一种具有免疫调节功能的灵芝高活性多糖的制备方法

1.本发明公开一种具有调节免疫功能的灵芝高活性多糖，具有提升机体免疫活性的功效，同时还提供了一种具有免疫调节功能的灵芝高活性多糖的制备方法，涉及多糖纯化及活性研究领域。


背景技术：

2.免疫是指机体免疫系统识别自身与异已物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。免疫调节是维持机体内环境稳定的关键，如果免疫调节功能异常，对自身成分产生强烈的免疫攻击，造成细胞破坏，功能丧失，就会产生自身免疫疾病。如果对外界病原微生物感染不能产生适度的反应，也可造成对机体的有害作用。当免疫自稳功能过高时，可能会患类风湿关节炎、红斑狼疮、类风湿心脏病等；当免疫防御功能过高时，会出现过敏反应，过低则会患免疫缺陷病；免疫监视功能过低时，可能会形成肿瘤等。
3.近年来，多糖的免疫调节功能被广泛研究，据研究，灵芝多糖具有较好的免疫调节活性，但对灵芝多糖的活性组分并无细致研究，导致目前得到的灵芝多糖免疫活性平庸，因此，从灵芝多糖中分离出高活性的多糖组分，被认为是开发高效的提升免疫的产品的新思路。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的是提供一种具有免疫调节功能的灵芝高活性多糖的制备方法，以解决目前得到的灵芝多糖免疫活性平庸的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明的目的在于提供一种具有提高免疫功能的灵芝高活性多糖的制备与纯化方法，以灵芝子实体为原料，以提高免疫活性为评价标准，通过提取、分离纯化得到一种新的灵芝高活性多糖，并对其免疫活性进行探究。
6.本发明提供一种具有提高免疫功能的灵芝高活性多糖的制备方法，步骤如下：
7.第一步：灵芝子实体经干燥后粉碎过筛，采用连续相变萃取技术制备灵芝多糖提取液，工艺参数为：萃取时间180min、萃取温度100℃、萃取溶剂水流速28l/h，得到灵芝多糖提取液。
8.第二步：第一步中的灵芝水提液用60％乙醇进行醇沉过夜，收集沉淀后将沉淀复溶，再次加入60％乙醇并将混合液调ph至7过夜。
9.第三步：将第二步中得到的沉淀复溶，过超滤膜，收集未过膜组分冻干，得到灵芝高活性多糖。
10.本发明所述的一种具有提高免疫功能的灵芝高活性多糖的制备方法，步骤如下：
11.1)灵芝子实体干燥后进行切片粉碎，过筛，放入连续相变萃取装置中用水进行提取，萃取时间为180min，温度100℃，萃取流速28l/h。
12.2)灵芝水体液中加入60％乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，即为灵芝粗多糖，称为glp。
13.3)将沉淀用水复溶，再次加入60％乙醇，搅拌均匀后调节ph为7，过夜。
14.4)离心得到沉淀，将沉淀复溶，先过80um滤膜，收集滤出液。
15.5)滤出液过vivaflow50超滤膜，膜分子量为100kda。
16.6)过膜得到截留液和滤出液两个组分，收集截留液，弃去滤出液。
17.7)滤出液浓缩，冻干即获得灵芝高活性多糖(rglp-1)。
18.综上所述，本发明主要具有以下有益效果：
19.本发明提供一种具有提高免疫功能的灵芝高活性多糖，为一种新的多糖物质，具有提高免疫功能，能够改善免疫相关生化指标，可以用于制备提高免疫的食品药品及保健品。
附图说明
20.图1为本发明的葡聚糖标准品洗脱曲线及拟合方程；
21.图2为本发明的灵芝多糖gpc洗脱曲线；
22.图3为本发明的灵芝多糖gpc洗脱曲线；
23.图4为本发明的分级醇沉后分布；
24.图5为本发明的调ph后分布；
25.图6为本发明的最终gpc谱图；
26.图7为本发明的灵芝大分子多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响；
27.图8为本发明的灵芝大分子多糖对巨噬细胞分泌il-6含量的影响；
28.图9为本发明的灵芝大分子多糖对巨噬细胞分泌tnf-α含量的影响；
29.图10为本发明的灵芝大分子多糖对巨噬细胞分泌no含量的影响。
30.图中：1、；2、；3、；4、；5、；6、；7、；8、；9、；10、；11、； 12、；13、；14、；15、；16、；17、；18、；19、；20、；21、；22、； 23、；24、；25、；26、。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
32.下面根据本发明的整体结构，对其实施例进行说明。
33.一种具有免疫调节功能的灵芝高活性多糖的制备方法，如图1-10所示。
34.(1)葡聚糖标准曲线的制作
35.采用岛津高效液相色谱仪配备示差折光检测器，凝胶色谱柱tskgelg6000 pwxl与tskgel g 3000pwxl串联，流动相为纯水，流速为0.6ml/min，检测时间为35min，柱温为35℃，上样体积为20μl，称取相对分子量为5
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103、2.5
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104、5
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104、8
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104、1.5
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105、2.7
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105、4.1
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105、 6.7
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105以及1.8
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106da的葡聚糖标准品用流动相溶解后过0.45μm滤膜进样，记录色谱图，得到葡聚糖分子量对数lg m与洗脱体积的曲线，并对曲线进行线性拟合，用于确定待测样品多糖相对分子量分布范围。
36.(2)灵芝多糖水提液制备
37.1)灵芝子实体干燥后进行切片粉碎，过筛，放入连续相变萃取装置中用水进行提取，萃取时间为180min，温度100℃，萃取流速28l/h。得到灵芝多糖水提液。
38.(3)最适醇沉浓度探究
39.灵芝水体液分成相同的七份，分别加入20％-80％乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，采用高效液相色谱仪配备示差折光检测器，凝胶色谱柱tskgelg6000 pwxl与tskgel g 3000pwxl串联测定多糖分子量分布，根据制作的葡聚糖标准曲线确定目标段占比，最终得到60％醇沉可达到最佳效果。
40.(4)最适ph值探究
41.将灵芝水体液加入60％乙醇进行沉淀，4℃过夜，离心得到沉淀，将沉淀复溶，将沉淀复溶液分成相同的八份，分别加入60％乙醇沉淀，并调ph至 3-10，采用高效液相色谱仪配备示差折光检测器，凝胶色谱柱tskgel g6000 pwxl与tskgel g 3000pwxl串联测定多糖分子量分布，根据制作的葡聚糖标准曲线确定目标段占比，最终得到ph为7时可达到最佳效果。
42.(5)超滤膜分离
43.将灵芝水提液采用上述乙醇浓度及ph值进行分离纯化，收集沉淀得到灵芝高活性多糖中间物，将沉淀复溶，先过80um滤膜，收集滤出液，滤出液过 vivaflow50超滤膜，膜分子量为100kda，过膜得到截留液和滤出液两个组分，收集截留液，弃去滤出液，滤出液浓缩，冻干即获得灵芝高活性多糖(rglp-1)。
44.(6)灵芝高活性多糖调节免疫功能活性研究
45.1)对照组的制备：
46.glp的制备：灵芝子实体干燥后进行切片粉碎，过筛，放入连续相变萃取装置中用水进行提取，萃取时间为180min，温度100℃，萃取流速28l/h，灵芝水体液中加入60％乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，即为灵芝粗多糖，称为glp。
47.rglp的制备：灵芝子实体干燥后进行切片粉碎，过筛，放入连续相变萃取装置中用水进行提取，萃取时间为180min，温度100℃，萃取流速28l/h。灵芝水体液中加入80％乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，将沉淀复溶后过vivaflow50超滤膜，收集截留液部分，浓缩动干，即为rglp。
48.2)灵芝多糖对raw264.7细胞吞噬能力的影响：
49.将样品glp、rglp及rglp-1分别用完全培养基配制成一系列浓度梯度： 0、2、5、10μg/ml；收集对数期的细胞，调整细胞悬液浓度5
×
104个/ml，每孔加入200μl铺板；然后在5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，弃掉上清液，实验组加入200μl不同浓度的多糖提取液，阳性对照组为加1 μg/ml的lps的完全培养液、空白正常对照组加入完全培养液；5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，弃上清，然后加入0.1％的中性红溶液200μl/孔，培养3h后，弃上清，pbs洗涤3次后每孔加入100μl细胞裂解液(乙酸：无水乙醇＝1:1，v/v),置于低速振荡上10min，待细胞完全裂解后于540 nm处测定吸光值并计算吞噬率(alboofetileh,m,rezaei,m and tabarsa, m,et al.,2019)。吞噬率公式如下：
50.吞噬率(％)＝a实验组/a空白组
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100。
51.3)灵芝多糖对raw264.7细胞的no分泌的影响：
52.将样品glp、rglp及rglp-1分别用完全培养基配制成一系列浓度梯度： 0、2、5、10μg/ml；收集对数期的细胞，调整细胞悬液浓度5
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104个/ml，每孔加入200μl铺板；然后在5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，弃掉上清液，实验组加入200μl不同浓度的多糖提取液，阳性对照组为加1 μg/ml lps的完全培养液、空白对照组加入完全培养液；(4)5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，收集细胞上清100μl，按照试剂盒操作加入griessa 50μl,griess b 50μl，置于低速振荡上10min，然后在酶标仪上于540 nm测仪处测量各孔的吸光值，按照no测定试剂盒的说明测定细胞no释放量。
53.4)灵芝多糖对raw264.7细胞的tnf-α及il-6分泌的影响：
54.将样品glp、rglp及rglp-1分别用完全培养基配制成一系列浓度梯度： 0、2、5、10μg/ml；收集对数期的细胞，调整细胞悬液浓度5
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104个/ml，每孔加入200μl铺板，然后在5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，弃掉上清液，实验组加入200μl不同浓度的多糖提取液，阳性对照组为加1 μg/ml lps的完全培养液、空白对照组加入完全培养液；(4)5％co2，37℃孵育培养箱中培养24h，收集细胞上清100μl。按试剂盒操作方法在酶标仪上于490nm测仪处测量各孔的吸光值，并计算tnf-α、il-6释放量。
55.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，但本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对发明的限制，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合，本领域技术人员在阅读完本说明书后可在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，可以根据需要对实施例做出没有创造性贡献的修改、替换和变型等，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。