一种酵母菌及其在茶树提质增效中的应用

1.本发明属于植物生产领域，涉及茶树的叶面喷施，特别是指一种酵母菌及其在茶树提质增效中的应用。


背景技术：

2.茶树，学名：camellia sinensis (l.) o. ktze.，是山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。茶树的叶子可制茶（有别于油茶树），种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。分布主要集中在南纬16度至北纬30度之间，茶树喜欢温暖湿润气候，平均气温10℃以上时芽开始萌动，生长最适温度为20～25℃;年降水量要在1000毫米以上；喜光耐阴，适于在漫射光下生育；一生分为幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。树龄可达一二百年，但经济年龄一般为40～50年。我国西南部是茶树的起源中心，世界上有60个国家引种了茶树。在热带地区也有乔木型茶树高达15-30米，基部树围1.5米以上，树龄可达数百年至上千年。
3.但是茶树种植过程中其茶叶的品质等参差不齐，差别较大，导致品质不够稳拟定，这是由于茶树生长的环境一般在山坡上，土壤贫瘠，保水性差，营养匮乏，影响产量和品质。本技术发明人致力于提高茶叶品质和产量的相关研究。


技术实现要素：

4.本发明提出一种酵母菌及其在茶树提质增效中的应用，解决了茶叶品质差、产量低的问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种酵母菌，所述酵母菌菌株分类名为hanseniaspora uvarum wyccw10240（葡萄汁有孢汉逊酵母wyccw10240），保藏号为cctcc no: m 20211275，保藏时间为2021年10月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
6.所述酵母菌作为茶树高效叶面提质增效高效菌剂。
7.所述的酵母菌的应用，步骤如下：（1）将酵母菌接种至yepd液体培养基中，28 ℃摇床振荡培养12小时，得酵母菌菌液；（2）将酵母菌菌液用盐水调节浓度至od600=0.5，然后装入喷雾装置中备用；（3）按照每亩茶园使用30公斤调好的菌液的量均匀喷洒茶树叶面；（4）按照以上三个步骤喷洒叶面后，等候5-10天进行茶叶样品采集和相关数据分析。
8.所述步骤（1）中酵母菌菌株的接种量为0.1亿个菌每平方米茶园。
9.所述步骤（2）中盐水的浓度为0.8-1.5%。
10.本发明具有以下有益效果：本发明公开了一株酵母菌菌株在茶树提质增效过程中，可以大大提高其产量及茶
叶茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量，从而提茶叶的质量和品质，增加经济效益，经过本技术酵母菌处理的茶叶组的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量相对于对照组分别提高了72.47%、88.31%、45.18%和82.67%，平均增产24.4%，可作为茶树高效叶面提质增效高效菌剂。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1为系统发育树。
13.图2为茶叶样品采集实物图。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.一种酵母菌，所述酵母菌菌株分类名为hanseniaspora uvarum wyccw10240，保藏号为cctcc no: m 20211275，保藏时间为2021年10月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
16.实验材料1 试验茶样试验茶样为绿茶，由福建春伦集团有限公司提供，茶树生长在福州市晋安区宦溪镇春伦生态茶园内，海拔550m，气候温暖湿润，雨量充沛，四季常青，品种为福云6号，采摘标准为一芽二叶至一芽三叶，等级为特级，经采青、杀青、揉捻、干燥的工艺流程制作而成。
17.仪器与试剂分光光度计（v-1100d型）、高效液相色谱仪、紫外检测器及色谱工作站、超声波提取器、电热恒温水浴锅（hws-26型）、电子天平（精确至0.001）、布氏漏斗连同减压抽滤装置、分析型纯水机、shb-iii循环水式多用真空泵、电热恒温鼓风干燥箱、粉碎机、高速离心机（3500 r/min）、分液漏斗、三角瓶、移液管（1 ml、2 ml、5 ml、10 ml）、容量瓶（25 ml、50 ml、250 ml、500 ml容量瓶）等。
18.甲醇试剂、10%福林酚试剂、7.5%碳酸钠（na2co3）溶液、没食子酸标准储备溶液（1 mg
·
ml-1
即1000 μg
·
ml-1
，现配）、没食子酸工作液、乙酸乙酯（a、r）、95%乙醇、正丁醇为分析纯，2.5%碳酸氢钠溶液、饱和草酸溶液，蒸馏水等。
19.酵母菌yepd固体培养基的公开配方：每1000 g培养基成分：酵母粉10 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，琼脂粉20 g，去离子水1000 ml，自然ph。
20.一、酵母菌菌株hanseniaspora uvarum wyccw10240的分离和筛选
于福建省福州市宦溪镇福建春伦集团有限公司恩顶生态茶园行间采集土壤样品，采用五点采样法，存入无菌密封袋，做好记录，立刻带回实验室。分别随机取10g土壤样品放入事先灭好菌的盛有90ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，放入摇床28℃、转速150 r/min条件下振荡混匀10分钟。然后，三角瓶静置10分钟，取上清液进行10倍梯度稀释（10-1
~10-9
），然后涂布在yepd培养基固体平板，每个梯度涂布200
µ
l，然后平板放入恒温培养箱中28℃倒置培养过夜，初步得到酵母菌菌源。
21.进一步划线分离出挑选出形态较好的菌落反复划线分离纯化，直到平板上无杂菌落出现。然后，将挑去纯化的单菌落在wl鉴别培养基平板上划线，获得单菌落，选择菌落形态一致且丰度最高的菌5株，保存斜面备用。挑取单菌落接至5 ml yepd液体试管里，28 ℃，180 rpm 摇床培养12 h，将菌液od600调至1.0，按1：100比例取0.5 ml接至50 ml yepd液体培养基里，28 ℃，180rpm摇床中培养12 h；然后按照操作步骤进行菌液稀释和喷施，并通过测定茶叶产量和相关品质指标等，筛选得到最优菌株wyccwf10240。经26s rrna测序和系统发育分析，被鉴定为菌株wyccw10240的26s rrna序列如seq id no.1所示；系统发育结果如图1所示，确定该菌株为有孢汉逊酵母属，命名为hanseniaspora uvarum wyccw10240。
22.应用例利用上述酵母菌喷施茶树的方法：（1）将酵母菌菌株按照10
0-109个菌的比例接种至yepd液体培养基中，28℃摇床振荡培养过夜，得酵母菌菌液；（2）用0.8-1.5 % wt的氯化钠溶液将酵母菌菌液调节浓度至od600=0.5，然后装入喷雾器中待用；（3）按照每亩茶园使用30-60公斤调好的菌液的量均匀喷洒茶树叶面；以不喷施酵母菌菌液而用等量去离子水喷施的茶树作空白对照；（4）等候8天进行茶叶样品采集实物图如图2所示，采集新发芽头，为一叶一芽，然后测定其重量和茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量等。
23.其中茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量的测定方法为：1 茶多酚含量测定运用gb/t 8313—2018《茶 叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》
1.对茶样中茶多酚的含量进行测定；利用若干10 mm 比色皿和分光光度计在765 nm波长下用测量吸光度值，最后根据相应公式得出结果，结果如表1所示。
24.茶氨酸的测定依据gb/t23193-2017 《茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法》对茶样中的茶氨酸含量进行测定，待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取10 pl茶氨酸标准使用液注射人hplc。在相同的色谱条件下注射10
ꢀµ
l测试液。测试液以峰面积定量。由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的茶氨酸的浓度。测试液中的茶氨酸的响应值均应在仪器测定的线性范围之内。茶叶样品中茶氨酸经沸水加热排取、净化处理后，采用分离强极性化合物的rp-18柱检测波长210 nm，用高效液相色谱仪进行测定，与标准系列比较定性、定量。最后根据相应公式得出结果，结果如表1所示。
25.咖啡碱的测定依据gb/t8312-2013 《茶 咖啡碱测定》 紫外分光光度法对茶样中的咖啡碱含量
进行测定，用10 mm石英比色杯，在波长274 nm处以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(a) ，结果如表1所示。
26.总黄酮的测定准确吸取总黄酮提取液（稀释适当倍数）2.0 ml于 10 ml具塞试管中，加入60%乙醇3.0 ml，然后按1、2、3、4的方法测定吸光度，试剂空白为参比（提取溶剂代替提取液)，将吸光度代入标准曲线计算样液的总黄酮含量，结果如表1所示。
27.数据统计分析法运用microsoft excel 2007软件和spss 25.0软件进行统计分析。按照以上实验方法，每组数据平行测定2次，计算相对标准偏差（rsd）。
28.表1：喷施酵母菌菌液组与对照组的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量统计由上可知，经过本技术酵母菌处理的茶树组的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮含量相对于对照组均有明显提高。
29.经酵母菌hanseniaspora uvarum wyccw10240处理的茶树芽重与对照组相比，得到1克绿茶所需芽数减少了24.4%，见表2：表2：得到1克绿茶所需芽数统计由表2可知，使用本技术的酵母菌hanseniaspora uvarum wyccw10240后，生产1克绿茶所需芽数减少了22个，增产效果显著。
30.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。