提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用

提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用。


背景技术：

2.l-苹果酸广泛应用于在食品、制药和其他工业。美国能源部(doe)已经将苹果酸确定为可再生和大规模生产的十二种平台化学品之一。l-苹果酸的生产方法有化学合成法、酶固定化催化法和微生物发酵法，从环保和经济价值角度而言，通过构建基因工程菌发酵产苹果酸是最具发展潜力，也是各大企业角逐的热点。
3.谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)是经典的食品安全微生物，用于多种有机酸的合成，如亮氨酸、赖氨酸等。富马酸酶(fumarase c，fumc)是谷氨酸棒杆菌的tca循环中的一个关键酶，编码基因为fumc，该酶负责催化富马酸(又称延胡索酸)转变成l-苹果酸这一可逆水合反应。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法；主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。在分子对接技术的辅助下，选择合适的突变位点，通过基因工程改造富马酸酶，实现富马酸酶的单向催化，提高l-苹果酸产量，具有较好的可行性和研究价值。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其与苹果酸底物的结合力弱，实现富马酸酶的单向催化，提高l-苹果酸产量。
5.本发明的目的之二在于提供一种提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体在生产l-苹果酸中的应用。
6.本发明的目的之三在于提供一种提高l-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，得到重组谷氨酸棒杆菌，用于催化富马酸生成l-苹果酸，可提高发酵法生产l-苹果酸的产量。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
8.一种提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体，由富马酸酶在马酸酶与苹果酸之间的结合位点上定点突变而成，所述富马酸酶突变体用于富马酸单向转化成苹果酸。
9.进一步地，富马酸酶突变体由氨基酸序列如seq id no:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸、第124位的组氨酸和第323位的脯氨酸进行单突变或多突变获得。
10.进一步地，所述富马酸酶突变体为下列之一：
11.(1)如seq id no:1所示的富马酸酶中第124位的组氨酸突变为天冬酰胺；
12.(2)如seq id no:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为天冬氨酸或谷氨
8-12mg/l、feso4·
7h2o 8-12mg/l、znso4·
7h2o 0.5-1.5mg/l、mnso4·
7h2o 8-12mg/l、nicl2·
6h2o 0.01-0.03mg/l。
39.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
40.本发明的提高谷氨酸棒杆菌l-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其与苹果酸底物的结合力弱，进而抑制富马酸酶催化苹果酸转化成富马酸，实现富马酸酶的单向催化富马酸转换成苹果酸，从而提高l-苹果酸产量。
41.本发明的提高l-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，构建重组谷氨酸棒状杆菌，可发酵生产l-苹果酸，性能稳定，生产效率高。
附图说明
42.图1是本发明的实施例1中同源建模富马酸酶三维结果图；
43.图2是本发明的实施例1中富马酸酶与苹果酸分子对接位点图；
44.图3是本发明的实施例1中富马酸酶与苹果酸对接模型突变氨基酸稳定性亲和力图；
45.图4是本发明的实施例2中重组质粒pec-xk99e-fumc-k320d酶切验证图；
46.图5是本发明的实施例2中扩增fumc-k320d上下游及目的片段跑胶图；
47.图6是本发明的实施例4中各重组菌株发酵生长情况图；
48.图7是本发明的实施例4中各重组菌株蛋白含量分析和富马酸酶活分析对比图；
49.图8是本发明的实施例4中重组pec-xk99e-fumc-k320d发酵产酸分析图。
具体实施方式
50.下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
51.实施例1
52.确定富马酸酶基因点突变位点
53.1、获得模拟富马酸酶蛋白结构模型
54.获取c.glutamicum atcc 13032chromosome c1064117-1061708序列为同源建模的模板序列，其氨基酸序列如seq id no:1所示的，使用swiss-model在线建模，得到富马酸酶模拟三维蛋白结构c0309，如图1所示。
55.2、模拟对接
56.以同源建模c0309为基础并作为受体，以小分子苹果酸为配体，借助分子对接软件完成模拟对接，用pymol得到分子对接模型，如图2所示。
57.3、确定突变位点
58.以富马酸酶与苹果酸的分子对接模型为基础，对其进行丙氨酸扫描，选出突变前后稳定性变化大的氨基酸组，然后对这一组氨基酸进行饱和突变，挑选出合适的位点进行实际突变，这里选出的突变位点为320位赖氨酸(lys，k)，124位组氨酸(his，h)、323位脯氨酸(pro,p)。从图3的稳定性亲和力图可以看出，突变结果较好的分别为
59.h124n：第124位的组氨酸(his，h)突变为天冬酰胺(asn，n)；
60.k320d/k320e：第320位的赖氨酸(lys，k)突变为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e),
61.p323d/p323e：第323位的脯氨酸(pro,p)突变为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)以及k320e-p323d，k320d-p323d的多点突变。
62.实施例2
63.构建表达载体
64.1、构建pec-xk99e-fumc表达载体
65.以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组dna为模板，其核苷酸序列如seq id no:2所示的，根据引物设计目的基因，参照seq id no:10-11，引物设计如下：
66.pec1：5
’‑
ctcggtacccggggatccatgaccgagcaggaattccgt-3’67.pec4：5
’‑
gtcgactctagaggatccttagaacttgttctcgcgctc-3’。
68.扩增目的片段所用酶均为高保真prime star mastermix聚合酶，反应体系为25μl：高保真酶12.5μl，模板1μl，上下引物各1μl，ddh2o补齐。
69.pcr扩增反应条件为：95℃预变形10min；94℃变性30s；58℃中低温退火15s；72℃延伸15s；循环数为35次；最后72℃延伸10min；4℃保温。
70.pcr获得的目的片段，与经过bamhⅰ限制性内切酶酶切过后的pec-xk99e载体进行重组连接，转化大肠杆菌jm109感受态后在卡那霉素抗性lb平板筛选转化子，得到pec-xk99e-fumc表达载体。
71.其中，大肠杆菌jm109培养温度为37℃，所用培养基为lb培养基(酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l；固体培养基添加琼脂粉16g/l)。
72.2、构建富马酸酶突变体的表达载体
73.以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组dna为模板，其核苷酸序列如seq id no:1所示的，根据突变引物设计突变目的基因，引物设计如表1所示。
74.表1
[0075][0076]
突变目的基因得到的富马酸酶突变体，包括：
[0077]
fumc-h124n突变体，其核苷酸序列如seq id no:3所示；
[0078]
fumc-k320d突变体，其核苷酸序列如seq id no:4所示；
[0079]
fumc-p323d突变体，其核苷酸序列如seq id no:5所示；
[0080]
fumc-p323e突变体，其核苷酸序列如seq id no:6所示；
[0081]
fumc-k320e突变体，其核苷酸序列如seq id no:7所示；
[0082]
fumc-k320d-p323d突变体，其核酸序列如seq id no:8所示；
[0083]
fumc-k320e-p323d突变体，其核酸序列如seq id no:9所示。
[0084]
扩增目的片段所用酶均为高保真prime star mastermix聚合酶，反应体系为25μl：高保真酶12.5μl，模板1μl，上下引物各1μl，ddh2o补齐。
[0085]
pcr扩增反应条件为：95℃预变形10min；94℃变性30s；58℃中低温退火15s；72℃延伸15s；循环数为35次；最后72℃延伸10min；4℃保温。pcr获得的上下游同源臂，再经过一次融合pcr得到目的片段，与经过bamhⅰ限制性内切酶酶切过后的pec-xk99e载体进行重组连接，转化大肠杆菌jm109感受态后在卡那霉素抗性lb平板筛选转化子，得到pec-xk99e-fumc-k320d表达载体。
[0086]
图4所示为重组质粒pec-xk99e-fumc-k320d构建验证图，图5所示扩增fumc-k320d上下游及目的片段检测图。
[0087]
同理，制得：
[0088]
pec-xk99e-fumc-h124n；pec-xk99e-fumc-p323d；pec-xk99e-fumc-p323e；
[0089]
pec-xk99e-fumc-k320e；pec-xk99e-fumc-k320d-p323d；
[0090]
pec-xk99e-fumc-k320e-p323d等富马酸酶突变体的表达载体。
[0091]
实施例3
[0092]
构建重组谷氨酸棒杆菌菌株
[0093]
制备富马酸酶突变体和pec-xk99e-fumc表达载体，用电转法转化到谷氨酸棒状杆菌atcc 13032 c10感受态，涂布于含卡那霉素的lbhis平板，30℃培养约48h。随机挑取若干转化子，于ytg培养基中培养后，提取质粒并进行鉴定，证明重组谷氨酸棒状杆菌构建成功。
[0094]
其中，谷氨酸棒状杆菌所用感受态培养基为：酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，甘氨酸25g/l，吐温80 1g/l，异烟肼4g/l。
[0095]
谷氨酸棒状杆菌电转化恢复用lbhis培养基为：蛋白胨5g/l，酵母膏2.5g/l，氯化钠5g/l，脑心浸液18.5g/l，山梨醇91g/l；固体培养基添加琼脂粉16g/l。
[0096]
实施例4
[0097]
重组谷氨酸棒杆菌发酵产苹果酸
[0098]
对成功获得的重组谷氨酸棒杆菌和c10/pec-xk99e-fumc重组谷氨酸棒杆菌对照组进行摇瓶发酵对比。
[0099]
1、l-苹果酸的生产方法，包括以下步骤：
[0100]
1)将重组谷氨酸棒状杆菌接种至种子培养基中培养，得到种子液；其中，温度30℃，摇瓶的速率为180rpm，培养时间为24h；
[0101]
2)将所述种子液转送至发酵培养基中，发酵，收集产物得到l-苹果酸；温度30℃，发酵24h以内的摇瓶速率为200rpm，发酵24h以上的摇瓶速率为90rpm；发酵过程中每12h取一次样并补料khco3和葡萄糖。
[0102]
种子培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨16g/l，酵母粉10g/l，氯化钠5g/l。
[0103]
发酵培养基：(nh4)2so
4 20g/l、mopes 40g/l、尿素5g/l、kh2po
4 1g/l、k2hpo
4 1g/l、glucose 40g/l、生物素0.03mg/l、原儿茶酸0.03mg/l、mgso4·
7h2o 0.25g/l、cuso
4 0.2mg/l、cacl
2 10mg/l、feso4·
7h2o 10mg/l、znso4·
7h2o 1mg/l、mnso4·
7h2o 10mg/l、nicl2·
6h2o 0.02mg/l。
[0104]
2、测菌株生物量、残糖量和l-苹果酸及其他酸的产量。结果如图6-8所示。
[0105]
其中，细菌生长曲线的检测：利用菌体光密度法对重组菌株发酵过程生物量进行测定。具体操作如下：
[0106]
(1)首先在无菌操作台进行发酵培养基取样，用移液枪取200μl发酵液至2ml ep管中；
[0107]
(2)对发酵样品使用蒸馏水进行稀释，稀释倍数视菌体密度而定，至终浓度在分光光度计的额定量程内即可(0.2～0.8)；
[0108]
(3)开机分光光度计，设定吸光波长为600nm，并预热仪器30min；
[0109]
(4)在石英比色皿中倒入去离子水，归零分光光度计度数；
[0110]
(5)将稀释样品置入石英比色皿中，利用仪器测量吸光值，并记录读数；
[0111]
(6)将仪器读数按照稀释倍数放大，所得数据即为发酵工程菌的生物量水平。
[0112]
l-苹果酸的检测方法：发酵培养基中l-苹果酸的含量使用高效液相色谱即hplc测定，其操作条件设置为：安捷伦1100型，柱子型号为agilent zorba eclipse xdb-c18(5μm、4.6nm
×
250nm)；流动相为20mmol/l的kh2po4(ph＝2.8)，流动相流速：0.5ml/min，紫外检测
波长：210nm，柱温：25℃。
[0113]
分析图6可以看出，在同一发酵条件下，各重组菌株生长情况没有明显差异，说明富马酸酶分子改造对谷氨酸棒杆菌的生长没有明显影响，这对于后续发酵培养积累目标产物是有利的。
[0114]
分析图7可以看出，各重组菌株胞内蛋白总量几乎一致，但各菌株的富马酸酶酶活性却呈现较大差异，其中过表达野生型富马酸酶，其相对酶活为47.42u/mg，过表达双突变型富马酸酶(k320e-p323d)的重组菌株，其相对酶活酶活最高，达到64.66u/mg，相对于过表达野生型富马酸酶，酶活提高了36.35％，其次是过表达单突变型富马酸酶(k320d)的重组菌株，其相对酶活为62.91u/mg，相对于野生型富马酸酶，酶活提高了32.66％。其余突变重组菌株fumc(h124n)、fumc(k320d)、fumc(k320e)、fumc(k320d-p323d)、fumc(k320e-p323d)与野生型fumc相比，酶活都有所提高，只有fumc(p323e)和fumc(p323d)这两株菌的富马酸酶酶活下调。
[0115]
分析图8可以看出，在c10菌株中，过表达野生型fumc，苹果酸产量为18.968g/l；过表达单突变fumc(k320d)的重组菌株，苹果酸产量达33.194g/l，单突变fumc(k320e)的重组菌株，苹果酸产量仅次于fumc(k320d)，为30.17g/l，单突变fumc(h124n)苹果酸产量为23.58g/l，另外单突变fumc(p323e)和单突变fumc(p323d)对苹果酸产量还有些微量下调，其苹果酸产量分别为17.9g/l和18.26g/l；而过表达双突变型fumc(k320e-p323d)，重组菌株产苹果酸产量最高达到39.48g/l，提高了108％，说明双突变对苹果酸的生成具有协同效应。
[0116]
综上，本发明的重组谷氨酸棒杆菌，通过对谷氨酸棒杆菌tca循环中催化苹果酸和富马酸可逆反应的关键酶富马酸酶进行分子改造，改变富马酸酶和底物苹果酸的结合力，实现富马酸酶主要催化富马酸转化成苹果酸，从而提高重组谷氨酸棒杆菌苹果酸的产量。
[0117]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。