检测大豆转基因成分的引物对组合、试剂盒及检测方法

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种检测大豆转基因成分的引物对组合、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.大豆是全球普遍种植的作物，含有丰富的植物蛋白和食用油脂，是重要的食用、饲用和油料作物。在当前难以大幅增加大豆种植面积的背景下，利用现代生物技术培育高产优质转基因大豆新品种，对于促进大豆产业振兴具有十分重要的意义。但随着大量的转基因大豆被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性问题的日益关注，农产品中的转基因成分检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。因此，开发高效、便捷的转基因食品检测技术显得至关重要。
3.转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。目前基于核酸的pcr检测方法仍是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，其主要包括普通定性pcr、巢式pcr、环介导等温扩增技术(lamp)、荧光定量pcr多重pcr等方法。相对于普通定性pcr方法，巢式pcr高了检测的灵敏度，容易造成假阳性。lamp操作简单、特异性强，然而引物设计较为复杂，容易造成dna污染，影响后续的实验。荧光定量pcr方法具有重复性好、灵敏度高、核酸交叉污染少的优点，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。普通的多重pcr方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但一般不超过六重，否则引物之间干扰较大，影响检测效果。基因芯片和数字pcr技术也是常用的转基因产品检测技术，它们均具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因作物；然而其成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，这些因素限制了该技术在检测中的广泛应用。
4.因此研发一种高效、灵敏和通量高的转基因产品检测方法，成为亟待解决的关键问题。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种检测大豆转基因成分的引物对组合、试剂盒及检测方法，以解决如何高效检测大豆转基因成分的技术问题。
6.第一方面，本技术提供了一种检测大豆转基因成分的引物对组合，所述引物对组合包括：
7.特异性扩增p35s的引物对，其核苷酸序列如seq id no.1至seq id no.2所示；
8.特异性扩增t35s的引物对，其核苷酸序列如seq id no.3至seq id no.4所示；
9.特异性扩增pnos的引物对，其核苷酸序列如seq id no.5至seq id no.6所示；
10.特异性扩增tnos的引物对，其核苷酸序列如seq id no.7至seq id no.8所示；
11.特异性扩增tpinⅱ的引物对，其核苷酸序列如seq id no.9至seq id no.10所示；
12.特异性扩增prbcs4的引物对，其核苷酸序列如seq id no.11至seq id no.12所
no.62所示；
38.特异性扩增h3at-intron的引物对，其核苷酸序列如seq id no.63至seq id no.64所示；
39.特异性扩增ph4a748的引物对，其核苷酸序列如seq id no.65至seq id no.66所示；
40.特异性扩增2mepsps的引物对，其核苷酸序列如seq id no.67至seq id no.68所示；
41.特异性扩增cp4epsps的引物对，其核苷酸序列如seq id no.69至seq id no.70所示；
42.特异性扩增patubiquittin10的引物对，其核苷酸序列如seq id no.71至seq id no.72所示；
43.和/或，特异性扩增pcsvmv的引物对，其核苷酸序列如seq id no.73至seq id no.74所示。
44.可选的，所述引物对组合还包括用于扩增大豆内参基因gm_lectin_control的引物对。
45.可选的，扩增大豆内参基因gm_lectin_control的引物对的两对引物，其核苷酸序列如seq id no.75-seq id no.78所示。
46.可选的，所述引物对组合包括特异性扩增选自下组的大豆转基因元件的引物对：p35s、t35s、pnos、tnos、tpinⅱ、prbcs4、te9、t7s、pat、ptsf1、tsf1、gat、cry1ab-ac、cry1a.105、gm-hra、gm-als、cry2ab、pcisv、atcsr1-2、tatahasl、dmo、torf23、atrbcs-transit-peptide、aad-12、torf1、pfmv35s、cry1f、ctp2、tev-5utr、hppdpf、h4a-terminator、h3at-intron、ph4a748、2mepsps、cp4epsps、patubiquittin10和pcsvmv。
47.第二方面，一种检测大豆转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测大豆转基因成分的所述引物对组合。
48.可选的，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述引物对组合。
49.可选的，所述试剂盒还包括多重pcr预混液。
50.第三方面，提供了第一方面所述的引物对组合、第二方面所述的检测试剂盒在检测转基因大豆及其相关产品中的应用。
51.第四方面，一种检测大豆转基因成分的方法，所述方法包括以下步骤：
52.得到待测大豆的dna和第一方面所述的引物对组合；
53.以所述dna为模板，将所述引物对组合加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；
54.将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；
55.将所述高通量文库中的基因序列进行分析，得到检测大豆转基因成分的结果。
56.可选的，反应体系包括：总体系为30-50μl；引物对：2-5μl；2
×
buffer：15-30ul；多重扩增酶：0.5-1μl；余量为水。
57.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
58.本技术实施例提供的所述引物对组合，引物组合的核苷酸序列为核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.78所示。所述引物对组合的扩增产物可以进行一次高通量测序和
分析，得到多个检测结果，包括转基因成分、判断待测样品中是否含有靶标分子、确定待测样品中内参基因与靶标分子的拷贝数目，以确定外源基因的含量；避免了传统real-time pcr技术一次只能实现一个目的，需要进行多次扩增和检测才能覆盖样本中的多个靶标转基因成分，避免了现有技术在进行多重pcr时，出现较多的假阳性和假阴性结果，可以进行9个以上的pcr反应，可以通过一次高通量测序和分析完成样品中多个靶标分子的同时检测，大大提高了检测效率，同时兼顾了检测通量与成本。
附图说明
59.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
60.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
61.图1为本技术实施例提供的一种检测大豆转基因成分的方法的流程示意图；
62.图2为本技术实施例提供的转基因品系das-44406-6的结构示意图。
具体实施方式
63.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
64.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。例如，室温可以是指10～35℃区间内的温度。
65.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
66.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
67.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种检测大豆转基因成分的引物对组合，所述引物对组合包括：特异性扩增p35s的引物对，其核苷酸序列如seq id no.1至seq id no.2所示；
68.特异性扩增t35s的引物对，其核苷酸序列如seq id no.3至seq id no.4所示；
69.特异性扩增pnos的引物对，其核苷酸序列如seq id no.5至seq id no.6所示；
70.特异性扩增tnos的引物对，其核苷酸序列如seq id no.7至seq id no.8所示；
71.特异性扩增tpinⅱ的引物对，其核苷酸序列如seq id no.9至seq id no.10所示；
72.特异性扩增prbcs4的引物对，其核苷酸序列如seq id no.11至seq id no.12所示；
73.特异性扩增te9的引物对，其核苷酸序列如seq id no.13至seq id no.14所示；
no.64所示；
99.特异性扩增ph4a748的引物对，其核苷酸序列如seq id no.65至seq id no.66所示；
100.特异性扩增2mepsps的引物对，其核苷酸序列如seq id no.67至seq id no.68所示；
101.特异性扩增cp4epsps的引物对，其核苷酸序列如seq id no.69至seq id no.70所示；
102.特异性扩增patubiquittin10的引物对，其核苷酸序列如seq id no.71至seq id no.72所示；
103.和/或，特异性扩增pcsvmv的引物对，其核苷酸序列如seq id no.73至seq id no.74所示。
104.上述引物与其扩增的上述大豆转基因元件核苷酸序列即靶标分子与相应引物对的编号及引物的核苷酸序列具体对应关系如表1所示。
105.表1靶标分子与相应引物对的编号及引物的核苷酸序列。
106.107.108.[0109][0110]
在引物设计时，为了增强所述引物的适用性和灵敏性，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重pcr扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，经使用证实，灵敏度高和适用性强。
[0111]
在一些实施方式中，所述引物对组合还包括用于扩增大豆内参基因gm_lectin_control的引物对。
[0112]
为了实现对样品中大豆转基因成分定量检测的目的，在选用了上述大豆转基因元件时，加入对大豆内参基因的检测引物，进而实现样品中转基因成分含量的定量检测。
[0113]
在一些实施方式中，扩增大豆内参基因gm_lectin_control的引物对的两对引物，其核苷酸序列如seq id no.75-seq id no.78所示。
[0114]
用2对引物对的原因在于避免内参基因的不稳定和dna含量在较低时无法被有效检出。
[0115]
在一些实施方式中，所述引物对组合包括特异性扩增选自下组的大豆转基因元件的引物对：p35s、t35s、pnos、tnos、tpinⅱ、prbcs4、te9、t7s、pat、ptsf1、tsf1、gat、cry1ab-ac、cry1a.105、gm-hra、gm-als、cry2ab、pcisv、atcsr1-2、tatahasl、dmo、torf23、atrbcs-transit-peptide、aad-12、torf1、pfmv35s、cry1f、ctp2、tev-5utr、hppdpf、h4a-terminator、h3at-intron、ph4a748、2mepsps、cp4epsps、patubiquittin10和pcsvmv。
[0116]
本技术实施例中，筛选常用的大豆转基因产品检测元件核苷酸序列即靶标分子及内参基因作为检测目标。包括37种检测常用的转基因元件：p35s、t35s、pnos、tnos、tpinⅱ、prbcs4、te9、t7s、pat、ptsf1、tsf1、gat、cry1ab-ac、cry1a.105、gm-hra、gm-als、cry2ab、pcisv、atcsr1-2、tatahasl、dmo、torf23、atrbcs-transit-peptide、aad-12、torf1、pfmv35s、cry1f、ctp2、tev-5utr、hppdpf、h4a-terminator、h3at-intron、ph4a748、2mepsps、cp4epsps、patubiquittin10和pcsvmv以及包括1大豆内参基因的序列gm_lectin_control。
[0117]
接着，本发明开发了用于检测所述的转基因元件和大豆内参基因的多重pcr引物组合物，其中37对针对37种转基因元件，2对针对1个内参基因。所述引物互相间不冲突，可以通过多重pcr进行高效的扩增。所述多重pcr引物组合物可以用于开发转基因元件检测试剂盒。在现有引物对组合：1-39对的基础上，还可以包括特异性扩增选自下组的大豆转基因元件的引物对，包括但不限于39对以上。后期可根据新收集的转基因元件进行定期增加多重pcr引物的对数组合经验证可达3000对，扩增效果优异；相比常规的8对特异性的多重pcr，具有检测通量和灵敏度高的优势。
[0118]
第二方面，一种检测大豆转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测大豆转基因成分的所述引物对组合。
[0119]
根据具体检测样品的情况适当调整。后期可根据新收集的转基因元件进行定期增加，我们的引物组合尝试过3000对，扩增效果依然很好。为了实现对大豆中的转基因成分进行检测，我们收集了39对常用的大豆转基因元件以及内参基因的序列，所述多重pcr引物的对数范围为：1-39对，相比常规的8对特异性的多重pcr，具有检测通量和灵敏度高的优势。
[0120]
具体地，高通量测序可以是二代测序，也可以是三代测序，得到的高通量文库可以从多个维度分析转基因的成分，包括但不限于我们实施案例中的转基因元件。
[0121]
在一些实施方式中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述引物对组合。
[0122]
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括多重pcr预混液。
[0123]
具体的，多重pcr预混液的组分包括所述大豆的转基因元件和内参基因的各引物组组合时，每条引物按照1:1的比例进行预混，根据不同的实验目的进行各引物的混合，具体实施实例中，每条引物浓度是2nm。
[0124]
第三方面，提供了第一方面所述的引物对组合、第二方面所述的检测试剂盒在检测转基因大豆及其相关产品中的应用。
[0125]
第四方面，一种检测大豆转基因成分的方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
[0126]
s1.得到待测大豆的dna和引物对组合；
[0127]
s2.以所述dna为模板，将所述引物对组合加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；
[0128]
s3.将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；
[0129]
s4.将所述高通量文库中的基因序列进行分析，得到检测大豆转基因成分的结果。
[0130]
具体地，高通量测序可以是二代测序，也可以是三代测序，得到的高通量文库可以从多个维度分析转基因的成分，包括但不限于我们实施案例中的转基因元件。
[0131]
在一些实施方式中，反应体系包括：总体系为30-50μl；引物对：2-5μl；2
×
buffer：15-30ul；多重扩增酶：0.5-1μl；余量为水。
[0132]
优选的，反应体系包括：总体系30μl，引物对：2μl、2
×
buffer：15ul，多重扩增酶：0.5μl；剩余的用水补充；所述高通量文库的浓度大于2ng/ul为合格。
[0133]
优选的，所述高通量文库的浓度大于2ng/ul为合格。
[0134]
优选的，所述扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个touch down循环，(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
[0135]
本发明所提供的试剂盒能灵敏的检测样品中含量为0.05％的转基因成分。
[0136]
本发明的重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间检测结果重现率r＝100％，准确率a＝99.2％。
[0137]
本发明的所述试剂盒在复杂模板中检测多种转基因成分具有高度特异性。
[0138]
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
[0139]
实施例1靶标转基因成分的筛选和多重pcr扩增引物的设计
[0140]
靶标转基因成分即主要是转基因元件以及内参基因，尽可能地从常用的转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有的文献中进行全面收集，以保证检测的特异性和准确性。其中筛选的转基因元件和内参基因的名称如上述表1所示。
[0141]
利用primer3plus设计多重pcr引物，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，这个主要评估引物之间的二聚体，或者引物内部的发夹结构，以及非靶标序列的非特异扩增，评估后的所有引物可以组合成引物池进行多重pcr扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。具体的引物序列包括：seq id no.1～seq id no.78所示。
[0142]
实施例2检测大豆样品是否含有转基因成分
[0143]
1.实验材料：大豆转基因品系das-44406-6(图2)。实验材料转入了h4a-terminator、2mepsps、ph4a748、patubiquittin10、torf23、pcsvmv、aad-12、pat和torf1，其转基因含量为10％，用其作为我们的研究材料。
[0144]
2.dna模板的准备：植物基因组的提取采用的是ctab或天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组dna提取试剂盒(dp350)。本实施例是用天根dna提取试剂盒提取的待测样品dna，每个样品做了三个生物重复。
[0145]
3.pcr扩增、文库构建与测序
[0146]
利用39对多重pcr扩增引物扩增样本的基因组dna；将每个样本的扩增产物连接测序接头和特异样本dna条形码后混合，成为高通量测序文库；利用高通量测序平台检测高通量测序文库并对高通量测序数据进行质量控制。本步骤需要根据检测的准确性、灵敏性等要求，研究调整扩增循环数、测序深度等关键参数；本步骤也可连接三代测序相关课题的步骤，以实现二代测序与三代测序间优势互补。
[0147]
4.结果的判定
[0148]
1)据测试样品中的转基因成分的信号指数s和空白对照中转基因成分的信号指数p判定污染是否可接受，其中：空白对照噪音指数p＝nc/nc，其中nc和nc分别代表空白对照中，转基因成分的测序片段的数量和总测序片段数量。测试样品的信号指数s＝nt/nt，其中，nt和nt分别代表测试样品中，转基因成分的测序片段的数量和总测序片段数量。信噪比＝s/p
[0149]
2)转基因结果的判断
[0150]
利用待测样本dna条形码和同源比对，将每个测序片段分配到每个目标物种的每个靶标位置上，所述的靶标包括转基因元件和内参基因。根据每个靶标位置上的测序序列数目，以实现转基因成分的绝对定量。当比对内参基因和转基因元件上的测序序列超过指定阈值时，定性判定样品中含有转基因成分；当样品中含有转基因成分时，根据转基因元件与内参基因的测序序列的比值，定量判定样品中的外源基因的含量。
[0151]
本实施例中转基因含量的计算公式如(a)所示：
[0152][0153]
ctestdna
ꢀꢀꢀ
——测试样品的转基因含量
[0154]
tti
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
——测试样品中的每种转基因元件的测序序列数目
[0155]
tri
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
——测试样品中检出的每种内参基因片段的测序序列数目
[0156]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
——测试样品中检出的内参基因片段的总数
[0157]nꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
——标准品中检出的转基因元件片段的总数
[0158]
根据本实例，我们共检测了2个样品，每个样品做了三个生物重复，结果如表2所示：阴性样品中常用的启动子和终止子在阴性大豆中也会检测出几个序列，本实例中我们要求测序reads数目小于5条的序列过滤掉。本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。当样品中转基因成分的信噪比大于10，判定样本中检出转基因成分的核酸。
[0159]
表2本实施例2待测样品的转基因检测结果
[0160]
[0161]
[0162][0163]
由表2可知，大豆转基因品系das-44406-6样品中的所有转基因元件在三个重复实验中均被有效检出，而且含量接近于10％；从该表说明我们发明的这个大豆转基因试剂盒可以用来检测转基因产品。
[0164]
实施例3准确性、特异性与灵敏度评估
[0165]
转基因大豆品系das-44406-6和mon89788转基因标准品制备不同质量百分比的转基因样本来评估所开发技术的准确度和灵敏度。具体地，各样本的转基因含量采用质量百分进行稀释，具体地把转基因大豆das-44406-6和mon89788用阴性大豆分别稀释成10％，1％，0.1％，0.05％，0.025％和0.01％的样本，分别对应于转基因品系das-44406-6的稀释样本编号(a1，a2，a3，a4，a5，a6)和mon89788的稀释样本编号(b1，b2，b3，b4，b5，b6)。定性检测的准确度指真阳性与真阴性所占的比例，定量准确度是指多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。特异性又称真阴性率，多次检测检出的真阴性占所有阴性的百分比。灵敏度指在95％置信度下，能够检出的转基因成分的最低含量，即检测下限。按照实施例2的方法进行检测，每个样本三个生物重复，结果如表3所示。同时，得到了大豆品系das-44406-6的基因结构示意图。
[0166]
表3本发明方法的准确性与灵敏度评估。
[0167]
[0168]
[0169]
[0170][0171]
注：+代表检出，－代表未检出，a1和b1代表转基因含量为10％，a2和b2代表转基因含量为1％，
[0172]
a3和b3代表转基因含量为0.1％，a4和b4代表转基因含量为0.05％，a5和b5代表转基因含量为0.025％，a6和b6代表转基因含量为0.01％。
[0173]
由表3可知，所述试剂盒能在转基因含量为0.05％的样本中稳定地检出各转基因元件，而在阴性的样本中未检出任何转基因成分，说明特异性强，所述试剂盒能够明显区分转基因含量为0.05％的样本和阴性样本，具有技术稳定性和转基因含量为0.05％的检测灵敏度。
[0174]
实施例4我们发明的方法在实际检测样品中的应用
[0175]
为了验证本发明的准确性及批量样品转基因检测中的作用，实验室选取了某公司263份未知基因型的大豆叶片样本进行检测，按照实施例2的方法进行检测，并把检测结果与该公司的保存类型进行比较，及统计结果的一致性。分析结果表明在263份测试样品中，只有2份样品的结果不一致，检测结果的一致性高达99.2％，因此较好地证明了我们所发明方法的准确性及良好的应用前景。
[0176]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
[0177]
1)操作简单，经过一次样品前处理，单管pcr扩增，文库构建与测序就可以同步检测多样品或一个样品中多种转基因成分，具有平行分析和多重判断的特点，大大提升了转基因产品的检测效率；
[0178]
2)检验对象全，包含了大豆当前常见的转基因元件序列和转基因品系，并且可以很方便地加入新的检测序列，避免单个靶标扩增失败，提高的了检测的特异性、准确度和灵敏性；
[0179]
3)试剂盒融合二代测序平台进行扩增产物的测序，提高了系统的检测通量和可重复性，并且检测结果可以直接数字化，适用于转基因大豆及其制品的大规模检测。因此，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的大豆转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果重复性好，多样本多靶标序列检测成本低廉，对种子站、农科院所及海关进出口岸的转基因制品检测具有重要应用。
[0180]
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0181]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发
明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。