肝外胆管癌基因工程动物模型及其构建和应用

本发明涉及分子生物学与生物医药，具体地说，是一种pten基因条件性敲除(pten-cko)的ecca基因工程动物模型及其构建方法和在ecca研究中的应用。

背景技术：

1、胆管癌(cholangiocarcinoma,cca)是一类具有高异质性、高致死性的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命和健康，给患者造成身体、心理及经济上的巨大负担。cca根据解剖部位不同分为肝内癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,icca)、肝周癌(perihilarcholangiocarcinoma,pcca)和远端癌(distal cholangiocarcinoma,dcca)。pcca和dcca被统称为肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,ecca)，占所有cca病例的90％以上。不同亚型cca不仅解剖位置不同，而且生物学行为和临床特征也有所不同。流行病学报告显示，近年来cca的发病率在全球范围内不断增加，然而其5年生存率仍不足10％，这种不良的预后主要与缺乏适当的早期诊断工具和有效的治疗方法有关。

2、近年来高通量技术的应用，如二代测序(next-generation sequencing,ngs)和其他“组学”方法，在一定程度上拓宽了人们对cca发病机制的认知，提示cca与基因变异有关，且与肿瘤微环境存在复杂的相互作用。已经在cca中确定了广泛的基因改变，包括kras基因的致癌突变，或肿瘤抑制基因的失活突变，如tp53、smad4和pten，其中一些有望或正在成为治疗的靶点。

3、除人类研究外，基因工程小鼠(genetically engineered mouse,gem)模型对于了解该疾病的发生发展尤为重要。目前已经产生了一系列gem模型，其中包括癌基因(如kras)和抑癌基因(如tp53、smad4和pten)的改变，但这些模型多由alb-cre或alfp-cre系统所驱动，因此诱导的cca模型多为icca或icca与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)的混合型肿瘤。

4、目前可追溯的关于ecca的条件性gem模型的研究主要有三篇：1)falcomata等利用pdx1启动子介导的cre重组酶组成性激活肝外胆管上皮细胞上pi3kcah1047r，最终诱导了ecca的发生发展。falcomata等的研究结果模拟了人类胆道上皮内瘤变(biliaryintraepithelial neoplasia,bilin)前体病变的全过程，但成瘤潜伏期较长(9月)；2)nakagawa等构建的ecca模型制作过程较为复杂，涉及对krasg12d、tgfβr2、cdh1等多个基因的联合编辑，致癌时间虽快，但很快因肺部转移导致肺功能衰竭，小鼠多在4周内死亡，不适合进行长时间的研究和观察；3)lin等基于alb-cre重组酶，通过条件性激活kras、失活pten最终构建了ecca gem模型，该模型具有成瘤潜伏期短(12周)，同时有肝胆胰系统肿瘤发生的优点，是研究肝胆胰导管系统疾病的良好工具。然而其缺点在于诱导的模型为多系统肿瘤，非专一性的ecca模型，且icca与ecca均呈现低级别腺瘤变，无远处转移发生，不能很好地模拟人类ecca的发生发展。

5、可见，目前仍缺乏合适的能够很好地表征临床相关微环境背景下ecca发生、发展的条件性gem模型。本领域迫切需要开发一种可以作为研究ecca发生发展机理以及潜在抗肿瘤药物筛选、疗效评估的有力工具的动物模型。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种pten基因条件性敲除的ecca基因工程动物模型及其构建方法和在ecca研究中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种肝外胆管癌ecca动物模型的制备方法，所述方法包括步骤：

3、(a)提供第一动物，所述第一动物为携带loxp序列的ptenl/l动物，和提供第二动物，所述第二动物为携带pdx1启动子控制的cre重组酶的pdx1-cre动物；

4、(b)将第一动物和第二动物进行杂交，获得杂合pten缺失的f1代ptenl/+/pdx1-cre动物；

5、(c)将f1代动物与第一动物继续杂交，获得纯合pten缺失的ptenl/l/pdx1-cre动物；

6、任选地，所述方法还包括选自下组的步骤：

7、(d)将ptenl/l/pdx1-cre基因型的动物自交3代以上，从而得到基因型稳定的ptenl/l/pdx1-cre基因型的动物；

8、获得的ptenl/l/pdx1-cre动物即为敲除肝外胆管pten基因的ecca动物模型。

9、在另一优选例中，所述ecca动物模型中全胰腺组织及肝外胆管，而非肝内胆管组织的pten基因表达降低。

10、在另一优选例中，所述敲除涉及的动物基因组是全胰腺组织及肝外胆管的基因组，而非肝内胆管组织的基因组。

11、在另一优选例中，所述pten基因为pten基因的第5号外显子序列。

12、在另一优选例中，所述ecca动物模型具有选自下组的基因型：ptenl/l/pdx1-cre、ptenl/l/r26-laczl/l/pdx1-cre。

13、在另一优选例中，所述ecca动物模型为啮齿动物。

14、在另一优选例中，所述ecca动物模型为小鼠或大鼠。

15、在另一优选例中，所述pten基因的表达降低指的是，在所述ecca动物模型中pten基因的表达量a1与正常小鼠中的pten基因的表达量a0之比a1/a0≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3，或为0。

16、在另一优选例中，所述pten基因的表达降低指的是，在所述ecca动物模型中pten基因的表达量a1与正常小鼠中的pten基因的表达量a0之比a1/a0≤2/3。

17、在另一优选例中，所述pten基因的表达降低指的是，在所述ecca动物模型中pten基因的表达量a1与正常小鼠中的pten基因的表达量a0之比a1/a0≤1/2。

18、在另一优选例中，所述pten基因的表达降低指的是，在所述ecca动物模型中pten基因的表达量a1与正常小鼠中的pten基因的表达量a0之比a1/a0≤1/3。

19、在另一优选例中，所述pten基因的表达降低指的是，在所述ecca动物模型中pten基因的表达量a1与正常小鼠中的pten基因的表达量a0之比a1/a0为0。

20、在另一优选例中，所述pten基因的表达量为肝外胆管上皮细胞中的表达量。

21、在另一优选例中，所述ecca动物模型中pten是纯合突变的，即ptenl/l。

22、在另一优选例中，所述方法还包括：对所述ecca动物模型进行选自下组的多项检测：

23、(m1)通过基因鉴定，对ptenl/l/pdx1-cre或ptenl/+/pdx1-cre基因型进行确认；和

24、(m2)在1月龄至12月龄期间，通过肉眼或h&e方法定期观察ecca动物模型的肝外胆管病变；或

25、(m3)进行ihc和western blot检测pten和pi3k/akt信号通路上激活形式的p-aktser473水平；或

26、(m4)对肝外胆管上皮细胞的早期炎症性增生应答标志进行检测；或

27、(m5)对胰腺和胆道系统的病变情况进行观测；或

28、(m6)检测emt标志物的变化；或

29、(m7)对间质标记物进行检测；或

30、(m8)对细胞形态及细胞增殖情况进行观察及检测。

31、在另一优选例中，所述基因鉴定为pcr鉴定及琼脂糖凝胶电泳显影。

32、在另一优选例中，所述肝外胆管病变包括但不限于上皮细胞增生、炎症细胞浸润、管周腺体囊性扩张和纤维化。

33、在另一优选例中，所述早期炎症性增生应答标志包括但不限于：cd11b阳性白细胞浸润、nf-κb p65核转位、ki-67染色阳性率、dna损伤。

34、在另一优选例中，所述emt标志物的变化包括上皮标志物e-cadherin的丢失和间质标志物vimentin的获得。

35、在另一优选例中，所述间质标记物包括但不限于vimentin、snail和slug。

36、在另一优选例中，所述方法还包括：对基因型为ptenl/l/r26-laczl/l/pdx1-cre的ecca动物模型进行追踪检测。

37、在另一优选例中，所述追踪检测包括步骤：

38、(n1)通过基因鉴定，对ptenl/l/r26-laczl/l/pdx1-cre基因型进行确认；和

39、(n2)通过x-gal染色或ihc检测以追踪增生性病变的细胞来源。

40、在另一优选例中，所述方法得到的ecca基因工程动物模型，与pten野生型动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：

41、1)肝外胆管上皮细胞的早期炎症性增生应答(cd11b阳性白细胞浸润，nf-κb p65核转位，ki-67染色阳性率，dna损伤等)增加；

42、2)肝外胆管上皮细胞的囊性变增加；

43、3)肝外胆管上皮细胞的纤维化增生增加；

44、4)肝外胆管上皮细胞的dna损伤增加；或

45、5)上述1)～3)病理改变逐渐进展为ecca，并可进一步发生远隔器官(如，肺)转移。

46、在本发明的第二方面，提供了一种构建物组合，所述构建物组合用于制备由如本发明第一方面所述的方法获得的动物模型，所述构建物组合包括：

47、(k1)第一构建物，所述第一构建物包括携带loxp序列的ptenl/l；和

48、(k2)第二构建物，所述第二构建物包括携带pdx1启动子控制的cre重组酶；

49、(k3)导入组分，所述导入组分用于将第一构建物及第二构建物导入欲构建模型的动物中。

50、在另一优选例中，所述导入组分包括但不限于：含有潮霉素抗性基因(正筛选标记)和hsv胸苷激酶(hsv-tk)基因(负筛选标记)的loxp侧翼序列。

51、在本发明的第三方面，提供了一种哺乳动物的胆管上皮细胞系，所述胆管上皮细胞系中的pten基因被重组敲除。

52、在另一优选例中，所述的细胞系为人、或啮齿动物(如小鼠、大鼠)的细胞系。

53、在另一优选例中，所述的胆管上皮细胞系包括肝内胆管上皮细胞系、或肝外胆管上皮细胞系。

54、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因敲除的h69细胞系。

55、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因的外显子1-9中一个或多个外显子被敲除的h69细胞系。

56、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因的外显子1、5、7中一个或多个外显子被敲除的h69细胞系。

57、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因的1号和7号外显子被敲除的h69细胞系。

58、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因的外显子1-9中一个或多个外显子被敲除的啮齿动物细胞系。

59、在另一优选例中，所述的细胞系为pten基因的5号外显子被敲除的啮齿动物细胞系。

60、在本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的方法的获得的ecca动物模型，或如本发明第三方面所述的胆管上皮细胞系的应用，用于：

61、(i)研究ecca的发生机制；

62、(ii)研究ecca的发展机制；

63、(iii)筛选治疗ecca的候选药物或治疗剂；和/或

64、(iv)评估治疗ecca的候选药物或治疗剂的疗效。

65、在另一优选例中，所述ecca的候选药物包括但不限于：gdc-0068(ipatasertib)、azd-5363(capivasertib)、at-13148，或其组合。

66、在另一优选例中，所述ecca的治疗剂包括但不限于：依维莫司、西罗莫司、帕尼西布，或其组合。

67、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。