一种氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物及其制备方法和作为荧光探针的用途

1.本发明涉及荧光探针技术领域，具体是涉及一种氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物及其制备方法和作为荧光探针的用途。


背景技术：

2.活性氧物种(reactive oxygen species ros)是生理过程中重要的代谢产物。次氯酸(hclo)作为ros的重要成员之一，具有很强的氧化性。内源性的次氯酸是在血红素髓过氧化物酶(mpo)的催化下，由过氧化氢和氯离子反应产生。在体内免疫系统中，次氯酸是杀灭入侵病原体的强力武器。但是，当体内次氯酸浓度过高时，会产生氧化应激和氯化应激，扰乱机体正常新陈代谢，损伤组织，引发多种疾病，例如神经退行性疾病、肾病、心脏病、肝缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、肺损伤、类风湿性关节炎、心血管疾病和癌症等。因此，建立高灵敏度、高选择性以及可视化的方法检测和识别hclo具有重要的现实意义。
3.目前，检测hclo的方法多种多样，常见的有电子自旋探针、选择性电极法、化学发光法、紫外-可见吸收分光光度法以及荧光探针法等。其中，荧光探针法因其良好的选择性、高灵敏度、高光谱分辨率等优势，成为临床医学和生物医学研究中不可或缺的工具。尽管己经研究发现了大量检测 hclo的荧光探针，但多数荧光探针在实际应用中仍存在一定的缺陷，如合成繁琐、成本高昂、荧光量子产率低、响应时间慢、水溶性差、stokes位移小、易受环境影响、灵敏度低、ph应用范围窄以及一些探针无法进行生物应用和可视化成像等。这些缺陷鼓励我们设计和开发一类新型的特异性检测hclo荧光探针，这类新型的特异性检测hclo荧光探针应具有良好的水溶性、低的检出限、优异的选择性和竞争性、高的荧光强度、较大的stokes 位移等。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物及其制备方法和作为荧光探针的用途。本发明的氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物以苯并香豆素为荧光团，该化合物作为荧光探针，具有良好的光学性质、能专一识别hclo，并且响应时间快、ph应用范围广、检出限低，水溶性好。
5.为达到本发明的目的，本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的结构式如下所示：
[0006][0007]
另一方面，本发明还提供了一种前述氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的制备方法，所述方法包含以下步骤：
[0008]
(1)合成中间体bm：将2-羟基萘乙醛和乙酰乙酸乙酯的混合物溶于乙醇中，加入催化剂，将反应混合物搅拌后进一步加热，反应完成后冷却至室温，过滤，干燥后重结晶，制得中间体bm；
[0009]
(2)合成氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物：在乙腈和dmf的混合溶剂中加入中间体bm、甲基磺酸和二巯基乙醇，并在惰性气体气氛下回流，反应完成后，将混合物冷却至室温并用乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶，即得氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物。
[0010]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中2-羟基萘乙醛与乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1：1-1.5。
[0011]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中的催化剂为哌啶。
[0012]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中搅拌是在室温条件下搅拌5-35分钟。
[0013]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中加热是加热回流。
[0014]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中重结晶是在乙醇溶剂中重结晶。
[0015]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中乙腈和dmf 的混合溶剂中乙腈与dmf的体积比为2-4：1。
[0016]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中混合溶剂与中间体bm的体积质量比为1ml：9-15mg。
[0017]
进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中混合溶剂、甲基磺酸和二巯基乙醇的体积比为1：0.01-0.03：0.01-0.03。
[0018]
另一方面，本发明还提供了一种前述氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的应用，所述应用为将所述氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物用作荧光探针检测次氯酸。
[0019]
与现有技术相比，本发明的优点如下：
[0020]
(1)本发明的氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物以香豆素类化合物作为荧光探针的母核结构，所得探针具有良好的光学性质、能专一识别hclo，且ph应用范围广。
[0021]
(2)本发明中的探针本身没有荧光信号，加入hclo后，探针在470nm 处的荧光信号显著增强，反应体系的荧光强度与hclo浓度在0～10μm内呈现良好的线性关系，检测限为5.64nm，紫外吸光度与hclo浓度在0～70μm 内呈现良好的线性关系。
[0022]
(3)本发明的探针bmh具有水溶性良好，选择性好，灵敏度高，抗干扰强，响应速度
快，检出限低等优点。此外，本发明的探针bmh能作为固体探针被应用于对hclo的快速检测，也可用于检测实际水样中的hclo，以获得满意的回收率。
[0023]
(4)本发明的bmh具有良好的生物相容性，可成功应用于精确监测天然hclo以及活raw 264.7细胞内内源性和外源性hclo水平的变化。
附图说明
[0024]
图1是本发明实施例1中间体bm的氢谱图；
[0025]
图2是本发明实施例1中间体bm的碳谱图；
[0026]
图3是本发明实施例1中间体bm的质谱图；
[0027]
图4是本发明实施例1所得合成氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的氢谱图；
[0028]
图5是本发明实施例1所得合成氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的碳谱图；
[0029]
图6是本发明实施例1所得合成氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物的质谱图；
[0030]
图7是本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)作为荧光探针的选择性结果示意图；
[0031]
图8是本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)作为荧光探针对次氯酸的荧光滴定研究结果示意图，其中由下至上的曲线分别代表hclo 浓度为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μm；
[0032]
图9是表明本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)作为荧光探针与hclo浓度在0～10μm范围内成良好的线性关系(r2＝0.9994)；
[0033]
图10是时间对本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)探针的影响结果示意图；
[0034]
图11是本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)探针的荧光寿命示意图；
[0035]
图12是ph对本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)探针的影响结果示意图(ex＝395，狭缝宽度3/3，0.01mpbs溶液)；
[0036]
图13是本发明探针对hclo的可能识别机理示意图；
[0037]
图14是本发明探针bmh的密度泛函示意图；
[0038]
图15是本发明探针bmh的细胞毒性实验结果示意图；
[0039]
图16是本发明探针bmh通过荧光共聚焦显微镜应用于活raw 264.7 细胞中的内源性和外源性hclo成像实验结果示意图。
具体实施方式
[0040]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0041]
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0042]
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1 至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0043]
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0044]
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
[0045]
此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0046]
实施例1
[0047]
合成中间体bm：在50ml的圆底烧瓶中，将2-羟基萘乙醛(1.72g， 10mmol)和乙酰乙酸乙酯(1.56g，12mmol)的混合物溶于20ml乙醇中。加入催化量的哌啶，并将反应混合物在室温搅拌20分钟。将其进一步加热回流2小时，反应完成后(通过tlc监测)，将反应混合物冷却至室温，将所得浅黄色固体产物过滤，干燥后乙醇重结晶，制得中间体bm，收率 82％；熔点：1h nmr(400hz,cdcl3)(附图1):δh(ppm):9.331 (s,1h),8.369(d,j＝8.4hz,1h),8.099(d,j＝9.2hz,1h),7.924(d,j＝8.0 hz,1h),7.757(t,j＝8.4hz,1h),7.619(t,j＝6.4hz,1h),7.473(d,j＝9.2 hz,1h),2.790(s,3h,ch3)ppm；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)(附图1)δ 195.55,159.45,156.20,143.21,136.31,130.26,129.90,129.29,126.72,122.51, 121.74,116.55,112.80,30.72；esi-ms
+
:calcd for c
15h10
o3[m+h
+
]
+ 239.2460；found 239.0172,calcd for c
15h10
o3[m+na
+
]
+
261.2278；foundfound 260.9964(附图3)。
[0048]
合成氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物：乙腈和dmf混合溶剂20ml (v:v＝3:1)中加入中间体bm(1mmol，238mg)，甲基磺酸0.3ml，二巯基乙醇0.3ml，并在ar气氛下回流4小时。反应完成后，将混合物冷却至室温并乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶获得氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物，为浅黄色固体(240mg，80％)，熔点：m.p:155～157℃.1h nmr (400mhz,cdcl3)(附图4):δh(ppm):9.331(s,1h),8.369(d,j＝8.4hz,1h), 8.099(d,j＝9.2hz,1h),7.924(d,j＝8.0hz,1h),7.757(t,j＝8.4hz,1h), 7.619(t,j＝6.4hz,1h),7.473(d,j＝9.2hz,1h),2.790(s,3h,ch3)ppm. 13
c nmr(cdcl3,101mhz)(附图5):δ159.93,152.75,132.43,131.98,130.26, 129.68,129.33,128.93,127.99,125.89,121.59,116.56,113.03,91.52,71.27, 33.38,29.25.(fig.s9).esi-ms
+
:calcd for c
17h14
o3s[m+na
+
]
+
321.3470； found 321.0654(附图6)。
[0049]
实施例2
[0050]
本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(本发明中简称为bmh)作为荧光探针的溶剂效应考察。
[0051]
考察不同溶剂体系对配体荧光的影响，研究发现bmh加等当量的次氯酸，在不同的溶剂中(乙醇，甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，水，乙睛)荧光强度明显不同，在水中配体bmh加等当量的次氯酸具有强荧光，其他溶剂中荧光微弱，因此，在接下来的实验中，选择pbs(10mm，ph＝7.4)溶液作为测试体系。
[0052]
实施例3
[0053]
本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)作为荧光探针的选择性和竞争性研究。
[0054]
为了研究探针bmh对hclo的专一选择性，如图7所示，在pbs (0.01m，ph＝7.4)溶液体系中，加入各种活性氧物种、氨基酸、阴阳离子时，探针bmh几乎无荧光变化没有荧光产生，只有hclo入后探针bmh 的产生强荧光。
[0055]
随后，又研究了在其他干扰物质共存的条件下，探针bmh对hclo的竞争性，在pbs溶液(2ml)中加入探针bmh(10μm)接着加入各种其他分析离子(ag
+
,fe
3+
,mg
2+
,pb
2+
,cu
2+
,al
3+
,na
+
,zn
2+
,ca
2+
,cr
3+
,),阴离子 (f-,cl-,br-,i-,so
42-,s2o
32-,s
2-,s2o
4-,hco
3-,no
3-,no
2-)，氨基酸(cys，gin，glu，gly，trp，val，lys)，活性氧(onoo-，h2o2，
·
oh，otbu，1o2)，结果表明各种分析物都不会干扰探针bmh对hcl的检测，探针bmh 对hclo具有专一的选择性，并且抗干扰能力强。
[0056]
本发明将探针bmh制作成固体探针，将裁切好的滤纸条浸泡在探针 bmh(10μm)的pbs(0.01m，ph＝7.4)缓冲溶液中，并在空气中干燥。随后，用干净的滴管小心地将各种金属离子(ag
+
,fe
3+
,mg
2+
,pb
2+
,cu
2+
,al
3+
, na
+
,zn
2+
,ca
2+
,cr
3+
,),阴离子(f-,cl-,br-,i-,so
42-,s2o
32-,s
2-,s2o
4-,hco
3-, no
3-,no
2-)，氨基酸(cys，gin，glu，gly，trp，val，lys)，活性氧(onoo-， h2o2，
·
oh，otbu，1o2)，溶液(1mm)滴在滤纸条上，待滤纸条干燥后，将滤纸条放置在365nm的紫外灯下照射，观察滤纸条的变化，对这些滤纸条进行拍照记录，发现只有滴加hclo的滤纸条呈现出极强白色荧光，而其他滤纸条为荧光极弱的呈淡蓝色。
[0057]
实施例4
[0058]
本发明氧硫杂环戊烷-苯并香豆素化合物(bmh)作为荧光探针对次氯酸的荧光滴定研究。
[0059]
通过荧光滴定实验，在pbs(0.01m,ph＝7.4)溶液中研究探针bmh对次氯酸的响应能力。图8-9所示：在未加入次氯酸时，探针bmh本身荧光极弱，随着hclo的加入，体系在400-600nm处荧光强度逐渐增加，在470nm 处有最大荧光强度并且探针的最大荧光峰与hclo浓度在0～10μm范围内成良好的线性关系(r2＝0.9994)，计算最低检出限(3σ/k，σ为空白试样的标准偏差，k为以被测物浓度和所对应荧光强度所拟合曲线的斜率)为 5.64nm。
[0060]
实施例5
[0061]
探针bmh的荧光响应时间和稳定性研究。
[0062]
探针与分析物的反应时间和时间依赖性荧光响应是评价探针的一项非常重要的指标，它体现了探针响应的灵敏度。为此，本发明研究了在室温条件下，探针bmh与hclo反应的动力学性质。如图10所示，在没有加入hclo的时候，探针bmh没有荧光信号，当加入hclo的
l)。这些表明探针bmh可以监测细胞中内源性hclo的波动。最后，用hclo处理后，显著的细胞内蓝色荧光发射表明探针bmh可以检测活细胞中的外源hclo(图16m-o)。生物成像结果支持探针bmh可以作为一种有前途的可视化技术，用于跟踪活细胞中hocl的细胞内波动。
[0075]
实施例9
[0076]
次氯酸探针对比。
[0077]
如表1所示，将本发明合成的探针bmh与以下文献中所报道的有关hclo的探针进行了比较(以下所列仅为部分文献)：
[0078]
[1].w.sun；s.guo；c.hu,etal.,recentdevelopmentofchemosensorsbasedoncyanineplatforms.chem.rev.2016,116(14),7768-817.
[0079]
[2]b.zhu；l.wu；y.wang,etal.,ahighlyselectiveandultrasensitiveratiometricfar-redfluorescentprobeforimagingendogenousperoxynitriteinlivingcells.sens.actuatorsbchem.2018,259,797-802.
[0080]
[3]y.a.li；s.yang；q.y.li,etal.,uio-68-olnmof-basedfluorescentsensorforselectivedetectionofhoclanditsapplicationinbioimaging.inorg.chem.2017,56(21),13241-13248.
[0081]
[4]y.long；j.zhou；m.-p.yang,etal.,highlyselective,sensitiveandnaked-eyefluorescenceprobesforthedirectdetectionofhypochloriteanionandtheirapplicationinbiologicalenvironments.sens.actuatorsbchem.2016,232,327-335.
[0082]
[5]y.koide；y.urano；k.hanaoka,etal.,developmentofansi-rhodamine-basedfar-redtonear-infraredfluorescenceprobeselectiveforhypochlorousacidanditsapplicationsforbiologicalimaging.j.am.chem.soc.)
[0083]
可发现除本发明的探针外表1中所列探针均具有较低的检测限。在有机溶剂中进行检测，与其他报道的配体相比，本方面中的探针bmh显示出较低的检测限，可在纯水中检测次氯酸根离子。
[0084]
表1本发明探针bmh对比其他已报道hclo探针
[0085]
[0086]
[0087]
[0088][0089][0090]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。