柑橘木虱胰岛素样多肽基因DcILP2在防治柑橘木虱中的用途的制作方法

柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在防治柑橘木虱中的用途
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，具体涉及柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在防治柑橘木虱中的用途。


背景技术：

2.柑橘木虱diaphorina citri(kuwayama)属同翅目(homoptera)扁木虱科(liviidae)，属于不完全变态昆虫，其生活史包括卵、一龄若虫、二龄若虫、三龄若虫、四龄若虫、五龄若虫、成虫7个阶段。柑橘木虱是柑橘类果树主要害虫，其若虫分泌的白色蜜露会引发煤污病，影响寄主植物的光合作用，其成虫若虫均可作为媒介携带柑橘黄龙病(hlb)的致病菌柑橘黄龙病菌candidatus liberibacter asiaticus(clas)，导致柑橘黄龙病(hlb)在柑橘植株间的广泛传播。黄龙病会导致植株生长受阻，果实质量下降，严重影响经济效益。目前国内外对柑橘木虱的防治方法主要有物理防治、生物防治和化学防治等，探究和运用分子生物学技术进行柑橘木虱防治具有重要意义。柑橘木虱雌性成虫在取食嫩梢后才可以持续进行产卵(没有嫩梢完全不产卵)，但嫩梢刺激雌性柑橘木虱生殖的分子机制仍不清楚。胰岛素信号系统能够感知营养状态，ilp(insulin like peptides)是胰岛素信号通路的上游因子，ilps能够与胰岛素受体(ir)结合，通过下游一系列级联反应，调节昆虫发育、寿命、新陈代谢、滞育和雌性生殖等各种生理过程，tor信号通路以被证明在触发柑橘木虱的产卵行为中起重要作用，其中20e、jh也参与其中，胰岛素信号通路在tor信号通路上游且能够起到对该通路的调节作用。研究胰岛素信号对研究木虱生殖能力具有重要作用，将来开发药剂针对该信号能抑制木虱产卵，对控制田间木虱种群具有重要作用。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是为控制柑橘木虱提供一种新选择。
4.本发明的技术方案是柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在防治柑橘木虱中的用途。
5.具体的，所述基因dcilp2的编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.14所示。
6.进一步的，所述基因dcilp2的核苷酸序列如seq id no.13所示。
7.seq id no.13基因dcilp2的核苷酸序列
8.atggttcacgttccgctgatgacatgcgtccttcttctagtagtcctgtcagtcactgcagacgacctatccagggacaaaattccggacagcattcgcgtctgttctggcgctctgtcatcagccttgtcgtggtggtgctcacgcgtatcggaaattaaaatgctcgattcgaataagataaagagaggttcaagtgcctgggacattgtgctggaagagcttacagctgcagggttgtcttacaccaccaatgaacccgaaggcgttatcaccatacagggtgcatcagacgagggcgatgagttcaacgatgttctacctgtttatgagacacccatgtacaatagattgcggcgtagtggtattgcctctgaatgttgcaagaaagcttgcacattgttcaccctgttgtcttattgtcctggaggtaggaaacaatga
9.seq id no.14基因dcilp2的编码蛋白的氨基酸序列
10.mvhvplmtcvlllvvlsvtaddlsrdkipdsirvcsgalssalswwcsrvseikmldsnkikrgssawd
ivleeltaaglsyttnepegvitiqgasdegdefndvlpvyetpmynrlrrsgiasecckkactlftllsycpggrkq
11.进一步的，所述用途为柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在调控柑橘木虱卵巢发育中的用途。
12.进一步的，所述用途为柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在调控tor通路和/或生殖过程中的用途。
13.具体的，所述用途为柑橘木虱胰岛素样多肽基因dcilp2在调控tor通路的关键基因dcrheb和/或下游生殖关键基因dcvg表达中的用途。
14.其中，所述的调控为正调控。
15.具体的，在所述用途中，用将基因dcilp2的dsrna干扰dcilp2的表达。
16.进一步的，所述dsrna干扰基因的靶区域核苷酸序列如seq id no.15所示。
17.具体的，将基因dcilp2的dsrna点滴柑橘木虱胸部腹面，干扰靶基因。
18.本发明的有益效果：本发明通过柑橘木虱的胰岛素样多肽基因的研究，确定了其在调控tor通路、柑橘木虱卵巢发育和生殖中的用途。本发明为防治柑橘木虱，进而减轻柑橘黄龙病的传播提供了一种新选择。
附图说明
19.图1、嫩梢和成熟叶片的照片；(a)出芽后一周内的嫩梢；(b)出芽后20天的成熟叶片。
20.图2、dmilp1-7、dcilp2氨基酸序列比对。dcilp2的开放阅读框为444bp，编码147个氨基酸，其蛋白前肽存在4个保守区域，即信号肽(sp)、b链、c肽和a链。预测dcilp2的sp区域位于从n端开始的氨基酸1-21处。sp后面是b链，b链上有两个由其他11个氨基酸隔开的保守的半胱氨酸(cys)，在这11个氨基酸的第4位是亮氨酸(leu)，这与d.melanogaster高度一致。c肽位于b链后，以kr、kk和rr为代表的双碱基蛋白裂解位点通常存在于起始和末端，在dcilp2中也发现了这些位点。在a链中，dcilp2有4个cys，第4个cys之前的氨基酸是tyr(tyr)，这是一个相当保守的基序，同样与d.melanogaster高度一致。
21.图3、脊椎动物和无脊椎动物胰岛素样肽的系统进化树。分析了16种物种的26个ilp氨基酸序列(表1)，这些物种包括脊椎动物和无脊椎动物。对于ilps，脊椎动物中的胰岛素信号配体可以分为胰岛素和胰岛素样生长因子(igf)，它们各自发挥不同的功能。昆虫体内通常存在多种类型的ilp，将家蚕定义为一个外群，比较了几种不同昆虫的ilps，结果表明，dcilp2与同为同翅目的nilaparvata lugens的ilp2具有很高的同源性，这为其功能研究提供了一些参考。
22.图4、dcilp2在取食嫩枝和成熟叶片后1、3、5、7天的表达情况。
23.图5、dsdcilp2(基因dcilp2的dsrna)处理后雌性柑橘木虱的繁殖力及相关基因表达情况；(a)dsdcilp2和dsegfp(基因egfp的dsrna)点滴处理后dcilp1的rnai效率(b)dsrna处理后雌性柑橘木虱的繁殖力统计。
24.图6、dsdcilp2和dsegfp处理后5天后柑橘木虱卵巢形态学的变化；(a)dsegfp处理后5天的卵巢形态；(b)注射dsdcilp2后5天的卵巢形态；(c)柑橘木虱卵巢结构示意图or:卵巢,ab:顶球,pd:茎,ld:侧输卵管,cd:总输卵管,tr:滋养体,vt:卵黄发生期卵母细胞,pv:
卵黄发生前期卵母细胞。
25.图7、dsdcilp2处理后dcrheb和dcvg的表达水平；(a)dsdcilp2处理后1、5天雌性柑橘木虱dcrheb表达情况；(b)dsdcilp2处理1、5后天雌性柑橘木虱dcvg表达情况。
具体实施方式
26.实施例1dcilp2的鉴定及系统发育树的构建
27.为便于描述，将awt50608.1命名为dcilp2，其核苷酸序列如seq id no.13所示。dmilps的前肽已被鉴定，使用clustalx多序列比对程序与dcilp2进行比对。利用16个物种的26个ilp氨基酸序列进行比对和系统发育树构建，物种的序列列于表1。系统发育树的构建采用megax软件，计算方法使用最大似然法(ml)，bootstrap值设为1000，dcilp2与同为同翅目的nilaparvata lugens的ilp2具有很高的同源性。
28.表1序列比对及构建进化树的序列
29.[0030][0031]
实施例2胰岛素关键基因dcilp2在柑橘木虱中的表达模式
[0032]
把柑橘木虱雌雄虫按1:2的比例配对，置于成熟叶片上(出芽后20天)7天，后将它们分别转移到嫩梢(出芽一周内)和成熟叶片上继续饲养(图1)。转移后的1、3、5和7天收集雌性柑橘木虱，并立即用液氮冻存。每个处理设3个重复，每个重复30只。使用trizol(thermo fisher)试剂(thermo fisher)提取总rna。总rna采用琼脂糖凝胶电泳和nano-drop(thermo fisher scientific inc.)提取总rna并进行完整性和定量分析。后根据primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)(takara)对上述rna样品进行反转录得到cdna。利用primer 5软件对dcilp2基因设计rt-qpcr特异性引物，以dcactin基因作为内参考基因(表2)。采用荧光染料tb green premixture ex taq ii(takara)检测dcilp2基因在不同时间点的柑橘木虱雌成虫体内的表达情况。
[0033]
表2所用引物表
[0034]
[0035][0036]
结果见图4，rt-qpcr结果显示，对于dcilp2，取食嫩稍和成熟叶片的两组取食后1、3、5、7天，两组dcilp2的表达水平均有显著差异。在1、3、5、7d时，嫩枝摄食组的表达量分别是成熟叶摄食组的1.56、2.50、3.04和1.91倍。
[0037]
实施例3 dsdcilp2对柑橘木虱产卵量和卵巢形态的rna干扰效应
[0038]
使用primer 5软件设计dcilp2的dsrna特异性引物(表2)，以柑橘木虱cdna为模板，对照组以增强型绿色荧光蛋白(egfp)质粒为模板。pcr条件：94℃3min，40个循环98℃10s，55℃30s，72℃1min，最后72℃10min。pcr产物用北京天根dna纯化试剂盒纯化。dsrna通过hiscribe
tm
t7(new england biolabs inc.，ipswich,ma,usa)在体外转录试剂盒中合成。
[0039]
以柑橘木虱雌雄虫按1:2的雌雄比例进行配对，将其放置于成熟叶片上7天，然后收集雌性柑橘木虱进行dsrna点滴处理。dsrna由rnase-free水稀释至浓度800ng/μl，将交配后的雌虫冰上放置三分钟使其失去行动力，然后使用10μl汉密尔顿注射器将1μl dsrna液滴局部滴在三对腿之间的胸腹侧，对照则用dsegfp处理。处理后的雌性柑橘木虱被移到嫩梢上并用白色尼龙网袋将每组雌虫单独分开，于第1天和第5天收集雌虫，分别设置5个生物重复，每个重复30头。提取所有样品的总rna，反转录为cdna，采用rt-qpcr检测rnai后dcilp2基因的沉默效率。
[0040]
seq id no.15基因dcilp2的dsrna干扰靶基因区域
[0041]
tgcgtccttcttctagtagtcctgtcagtcactgcagacgacctatccagggacaaaattccggacagcattcgcgtctgttctggcgctctgtcatcagccttgtcgtggtggtgctcacgcgtatcggaaattaaaatgctcgattcgaataagataaagagaggttcaagtgcctgggacattgtgctggaagagcttacagctgcagggttgtcttacaccaccaatgaacccgaagg
[0042]
注射dsdcilp2后的第1天和第5天，rt-qpcr结果显示，dcilp2的表达水平分别降低了3.89倍和1.88倍(图5a)。
[0043]
将dsrna用rnase-free water稀释至800ng/μl。将已交配的雌成虫短暂地放在冰上几分钟使其晕厥，然后用10μl的汉密尔顿注射器将1μl的dsrna液滴滴在三对足之间的胸腹侧，对照则用dsegfp处理。之后，如前所述，它们被移到嫩梢上，用白色尼龙网袋将每组雌虫单独分开，每隔3天移到新的叶片上继续产卵。统计产卵量时剪去已产卵的叶片，于显微镜下统计叶片上的产卵数。结果表明对照组注射dsegfp的雌虫产卵量为83.75
±
12.09粒/雌，而dcilp2的rnai能破坏昆虫的繁殖能力，每只雌性的产卵量分别为19.70
±
4.20粒/雌(图5b)。
[0044]
注射后第5天，随机选取15只雌性柑橘木虱，使用解剖缓冲液(100mm醋酸钠缓冲液，含有1mm ph值5.5的edta)进行生殖系统解剖，在显微镜下使用相机拍照。我们观察了不同处理后卵巢的发育情况，交配后的雌成虫被放在嫩稍上取食5天后，dsegfp处理的对照组卵巢发育完全，可见到卵黄发生期卵母细胞，这一阶段卵母细胞的明显特征是大而饱满(图6a)。对于dsdcilp2处理组，虽然没有卵黄发生期的卵母细胞，但存在卵黄发生前期的卵母
细胞(图6b)。由卵巢示意图，柑橘木虱的卵巢通过梗插入顶球，并通过外侧输卵管与总输卵管相连(图6c)。
[0045]
在注射后第1天和第5天，每个时间点采集5个生物重复，每个重复采集雌性柑橘木虱30头。提取所有样品的rna，反转录为cdna，以dcactin基因作为内参考基因，用rt-qpcr检测tor通路的关键基因dcrheb和dcvg在rnai后的表达水平。分析dcrheb和dcvg基因在注射dsrna后1天和5天的表达情况，这两个基因都显著下调。注射dsdcilp2后第1、5天dcrheb的表达水平分别下降到31.06％和55.54％(图7a)。注射dsdcilp2后第1天和第5天，dcvg的表达分别下降至4.95％和10.05％(图7b)。