从鹰嘴豆芽中制备紫檀烷类化合物高丽槐素和美迪紫檀素的方法

1.本发明涉及一种从鹰嘴豆芽中制备紫檀烷类化合物高丽槐素和美迪紫檀素的方法。该方法可应用于高丽槐素和美迪紫檀素两种对照品的制备，也可应用在鹰嘴豆及豆芽等保健食品开发及其质量标准建立的研究领域。


背景技术：

2.豆科鹰嘴豆属cicer植物全球共发现有44种，主要分布于亚洲西部和近中东地区，鹰嘴豆cicer arietinum l是本属植物中唯一栽培成功、栽种面积较广的世界第三大食用豆类。鹰嘴豆在我国西部的新疆已有2500年的栽培历史，是新疆维吾尔族民间药食兼用的植物，收载于《药品标准》(维吾尔分册)和《维吾尔药志》。异黄酮类化合物是鹰嘴豆中报道较多的有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降低血液胆固醇、降低患糖尿病风险、改善心血管疾病、以及防治雌激素分泌失调引起的多种疾病等作用。据相关研究报道发现鹰嘴豆发芽后其豆芽中总异黄酮量能增长到原籽粒的数十倍之多；鹰嘴豆芽中异黄酮成分的种类也有很大的变化，其提取物在抗氧化活性方面有显著的提高。紫檀烷类化合物属于二氢异黄酮类化合物，是异黄酮家族中的一个十分瞩目的亚类。该类化合物在自然界中分布广泛，主要存在于植物体内抗毒素，其药理活性广泛，是许多中药材的有效成分之一，随着现代药理作用研究的深入，发现该类化合物在抗肿瘤和抗菌方面表现出良好的药理作用。紫檀烷类化合物在植物界中主要分布于豆科蝶形花亚科植物中，如黄芪属、鹰嘴豆属、香槐属、黄檀属、刺桐属、山豆根属、乳豆属、大豆属、甘草属、马鞍树属、槐属等一些植物中。
3.高丽槐素(maackiain)成分广泛存在于豆科植物槐(sophora japonica l.)、广西著名道地药材广豆根(sophora subprostrata chunet t.che)、豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤 (millettia speciosa champ.)的干燥根牛大力等药材中。药理学研究表明高丽槐素具有抗肿瘤活性、抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和谷草芽孢杆菌的分裂生长以及钠
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葡萄糖协同转运蛋白2(sglt-2)活性。抗菌活性研究表明高丽槐素具有很强的抗真菌作用，最低抑菌浓度范围为6.25-25μg
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ml-1
就能抑制真菌的生长。美迪紫檀素(medicarpin)存在于甘草、黄花草木犀、天山岩黄芪、苦马豆、苜蓿等植物中。药理研究表明美迪紫檀素(medicarpin)具有骨保护、抗肿瘤、抗菌、神经保护、抗雄激素等活性。目前还未见到有从鹰嘴豆芽中提取纯化高丽槐素和美迪紫檀素的相关报道。分别以自制高丽槐素和美迪紫檀素两种化合物为对照品，使用hplc计算鹰嘴豆芽化学成分(化合物)总富集部位中高丽槐素含量约为2.13％、美迪紫檀素含量约为3.65％。
4.本发明对鹰嘴豆发芽后的芽部位中化学成分进行充分的分析分离研究，从中得到了一种制备高丽槐素和美迪紫檀素2种紫檀烷类化合物的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种从鹰嘴豆芽中制备紫檀烷类化合物高丽槐素和美迪
紫檀素的方法，该方法先将鹰嘴豆浸泡，发芽后摘取豆芽使用乙醇水溶液回流提取后，浓缩至无醇味的浓膏，将浓膏用纯化水分散后，上样预装大孔树脂色谱柱，依次使用纯化水、浓度10％的乙醇溶液除杂，再使用95％乙醇水溶液洗脱；将洗脱部分浓缩至无醇味后，使用纯化水分散，再通过乙酸乙酯进行萃取，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到总异黄酮部位；再将所得部位依次利用硅胶色谱法以及反相色谱法分离，收集恰当流分，分别得到高丽槐素和美迪紫檀素两种紫檀烷类化合物。该方法为制备高丽槐素和美迪紫檀素两种标准样品提供一种简便、易得、快速的方法，也可应用在鹰嘴豆及豆芽等保健食品开发及其质量标准建立的研究领域。
6.本发明所述的一种从鹰嘴豆芽中制备紫檀烷类化合物高丽槐素和美迪紫檀素的方法，按下列步骤进行：
7.a、精选收获一年生的鹰嘴豆种子，放入温度30℃的温水中浸泡，每隔1-2小时换新鲜水 1次，共浸泡6-8小时，共换水4次；之后将鹰嘴豆种子放入温度、湿度恒定的豆芽箱中发芽，每隔10小时淋水冲洗30s，72-96小时后，摘取豆芽；
8.b、将步骤a所得新鲜豆芽按质量体积比1:25-30放入浓度为60-70％乙醇中，加热回流提取1-2小时，提取3次，合并提取液，浓缩，得到浓缩液；
9.c、将步骤b所得浓缩液加水分散后，上样预装大孔树脂hpd300的玻璃层析柱，依次使用纯化水、浓度为10％的乙醇水溶液除杂后，再使用浓度为95％食用酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到鹰嘴豆芽总富集部位；
10.d、将步骤c所得鹰嘴豆芽总富集部位加入水分散后，再加入同体积的乙酸乙酯进行萃取 3-5次、合并萃取液，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到组分1部位；
11.e、将步骤d所得组分1部位，加2-5倍量60目的硅胶混合均匀，使用40倍100目硅胶湿法装柱，将样品上柱后，直接使用3倍柱体积比10:1的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到组分2；
12.f、将步骤e所得组分2加入浓度为50％-70％乙腈水溶液溶解，将该溶解物利用反相色谱柱：turner hplc columns kromasil 100a c18 5μm 15
×
250mm；溶剂为20％-56％的乙腈水溶液，50min内；流速：3ml/min进行分离，根据不同的出峰时间，分别收集在紫外波长210 nm下有吸收的化合物流分，干燥得2种化合物，经核磁共振碳谱和氢谱结构鉴定为化合物高丽槐素和美迪紫檀素。
13.本发明所述的一种从鹰嘴豆芽中制备紫檀烷类化合物高丽槐素和美迪紫檀素的方法，该方法中的高丽槐素和美迪紫檀素的结构式为：
[0014][0015]
通过本发明所述方法获得的化合物高丽槐素和美迪紫檀素，其中化合物高丽槐素
hplc色谱分析、核磁共振氢谱、碳谱数据及图谱，如图2、图4、图5及表1所示，其结构式为：
[0016][0017]
表1 maackiain的nmr数据(溶剂cd3od,400mhz,δin ppm,j inhz)
[0018][0019]
化合物美迪紫檀素的hplc色谱分析、核磁共振氢谱、碳谱数据及图谱，如图3、图6、图 7及及表2所示，其结构式为：
[0020]
[0021]
表2 medicarpin的nmr数据(溶剂cd3cl3,400mhz,δin ppm,j inhz)
[0022]
附图说明
[0023]
图1为本发明鹰嘴豆芽总富集部位的hplc分析色谱图,其中a为芒柄花苷，b为印度黄檀苷，c为芒柄花素，d为高丽槐素，e为美迪紫檀素，f为鹰嘴豆芽素a；
[0024]
图2为本发明化合物高丽槐素的hplc分析色谱图，出峰时间42.7分钟；
[0025]
图3为本发明化合物美迪紫檀素的hplc分析色谱图，出峰时间44.5分钟；
[0026]
图4为本发明化合物高丽槐素的nmr分析氢谱；
[0027]
图5为本发明化合物高丽槐素的nmr分析碳谱；
[0028]
图6为本发明化合物美迪紫檀素的nmr分析氢谱；
[0029]
图7为本发明化合物美迪紫檀素的nmr分析碳谱；
[0030]
图8为本发明鹰嘴豆总富集部位对白色链球菌(ca)、大肠杆菌(ec)和金黄色葡萄球菌 (sa)三种菌抗菌活性抑菌圈。
具体实施方式
[0031]
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步具体的说明。
[0032]
实施例1
[0033]
a、精选收获一年生的鹰嘴豆种子5kg，确保每粒颗粒完整、饱满，放入温度30℃的
温水中浸泡，每隔2小时使用笊篱捞出换新鲜水1次，共浸泡8小时，共换水4次；之后将鹰嘴豆种子放入温度、湿度恒定的豆芽箱中发芽，每隔10小时淋水冲洗30s，84小时后，摘取豆芽；
[0034]
b、将步骤a所得摘取豆芽按重量体积比1:25放入浓度为70％乙醇中，加热回流提取2小时，提取3次，合并提取液，浓缩，得到浓缩液；
[0035]
c、将步骤b所得浓缩液加300ml水分散后，上样预装1kg大孔树脂hpd300的玻璃层析柱，依次使用纯化水、浓度为10％的乙醇水溶液除杂后，再使用浓度为95％食用酒精洗脱上样树脂层析柱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到鹰嘴豆芽总富集部位；
[0036]
d、将步骤c所得鹰嘴豆芽总富集部位加入2倍体积水分散后，再加入同体积的乙酸乙酯进行萃取5次、合并萃取液，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到组分1部位重量为6.72g；
[0037]
e、将步骤d所得组分1部位6.2g，加5倍量60目的硅胶均匀混合，使用40倍100目硅胶湿法装柱，将样品上柱后，直接使用3倍柱体积比10:1的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到组分2部位1.4g；
[0038]
f、将步骤e所得组分2部位100mg，加入浓度为50％乙腈水溶液溶解，将溶解物利用反相色谱柱，turner hplc columns kromasil 100a c18 5μm 15
×
250mm；溶剂为20％的乙腈水溶液，50min内；流速：3ml/min进行分离，收集出峰时间为35.5min，紫外波长210nm 下有强吸收的化合物1，该化合物紫外吸收基线降低后，紧接又出在紫外波长210nm下有强吸收，峰出峰时间约为37min，为化合物2，干燥后，即得化合物高丽槐素9mg和美迪紫檀素15mg。
[0039]
实施例2
[0040]
a、精选收获一年生的鹰嘴豆种子4kg，确保每粒颗粒完整、饱满，放入温度30℃的温水中浸泡，每隔1.5小时换新鲜水1次，共浸泡6小时，共换水4次；之后将鹰嘴豆种子放入温度、湿度恒定的豆芽箱中发芽，每隔10小时淋水冲洗30s，72小时后，摘取豆芽；
[0041]
b、将步骤a所得摘取豆芽按重量体积比1:30放入浓度为60％乙醇中，加热回流提取2小时，提取3次，合并提取液，浓缩，得到浓缩液；
[0042]
c、将步骤b所得浓缩液加300ml水分散后，上样预装1kg大孔树脂hpd300的玻璃层，依次使用纯化水、浓度为10％的乙醇水溶液除杂后，再使用浓度为95％食用酒精洗脱上样树脂层析柱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到鹰嘴豆芽总富集部位；
[0043]
d、将步骤c所得鹰嘴豆芽总富集部位加入2倍体积水分散后，再加入同体积的乙酸乙酯进行萃取3次、合并萃取液，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到组分1部位重量为5.77g；
[0044]
e、将步骤d所得组分1部位5.3g，加2倍量60目的硅胶拌样，使用40倍100目硅胶湿法装柱，将样品上柱后，直接使用3倍柱体积比10:1的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到组分2部位1.1g；
[0045]
f、将步骤e所得组分2部位100mg加入浓度为60％乙腈水溶液溶解，将溶解物利用反相色谱柱，turner hplc columns kromasil 100a c18 5μm 15
×
250mm；溶剂为30％的乙腈水溶液，50min内；流速：3ml/min进行分离，收集出峰时间为35.5min，紫外波长210nm 下有强吸收的化合物1，该化合物紫外吸收基线降低后，紧接又出在紫外波长210nm下有强吸
收，峰出峰时间为37min，为化合物2，干燥后即得化合物高丽槐素7.2mg和美迪紫檀素 14.5mg。
[0046]
实施例3
[0047]
a、精选收获一年生的鹰嘴豆种子3kg，确保每粒颗粒完整、饱满，放入温度30℃的温水中浸泡，每隔2小时换新鲜水1次，共浸泡7小时，共换水4次；之后将鹰嘴豆种子放入温度、湿度恒定的豆芽箱中发芽，每隔10小时淋水冲洗30s，96小时后，摘取豆芽；
[0048]
b、将步骤a所得摘取豆芽按重量体积比1:25放入浓度为70％乙醇中，加热回流提取2小时，提取3次，合并提取液，浓缩，得到浓缩液；
[0049]
c、将步骤b所得浓缩液加200ml水分散后，上样预装1kg大孔树脂hpd300的玻璃层析柱，依次使用纯化水、浓度为10％的乙醇水溶液除杂后，再使用浓度为95％食用酒精洗脱除杂后上样树脂层析柱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到鹰嘴豆芽总富集部位；
[0050]
d、将步骤c所得鹰嘴豆芽总富集部位加入2倍体积水分散后，再加入同体积的乙酸乙酯进行萃取5次、合并萃取液，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到组分1部位重量为4.53g；
[0051]
e、将步骤d所得组分1部位4.3g，加3倍量60目的硅胶拌样，使用40倍100目硅胶湿法装柱，将样品上柱后，直接使用3倍柱体积比10:1的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到组分2部位0.91g；
[0052]
f、将步骤e所得组分2部位100mg加入浓度为70％乙腈水溶液溶解，将溶解物利用反相色谱柱，溶剂为40％的乙腈水溶液，50min内；流速：3ml/min进行分离，收集出峰时间约为35.5min，紫外波长210nm下有强吸收的化合物1，该化合物紫外吸收基线降低后，紧接又出在紫外波长210nm下有强吸收，峰出峰时间约为37min，为化合物2，干燥后即得化合物高丽槐素8.7mg和美迪紫檀素13.5mg。
[0053]
实施例4
[0054]
a、精选收获一年生的鹰嘴豆种子2kg，确保每粒颗粒完整、饱满，放入温度30℃的温水中浸泡，每隔1小时换新鲜水1次，共浸泡6小时，共换水4次；之后将鹰嘴豆种子放入温度、湿度恒定的豆芽箱中发芽，每隔10小时淋水冲洗30s，85小时后，摘取豆芽；
[0055]
b、将步骤a所得摘取豆芽按重量体积比1:25放入浓度为70％乙醇中，加热回流提取2小时，提取3次，合并提取液，浓缩，得到浓缩液；
[0056]
c、将步骤b所得浓缩液加100ml水分散后，上样预装0.5kg大孔树脂hpd300的玻璃层析柱，依次使用纯化水、浓度为10％的乙醇水溶液除杂后，再使用浓度为95％食用酒精洗脱除杂后上样树脂层析柱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到鹰嘴豆芽总富集部位；
[0057]
d、将步骤c所得鹰嘴豆芽总富集部位加入2倍体积水分散后，再加入同体积的乙酸乙酯进行萃取3次、合并萃取液，将所得乙酸乙酯部位浓缩、干燥，得到组分1部位重量为3.08g；
[0058]
e、将步骤d所得组分1部位2.9g，加4倍量60目的硅胶拌样，使用40倍100目硅胶湿法装柱，将样品上柱后，直接使用3倍柱体积比10:1的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到组分2部位0.63g；
[0059]
f、将步骤e所得组分2部位100mg加入浓度为70％乙腈水溶液溶解，将溶解物利用反相色谱柱，turner hplc columns kromasil 100a c18 5μm 15
×
250mm，溶剂为56％的乙
腈水溶液，50min内；流速：3ml/min进行分离，收集出峰时间为34min，紫外波长210nm下有强吸收的化合物1，该化合物紫外吸收基线降低后，紧接又出在紫外波长210nm下有强吸收，峰出峰时间为36min，为化合物2，干燥后，即得化合物1为高丽槐素7.4mg、化合物2 为美迪紫檀素13.3mg。
[0060]
实施例5
[0061]
分别取50mg鹰嘴豆芽总富集部位(ics)和组分2(zf)，使用体积1ml的二甲基亚砜(dmso) 溶解配置成50mg/ml浓度的溶液，进行穴孔抗菌活性检测：
[0062]
检测方法：穴孔抑菌操作：融化琼脂培养基，待其温度降至46
±
0.5℃，加入已培养好的菌液，使试验菌悬液浓度为5
×
105cfu/ml-5
×
106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20min 使其凝固，用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距 25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上，每孔加样品溶液20μl，盖好平皿，置于温度 37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录；评价：抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用，抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用；
[0063]
检测结果：
[0064]
表3：抗菌活性检测
[0065][0066]
抗菌实验(孔穴)：白色链球菌(atcc10231)；大肠杆菌(atcc11229)；金黄色葡萄球菌 (atcc6538)
[0067]
实验菌株：
[0068]
(1)白色链球菌：candida albicans(ca)；(2)大肠杆菌：e.coli(ec)；(3)金黄色葡萄球菌：staphylococcus aureus(sa)；
[0069]
(4)实验用抗生素：氨苄青霉素钠盐：ampicillin sodiumm salt(amp)，fw 371.39；两性霉素b：amphotericin b，分子量924.08。