[0116]
实施例5：太平洋芽孢杆菌在含硫模拟废水培养基中的应用评价
[0117]
将纯化好的sob8菌株接种到营养液体培养基(氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph＝7.0)中，放在30℃、180r/min摇床上培养2d后制成菌悬液，后将制好的菌悬液施加到装有废水培养基的250ml顶空瓶中进行实验，废水中含有不同浓度的硫化物。
[0118]
实验安排如下：
[0119]
实验组：接种100ppm的菌悬液至含不同浓度硫化物的模拟废水培养基(ch3coona 0.3875g，nano
2 1.0g，nh4cl 1.2g，kh2po
4 2.0g，k2hpo
4 2.0g,，mgso4·
7h2o 0.2g，na2s
·
9h2o若干，纯水1l，灭菌121℃20分钟)中。每个实验组设置三个平行，各实验组废水培养基中的na2s
·
9h2o质量和硫化物浓度的对应关系如表10所示。
[0120]
表10各实验组模拟废水培养基中的硫化物质量和浓度对应关系
[0121] 实验组1实验组2实验组3na2s
·
9h2o(g)12.343.84硫化物浓度68mg/l156mg/l265mg/l
[0122]
以向各实验组的废水培养基中接入100pm的无菌水作为空白对照，将各个对照组和实验组同时放入摇床，于180r/min、30℃的条件下进行培养，使用北京连华永兴科技发展有限公司生产的lh-s3h型硫化物测定仪配合专用测量试剂测量其0h,24h,48h,72h的硫化物浓度，计算硫化物的去除率，取各实验组平行的平均值。
[0123]
硫化物去除率％＝(0小时硫化物浓度-x小时硫化物浓度)/0小时硫化物浓度
×
100％
[0124]
表11 sob8菌株对模拟废水培养基的硫化物去除率
[0125]
测量时间对照组1实验组1对照组2实验组2对照组3实验组3
24h3.2％67.9％2％70.5％3.3％59.2％48h8.1％100％5.2％100％6.1％79.6％72h9.9％100％7.3％100％6.7％100％
[0126]
由表11可见，sob8菌株对于模拟废水培养基内硫化物的去除效果显著，在含不同浓度硫化物的废水中均表现出强大的除硫效果，72小时的除硫率可达99％以上。
[0127]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。