一种利用豆渣制酶增加刀豆氨酸提取率和降解残余刀豆氨酸的方法

1.本发明涉及刀豆氨酸提取方法，特别涉及一种利用豆渣制酶增加刀豆氨酸提取率和降解残余刀豆氨酸的方法。


背景技术：

2.豆类加工过程中会产生大量的豆渣、豆粕和其它加工剩余物。这些含有高膳食纤维和蛋白质等营养成份的物料，目前大部分只作为粗饲料等，附加值很低(尹乐斌，何平，刘桠丽，等.豆渣综合利用研究进展[j].粮食与油脂，2021，34(5)：14-16)，急需进行高附加值的利用。
[0003]
海刀豆(canavalia maritime)，又称水流豆，属于豆科(leguminosae)植物刀豆属(canavalia)，是红树林伴生植物，在中国沿海滩涂有广泛分布。含有刀豆氨酸、植物凝集素、蛋白质、氨基酸和碳水化合物等，其中的碳水化合物包含有单糖、寡糖、多糖和淀粉等，其中的刀豆氨酸是一种具有优良抗癌活性的功能化合物，提取过刀豆氨酸的剩余物希望降低剩余的刀豆氨酸量和抗营养因子凝集素等的含量。
[0004]
豆类中的植物凝集素对心血管平滑肌有显著的松弛作用；膳食纤维对改善肠道有益；其中的黄酮类如染料木素等对心血管有益，具有良好的溶血脂作用等(钟添华，张磊，马新华，等.海刀豆化学成分的分离鉴定和活性评价[j].中国海洋物，2016，35(03)：31-36.)。
[0005]
洋刀豆(canavalia ensiformis)，又名直立刀豆，英文名为jack bean，原产于墨西哥南部、秘鲁、巴西以及西印度群岛。其生物学特征为一年生直立草本，种株高不到1m，茎无毛，三出复叶，叶柄长8-12cm。小叶全缘，呈长方卵形至椭圆形，花总状花序腋生，花疏生，花梗短，蝶形，荚果大而扁，内含种子10～14粒不等，种子呈白色肾形，扁平而光滑，种脐约占种子全长的1/2.洋刀豆的营养成分比较齐全，含量也比较丰富。洋刀豆的蛋白质含量较高，一般为30％左右，其蛋白质中氨基酸种类齐全，除含硫氨基酸(蛋氨酸和胱氨酸)含量较低外，其余氨基酸的含量基本上与fao/who所推荐的一致，具有较高的营养价值。但是洋刀豆蛋白质中含有一些抗营养因子，主要有血球凝集素、胰蛋白酶抑制剂等，这些抗营养因子的存在严重损害了洋刀豆蛋白质的消化吸收和生物有效性，限制其作为人类食用植物蛋白和动物饲料。(朱建标，王洪新.洋刀豆凝集素的灭活研究[j].郑州工程学院学报，2002(01)：89-93)。
[0006]
小刀豆(canavalia cathartica)为豆科刀豆属下的一个种。二年生、粗壮、草质藤本。茎、枝被稀疏的短柔毛。羽状复叶具3小叶；托叶小，胼胝体状；小托叶微小，极早落。小叶纸质，卵形，长6-10厘米，宽4-9厘米，先端急尖或圆，基部宽楔形、截平或圆，两面脉上被极疏的白色短柔毛；叶柄长3-8厘米；小叶柄长5-6毫米，被绒毛。花1-3朵生于花序轴的每一节上；花梗长1-2毫米；萼近钟状，长约12毫米，被短柔毛，上唇2裂齿阔而圆，远较萼管为短，下唇3裂齿较小；花冠粉红色或近紫色，长2-2.5厘米，旗瓣圆形，长约2厘米，宽约2.5厘米，顶端凹入，近基部有2枚痂状附属体，无耳，具瓣柄，翼瓣与龙骨瓣弯曲，长约2厘米；子房被绒
毛，花柱无毛。荚果长圆形，长7-9厘米，宽3.5-4.5厘米，膨胀，顶端具喙尖；种子椭圆形，长约18毫米，宽约12毫米，种皮褐黑色，硬而光滑，种脐长13-14毫米。花、果期3-10月。生长环境，生于海滨或河滨，攀援于石壁或灌木上(中国植物物种信息数据库，https：//baike.so.com/doc/2281514-2413549.html)。
[0007]
苜蓿(medicago sativa l.)是苜蓿属植物的通称，是一种一年生或多年生草本植物，是重要的饲草植物，并被世界各国广泛引种栽培。其中，苜蓿是世界上种植历史最为悠久，分布范围最为广泛、栽培面积最大、生产化水平最高、经济价值量最为高的牧草，具有“牧草之王”的美名。在美国等发达国家是仅次于大豆、小麦和玉米的第四大粮食作物，从而也有“现金作物”之称。同时，苜蓿被大量栽培，并被用于家畜的优良饲草，具有较高的营养价值和产量，适口性也极好(潘霞，高永，刘博，等.苜蓿产业发展现状及前景展望[j].绿色科技，2017(13)：104-107.)。
[0008]
白芸豆(phaseolus vulgaris linn.)，生物学名为多花菜豆，为一年生、缠绕或近直立草本。白芸豆属豆科蝶形花亚科，菜豆族菜豆属，是一种在世界范围内广泛种植的豆类作物。在我国，白芸豆是云南的盛产豆类，云南省白芸豆种植面积在3.3万hm2左右。芸豆籽粒中含有18％～21％的蛋白质，40％～60％的淀粉，1.6％～2.15％的脂肪，白芸豆不仅营养丰富，而且具有药用价值(张根旺，孙芸.食用豆类资源的开发利用[j].中国商办工业，2001，(01)：48-9.)。白芸豆中含有α-淀粉酶抑制剂，能够抑制唾液及胰中的α-淀粉酶活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，在减肥和血糖控制等保健食品中有广泛应用。张武松以提取过α-淀粉酶抑制剂的白芸豆豆渣为原料，采用碱法提取工艺，进行豆渣中白芸豆淀粉的提取(张武松，迟永楠，孙艳，等.白芸豆豆渣中淀粉的提取及其特性研究[j].粮食加工，2017，42(05)：40-4.)。
[0009]
植物凝集素是一个庞大的异种蛋白群体，除上述本质特征外，不同凝集素在理化性质、分子结构、糖结合特异性及生物活性方面存在显著差异。豆科凝集素(legume lectins)特指一类在豆科植物中发现的植物凝集素(并不是所有来自豆科植物的凝集素都是豆科凝集素)，已发现存在于70多种植物中，是目前研究得最清楚的凝集素家族。大多数豆科凝集素存在于植物的成熟种子中，但在叶、茎和根等组织器官中也有发现，并且，一些豆科植物还具有多种凝集素。(蔡茜茜，李巧玲，刘舒云，等.植物凝集素研究与展望[j].食品科学技术学报，2013，31(06)：51-57.)
[0010]
豆科植物中的有毒蛋白主要为凝集素类，豆科植物凝集素大多来自豆科植物的种子，在成熟种子中占蛋白质总含量的10％左右，被称为豆科凝集素家族。豆科凝集素具有多种生理功能，如识别糖蛋白、糖肽及生物膜中碳水化合物决定簇，作为植物体的储存蛋白和微生物的共生介质等。豆科凝集素对多种昆虫有毒害作用，对包括鞘翅目、同翅目、双翅目和鳞翅目都有抑制活性；而另一方面，凝集素具有很好的抗真菌作用，ara
ú
jo-filho等研究表明，大豆凝集素有抑制真菌侵染的能力，殷晓丽等从苦豆子中提取的凝集素对意大利青霉菌和交格链孢菌有很好的抑菌作用。(刘虹，易丽莎，蒲乙琴，等.中国野生豆科植物资源及豆类蛋白研究概况[j].生物资源，2019，41(03)：185-194.)
[0011]
豆类是大部分地区，尤其是发展中国家居民的一种好的蛋白质来源。干豆中蛋白质和多肽约占20～40％。其蛋白质可能是优质的，但由于含血凝素、蛋白酶抑制物、蚕豆病因子、生物硷及毒氨基酸等有害物质，这些豆子是不能食用的。除了组成植物蛋白的种氨基
酸外，豆类还有一些游离的特殊氨基酸，通过饲喂或其他途径给动物，其中有些是有毒的。(roy dn，胡继繁.山黧豆及其他豆类的有毒氨基酸和蛋白质[j].国外医学(卫生学分册)，1983(03)：147-151.)
[0012]
从红豆、四季豆、白芸豆、黑眼豆、落花生、法国豆、香豌豆等分离的抑制物也具有类似的生物学活性。大鼠吃生白芸豆可出现生长受抑、粪便中氮和氨基酸排出量增加。而胰蛋白酶抑制物使胱氨酸不能被利用，是白芸豆营养价值不好的原因之一。(roydn，胡继繁.山黧豆及其他豆类的有毒氨基酸和蛋白质[j].国外医学(卫生学分册)，1983(03)：147-151.)
[0013]
l-刀豆氨酸(l-canavanine)[l-2-氨基-4-胍氧基-丁酸]是一种广泛存在于豆科植物及其种子中的天然非蛋白质氨基酸，具有一定的毒性。它是一种白色晶体，分子量为176.18，分子式为：c5h12n4o3，其结构式如下：
[0014][0015]
刀豆氨酸最早在1929年由日本科学家发现。到了六十年代初刀豆氨酸的消旋性开始有文献报导：即l-刀豆氨酸和d-刀豆氨酸。自l-刀豆氨酸被发现以来，已发现了其毒性，抗代谢性和抗肿瘤性。由于其毒性，l-刀豆氨酸被认为是一种潜在的杀虫剂。目前，l-刀豆氨酸的抗肿瘤性是研究的热点。经研究证实，l-刀豆氨酸及其衍生物无论是作为单一药物还是与5-氟尿嘧啶联合使用或作为放射化疗物质，都具有明显的抗肿瘤性，且被认为是一种有效的抗胰腺癌物质。胰腺癌是一种严重的消化系统恶性肿瘤，在美国，胰腺癌居恶性肿瘤死亡原因的第4位，消化道肿瘤死亡原因的第2位，死亡率非常高。因此，l-刀豆氨酸作为一种抗癌特别是胰腺癌物质具有广阔的研究价值。(高艳，张小林，胡延雷，等.l-刀豆氨酸的研究进展[j].化工中间体，2006(03)：5-7+27)。


技术实现要素：

[0016]
发明目的：本发明提供一种高提取率的利用豆渣制酶增加刀豆氨酸提取率和降解残余刀豆氨酸的方法。
[0017]
技术方案：所述高提取率的利用豆渣制酶增加刀豆氨酸提取率和降解残余刀豆氨酸的方法，包括如下步骤：将豆渣与麦麸配伍，接入微生物发酵，得到复合酶的酶曲，再加入豆科植物进行处理，分解植物细胞壁和果胶，释放刀豆氨酸，分离刀豆氨酸后，提取剩余物加入用豆渣培养的刀豆氨酸分解酶和蛋白酶或产酶微生物，降解刀豆氨酸残余，获得所需脱毒产物；或将豆科植物粉碎，接入产纤维素酶和果胶酶的微生物转化，提取刀豆氨酸，提取剩余物在接入产刀豆氨酸分解酶的微生物转化，得到产物。
[0018]
所述豆科植物为富含刀豆氨酸的海刀豆、洋刀豆、小刀豆、白芸豆、藜豆或苜蓿。
[0019]
进一步地，将豆渣与麦麸或富含纤维素的玉米秸秆等配伍，灭菌冷却后接入木霉发酵。
[0020]
进一步地，将豆渣与麦麸或富含纤维素的稻草等配伍，接入曲霉发酵得到酶曲。
[0021]
进一步地，将豆渣与麦麸配伍，接入酵母进行发酵。
[0022]
进一步地，接入曲霉或其所产纤维素酶进行转化，提取刀豆氨酸。
[0023]
进一步地，接入冠突散蘘菌(俗称金花菌)进行转化后，提取刀豆氨酸。
[0024]
进一步地，接入毛霉、干酪乳杆菌、乳酸菌、根霉、乳酸菌或其所产纤维素酶或果胶酶进行转化。
[0025]
进一步地，利用豆渣原料培养的微生物可以是酵母菌、种类可以是产香酵母、酿酒酵母或产朊酵母，分别使处理物料具有香气、乙醇和增加蛋白质量。
[0026]
进一步地，豆渣原料的使用培养微生物时，所用微生物适应了豆渣原料的成份(产酶诱导物)等特性，将产生对豆类加工有针对性的酶种类，这些酶在后续的豆类加工中有着更好的适应性。
[0027]
进一步地，将豆渣与麦麸或富含纤维素的玉米秸秆等配伍时，豆渣含水量可达80％以上，与干的秸秆等配料进行配伍时，可减少加水量，节水节能。
[0028]
豆渣是产量巨大的可利用资源，本发明开发了一种利用豆渣制酶增加刀豆氨酸提取率和降解残余刀豆氨酸的方法。刀豆氨酸是具有良好抗癌作用的功能成份(以抗胰腺癌著称)，刀豆氨酸有一定的毒性故食品或加工业希望降低其残留量以提高安全性。本发明将富含刀豆氨酸的海刀豆、小刀豆或洋刀豆或其他豆科植物及豆渣经预处理，经用豆渣所产纤维素酶、果胶酶或能产生这些酶的微生物进行生物转化，使植物细胞的细胞壁和果胶等进行分解，增加刀豆氨酸的释放量以增加提取率。并将提取剩余物加入用豆渣制备的刀豆氨酸分解酶或产刀豆氨酸分解酶的微生物，降解其中残留的刀豆氨酸，微生物同时产生的蛋白酶将物料中蛋白质转化为氨基酸或多肽，提高提取剩余物的营养价值和利用价值。
[0029]
本发明中豆渣原料经配料和灭菌等处理，加入产纤维素酶或果胶酶的微生物进行发酵，得到酶后用于加入提刀豆氨酸的原料进行酶转化，以提高刀豆氨酸的提取率，然后利用在豆课中培养产刀豆氨酸分解酶的微生物对残留的刀豆氨酸进行降解。将提取剩余物豆渣，加入刀豆氨酸分解酶或产刀豆氨酸分解酶的微生物后，经酶转化或微生物发酵，将刀豆氨酸分解完全，将其中的淀粉和蛋白质分解为糖、多肽和氨基酸。
[0030]
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
[0031]
1、本发明的提出了利用低成本的豆渣产酶和增加刀豆氨酸提取率、降低提取剩余物中刀豆氨酸量的有效方法，提高物料的利用率和过程的经济效益。
[0032]
2、提取剩余物加入刀豆氨酸分解酶或产刀豆氨酸分解酶的微生物，降低残留刀豆氨酸量后成为富含蛋白质和膳食纤维的原料。蛋白质在蛋白分解酶作用下转化为小分子氨基酸和多肽，提高了剩余物豆渣的营养价值。
[0033]
3、利用豆渣产酶，用于增加豆科植物功能成份及全料利用的方法，具体是利用豆渣培养产微生物，用于增加豆科植物中刀豆氨酸提取率、降低刀豆氨酸残留量并对提取剩余物进行综合利用的方法。
[0034]
4、本发明方法具有成本低，节约资源，工艺简单，过程绿色等优点，可同时得到抗癌成份刀豆氨酸，并使其提取量增加。
附图说明
[0035]
图1不同植物部位中刀豆氨酸的显色；
[0036]
图2豆渣的微生物发酵产酶。
具体实施方式
[0037]
实施例1
[0038]
100kg含水80％的湿豆渣与10kg麦麸配伍拌匀后调节ph为6.0灭菌，冷却后接入木霉发酵7天，得富含纤维素酶等复合酶的酶曲，以1％的添加量加入海刀豆中在50度酶解48小时后，按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，刀豆氨酸的提取率96.2％，将所得的提取剩余物豆渣，以1％接种量加入乳酸菌，拌匀后在35℃下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全的物料。
[0039]
实施例2
[0040]
100kg含水80％的湿豆渣与15kg麦麸配伍拌匀后调节ph为5.5灭菌，冷却后接入曲霉发酵7天，得富含纤维素酶和淀粉酶等复合酶的酶曲，以1％的添加量加入洋刀豆中在50度酶解48小时后，按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，刀豆氨酸的提取率95.0％。
[0041]
将所得的提取剩余物豆渣，接入毛霉，混匀后在25℃发酵5天。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质部分分解的物料。
[0042]
实施例3
[0043]
100kg豆渣经除杂后与15kg麦麸配伍，拌匀后调节ph为6.5灭菌，接入黑曲霉，在28℃发酵5天。以1％量加入小刀豆中酶解50小时，按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，刀豆氨酸提取率93％。
[0044]
将所得的提取剩余物豆渣，接入0.5％的酵母菌，混匀后在30℃条件下发酵2天。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质得到部分分解的物料。
[0045]
实施例4
[0046]
100kg白芸豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率70％，调节ph为6.7，接入黑曲霉，在28℃转化3天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量80％的产品5.8kg。
[0047]
将所得的提取剩余物豆渣，接入毛霉，混匀后在25℃条件下发酵2天。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质部分分解的物料。
[0048]
实施例5
[0049]
100kg海刀豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率70％，调节ph为6.6，接入金花菌，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量89％的产品16.8kg。
[0050]
将所得的提取剩余物豆渣，接入干酪乳杆菌，混匀后在35℃条件下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全的物料。
[0051]
实施例6
[0052]
100kg洋刀豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率60％，调节ph为6.0，接入金花菌，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量89％的产品16.5kg。
[0053]
将所得的提取剩余物豆渣，接入乳酸菌，混匀后在35℃条件下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全的物料。
[0054]
实施例7
[0055]
100kg藜豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率70％，调节ph为6.4，接入黑曲
霉，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量88％的产品17.0kg。
[0056]
将所得的提取剩余物豆渣，接入根霉，混匀后在35℃条件下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质得到分解的物料。
[0057]
实施例8
[0058]
100kg小刀豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率70％，调节ph为6.8，接入黑曲霉，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量87％的产品12.6kg。
[0059]
将所得的提取剩余物豆渣，接入毛霉，混匀后在25℃条件下发酵2天。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质部分分解的物料。
[0060]
实施例9
[0061]
100kg白芸豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率60％，调节ph为6.0，接入金花菌，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量85％的产品7.4kg。
[0062]
将所得的提取剩余物豆渣，接入乳酸菌，混匀后在35℃条件下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全、淀粉和蛋白质得到分解的物料。
[0063]
实施例10
[0064]
100kg白芸豆进行除杂清洗，粉碎后加入水至含水率60％，调节ph为6.5，接入黑曲霉，在30℃转化4天。按常规的水提、去杂、精制方法提取刀豆氨酸，得到刀豆氨酸含量89％的产品8.3kg。
[0065]
将所得的提取剩余物豆渣，接入乳酸菌，混匀后在35℃条件下发酵30h。得到刀豆氨酸分解完全、植物凝集素、淀粉和蛋白质得到分解的物料。
[0066]
实施例11
[0067]
与实施例10相同，将黑曲霉换成酿酒酵母。
[0068]
实施例12
[0069]
与实施例10相同，将黑曲霉换成产朊酵母。
[0070]
实施例13
[0071]
与实施例10相同，将黑曲霉换成产香酵母。
[0072]
实施例14
[0073]
与实施例10相同，将黑曲霉换成毛霉。
[0074]
实施例15
[0075]
与实施例10相同，将黑曲霉换成根霉。
[0076]
实施例16
[0077]
与实施例10相同，将黑曲霉换成米根霉。
[0078]
表1刀豆接种产酶微生物前后刀豆氨酸含量
[0079]
刀豆原料刀豆原料(未处理)刀豆原料(酶处理)刀豆氨酸提取率(％)75.1％96.2％刀豆原料提取剩余物(未处理)提取剩余物(酶处理)刀豆氨酸残留(％)0.051％0.001％