一种负载人重组骨形态发生蛋白rhBMP-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的制作方法

一种负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵
技术领域
1.本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本技术提供了一种负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵。


背景技术：

2.骨科疾患的治疗通常需要骨移植，作为新骨生长的桥梁，如骨肿瘤、骨不连、颈椎间盘突出、脊柱骨质疏松性骨折、以及众多需要融合手术的脊柱疾患。我国每年有数以万计的病人因创伤、感染、肿瘤等病变引起骨缺损，另有数十万病人行脊柱融合手术，两者均需要骨移植治疗。骨移植存在新增手术创伤、来源受限制、免疫排斥反应、疾病传播和费用昂贵等诸多问题。随着材料科学的发展，以生物材料替代移植骨成为新的发展趋势。理想的骨修复材料不仅要能够主动诱导新骨形成，快速修复骨缺损，还必须有很好的生物相容性和可降解性能，并且必须是安全无毒的。
3.骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2、bmp2)是促进骨生成的关键因子，属于tgf-α家族成员，bmp2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用。在肢体生长、软骨内骨化、骨折时表达,在骨骼生长发育和再生修复起重要作用，在临床治疗骨伤中具有良好的应用前景。另外由于普通载rhbmp-2的骨修复材料，在产品使用前期往往会集中释放rhbmp-2，不能控制rhbmp-2持续地、微量的释放，导致一段时间内局部组织的rhbmp2含量富集，随血流或组织液流向待修复的组织区域以外的其他组织，可能导致不必要的异位成骨。此外，rhbmp2在体内的半衰期短，局部使用很快就被代谢和吸收，很难发挥作用，即使大剂量持续给药也往往不能提供给靶部位持续有效的浓度，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。以上原因提示如何控制其持续、稳定、缓慢地释放，既达到有效促骨生长的作用同时又可以避免和防止不良反应的产生是用好rhbmp2的一项关键技术。
4.蚕丝作为一种来源充足、成本低、具有强大骨修复潜力的生物材料，也成为近年来关注的焦点。蚕丝主要含丝素蛋白，具备良好的生物相容性和骨诱导性。蚕丝由丝素蛋白和包裹其外的丝胶蛋白两种成分组成。丝胶蛋白是一种亲水性粘性蛋白，约占蚕丝总重量的25％～30％。丝胶蛋白是一种大分子蛋白，由18个氨基酸组成，分子量范围从10kdd～300kdd不等。丝素蛋白与丝胶蛋白一样，也是一种大分子蛋白，由9种氨基酸组成。在丝素蛋白的一级结构中侧链氨基酸组成的疏水结构占主导地位，由β-折叠组成，这种结构使得丝素蛋白有很高的机械强度、柔韧性和弹性。研究发现，丝素蛋白在体内和体外实验中均表现出良好的生物相容性。同时还具备良好的生物相容性、生物降解性以及将炎症反应降到最低。因此，丝素蛋白是一种很好的组织工程支架，尤其是作为骨修改材料，特别是作为骨形态发生蛋白-2(bmp2)的优良载体。在丝素蛋白交联成海绵的过程中却存在交联效率不高以及成海绵后的机械应力不足的问题，而且当初的丝素蛋白支架加载bmp2后，体外释放过快，
对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。
5.壳聚糖能够为组织生长提供非蛋白质基质并激活巨噬细胞的杀伤活性，并且能够刺激细胞增殖和组织结构形成，而且具备良好的生物相容性、生物降解性等。壳聚糖很容易被制备成水凝胶和海绵等药物载体，且可以延缓bmp2的释放，起到缓释作用，但是作为骨修改材料使用的壳聚糖海绵存在机械应力不足的问题，且容易对人体造成弱过敏反应。
6.目前负载rhbmp-2的骨修复海绵一般都是采用明胶或胶原海绵，但是都存在机械应力不足、bmp2容易失活以及bmp2在海绵中分布不均匀的问题。


技术实现要素：

7.发明人将壳聚糖和丝素蛋白复合成海绵，并在复合海绵的过程中将rhbmp-2加入，使得rhbmp-2在成型后的海绵内均匀分布，并通过壳聚糖改性降低壳聚糖的过敏反应。加入特定比例的交联剂使壳聚糖和丝素蛋白交联反应并冻干获得机械应力强和支撑性好的的复合海绵。
8.为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵，由包括人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2、丝素蛋白、壳聚糖、交联剂、以及其他辅料制备得到，其中丝素蛋白和壳聚糖的重量百分比为2：1。
10.进一步的，所述的交联剂是京尼平、戊二醛、辣根氧化物酶中的一种或多种混合。
11.进一步的，所述的交联剂是京尼平和辣根氧化物酶按2：1混合。
12.进一步的，所述的其他辅料包括tris缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白。
13.进一步的，所述的负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵，按重量百分比计包括骨形态发生蛋白rhbmp-2冻干粉0.1％～1％、tris缓冲液0.5％～1.5％、海藻糖1％～2％、牛血清白蛋白0.5％～2％、交联剂0.5％～3％，丝素蛋白2％～10％、壳聚糖1％～5％，余量为水。
14.一种负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
15.(1)丝素蛋白溶液制备：将蚕丝浸入到0.5wt％的碳酸钠溶液，90～100℃静置30min，取出固形物用去离子水冲洗，真空干燥箱60℃烘干，得脱胶蚕丝；再将脱胶蚕丝溶解在溶比1：10的三元溶液中，搅拌，得到含有丝素蛋白的混合溶液，再将混合溶液装入透析袋，使用去离子水室温环境下进行透析，经过滤得4wt％丝素蛋白溶液，保存备用；
16.(2)改性壳聚糖制备：将壳聚糖溶于5％醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml 0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml 50％质量烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖；将烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖溶于1％醋酸溶液中制备得到2％的烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖溶液；
17.(3)在丝素蛋白溶液中加入京尼平搅拌均匀后，依次加入tris缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白，继续搅拌10min，室温条件下加入骨形态发生蛋白rhbmp-2冻干粉，搅拌均匀，静置30min获得半胶体状物质；
18.(4)将改性壳聚糖溶液添加到步骤(3)获得的半胶体状物质中，边搅拌边加入辣根氧化物酶，再磁力搅拌，1500rpm，30min；然后将获得的混合乳液倒入容器中，梯度冻干：-20℃静置12h，而后-80℃静置6h；最后置于真空冻干机中冻干48h，得负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵。
19.进一步的，步骤(1)中所述的三元溶液是氯化钙：乙醇：水按摩尔比1：2：8配置。
20.本发明一种负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵，将壳聚糖和丝素蛋白复合成海绵，并在复合海绵的过程中将rhbmp-2加入，使得rhbmp-2在成型后的海绵内均匀分布。在制备壳聚糖/丝素蛋白海绵过程中，利用京尼平和丝素蛋白进行初步交联，并在缓冲液的保护下加入rhbmp-2，并使rhbmp-2均匀分布，再加入改性壳聚糖和辣根氧化物酶，增加获得的海绵的机械应力，以及壳聚糖/丝素蛋白海绵作为rhbmp-2载体，实现降解和释药时间的巨大进步，同时采用的壳聚糖是烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖，降低了过敏性。
具体实施方式
21.实施例1：负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的制备
22.rhbmp-2由企业自行生产，具体生产过程参照申请人cn201910030649.0号中国专利申请中的生产方法(大肠杆菌中表达，离子交换层析纯化，检测大肠杆菌宿主残留蛋白《0.005％)，抑菌圈法检测抗生素残留《0.1ppm；
23.壳聚糖、蚕丝、京尼平、辣根氧化物酶、tris缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白等均为市售。
24.处方量，按重量百分比计：
25.丝素蛋白2％、改性壳聚糖1％、rhbmp-2冻干粉0.8％、tris缓冲液1.0％、海藻糖1.2％、牛血清白蛋白1％、京尼平1.5％、辣根氧化物酶0.75％，余量为水以及制备过程中用到的少量其他溶剂。
26.制备方法：
27.1、丝素蛋白溶液制备：
28.将蚕丝浸入到0.5wt％的碳酸钠溶液，90～100℃静置30min，取出固形物用去离子水冲洗，真空干燥箱60℃烘干，得脱胶蚕丝；再将脱胶蚕丝溶解在溶比1：10的三元溶液(氯化钙：乙醇：水按摩尔比1：2：8)配置中，搅拌，得到含有丝素蛋白的混合溶液，再将混合溶液装入透析袋，使用去离子水室温环境下进行透析，经过滤得4wt％丝素蛋白溶液，保存备用。
29.2、改性壳聚糖制备：将3g壳聚糖溶于250ml5％体积醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml 0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml 50％质量烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖；将烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖溶于1％醋酸溶液中制备得到2％的烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖溶液。
30.产物红外光谱检测显示1415cm-1(-nh)、1555cm-1(c＝o)的特征吸收峰，表明烯丙基三甲基氯化铵已枝接在壳聚糖上。
31.3、在丝素蛋白溶液中加入京尼平搅拌均匀后，依次加入tris缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白，继续搅拌10min，室温条件下加入骨形态发生蛋白rhbmp2冻干粉，搅拌均匀，静置
30min获得半胶体状物质；
32.4、将改性壳聚糖溶液添加到步骤(3)获得的半胶体状物质中，边搅拌边加入辣根氧化物酶，再磁力搅拌，1500rpm，30min；然后将获得的混合乳液倒入容器中，梯度冻干：-20℃静置12h，而后-80℃静置6h；最后置于真空冻干机中冻干48h，得负载人重组骨形态发生蛋白rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵。
33.密封后钴60照射灭菌保存。
34.实施例2：制备对照品载rhbmp-2海绵；
35.样品1：丝素蛋白1％、改性壳聚糖的量为2％，其他处方和制备方法和实施例1相同；
36.样品2：交联剂京尼平为2.25％，辣根氧化物酶0，其他处方和制备方法与实施例1相同；
37.样品3：交联剂京尼平为0，辣根氧化物酶2.25％，其他处方和制备方法与实施例1相同；
38.样品4：交联剂戊二醇取代京尼平，其他处方和制备方法与实施例1相同；
39.样品5：交联剂戊二醇取代辣根氧化物酶，其他处方和制备方法和实施例1相同。
40.发明人在研究壳聚糖和丝素蛋白复合海绵的时候，加入不同的交联剂及交联剂的组合，研究中发现，京尼平和辣根氧化物酶以2：1的量分别在制备过程的不同时间点加入，其成型的海绵在机械应力、载药的分布均匀性、释药时间以及海绵的降解时间最佳。
41.实施例3：负载rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的机械应力测试
42.通过力学拉伸机负载rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的应力应变性能。将海绵剪切成大小等同的海绵块(5mm
×
5mm
×
5mm)，分别在干燥和湿润两种状态下测定。样品两端用医用胶布围裹固定以免在夹具固定样品时损坏样品。样品固定，并用0.05g的力伸直样品，100n的传感器加力，干燥状态用5mm/min湿润状态以1mm/min的拉伸速度测试，其中湿润状态是测定前将样品放在pbs(ph7.2)溶液中(20℃)平衡30min。
43.表1：不同交联剂海绵的应力应变性能表
[0044][0045][0046]
抗张应力-应变测试比较不同组载荷、断裂强度、断裂应变和弹性模量的变化。经计算各组样品平均值如表所示，经spss11.5统计分析，海绵的状态(干燥和湿润)和不同交联剂对海绵机械强度的影响均有显著性差异(two-factor anova；p＜0.0001)。
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最大负荷：在干燥湿润两个状态下，最大载荷差异显著(p＜0.0001)。实施例1样品
使海绵承受最大载荷显著提高(p＜0.0001)，而在湿润状态下，其相应的最大载荷值大大降低，但是相对于其他对比样品，实施例1的壳聚糖/丝素蛋白海绵的最大负荷最佳。
[0048]
断裂应力：与干燥状态比较，在湿润状态下断裂应力显著降低(p＜0.0001)。与对照组样品相比，干燥状态下实施例1组的断裂强度显著增强(p＜0.0001)；湿润状态下各组断裂应力有所下降，且实施例1组稍高于其他样品组，但此差异无统计学意义。
[0049]
断裂应变：与干燥状态比较，在湿润状态下断裂应变显著提高。这说明壳聚糖/丝素蛋白海绵在湿润状态下能承受更大的形变而不发生断裂(p＜0.0001)。
[0050]
弹性模量：基质状态和不同组别弹性模量差异显著，实施例1组的弹性模量显著提高。
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实施例1所得壳聚糖/丝素蛋白海绵在干燥状态下的最大载荷、断裂应力和弹性模量均显著增强；而湿润状态下，实施例1组的最大载荷和断裂应力均高于其他样品组，这可能与交联处理时交联剂的选择和两种交联剂之间的重量比有关。
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实施例4：负载rhbmp-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的体外释放实验
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试验组：实施例1样品、样品1、样品2、样品3、样品4、样品5；
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对照组：杭州九源基因工程有限公司生产的rhbmp2骨修复材料，由rhbmp-2和载体材料组成，载体材料包括羟基磷灰石、大豆磷脂和药用明胶。
[0055]
方法：将试验组和对照组置于透析袋中，透析袋置于20ml含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液中。静置于37℃下，在12h、24h、120h、168h、336h、504h、672h、840h分别取样1ml(随后补充含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液1ml)，按照试剂盒的说明以elisa法测定rhbmp-2浓度，换算计算累计释放百分数。结果如下表所示。
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表2，rhbmp-2累计释放百分数
[0057][0058]
对照材料中的rhbmp-2在168h内基本释放完成，实施例1制备的负载bmp2的壳聚糖/丝素蛋白海绵的药物释放可以延长至5周左右，基本与骨修复中的生产初期相对应；样品1、样品2、样品3、样品4、样品5也基本能释放4～5周，但实施例1的药物释放更为平稳。