硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖在诱导性多能干细胞定向分化为心肌细胞中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体是一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1在诱导性多能干细胞定向分化为心肌细胞中的应用。


背景技术：

2.干细胞作为一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，在特定的条件下，能够分化成为不同类型的细胞，进而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞在人体重要组织器官损伤修复及心血管疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病等方面具有巨大的治疗潜力。其中诱导性多能干细胞技术被认为是再生医学领域兴起的一项技术革命，它在疾病模型的构建方面发挥着越来越重要的作用。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,ipscs)由于与供体的遗传背景高度一致，有望成为填补动物和人体研究中间空白的一项有效手段，在疾病防治研究中具有非常广阔的应用前景。
3.ipscs可定向诱导分化成心肌细胞，在心脏体外模型构建、药物筛选和心脏细胞毒性评估以及细胞替代治疗等方面具有潜在的应用价值。然而，目前干细胞心肌分化不但所需的成本较高，同时也存在分化效率较低等不足，从而限制了其进一步的推广应用。因此，寻找并发现能用于ipscs定向心肌细胞分化的高效诱导剂，对于ipsc技术应用于心脏相关疾病的研究、心脏防治药物的开发均具有非常重要的应用价值。
4.寡糖在抗病毒、抗炎、抑制肿瘤、提高机体免疫、防治动脉粥样硬化等过程中起到显著的功效。迄今为止，本发明所涉及硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1在干细胞定向分化为心肌细胞中的作用与功效，尚未见有相关的报道。


技术实现要素：

5.针对上述不足，本发明要解决的技术问题是提供硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1在促进ipscs定向心肌细胞分化中的应用，该发明将为人源诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hipscs)在体外高效诱导分化成为心肌细胞，并为今后应用于临床诊断与治疗提供重要保障。
6.本发明提供了硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1在促进诱导性多能干细胞定向分化为心肌细胞中的应用。
7.具体路线是：如图1所示，将hipscs置于essential 8
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培养基(thermo fisher scientific公司)中，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养；细胞铺板后，当细胞融合率达到90％时，进行诱导分化处理；hipscs先后经历中胚层诱导、心肌祖细胞诱导和心肌细胞分化三个阶段，分化期间保持适当剂量硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6～10μg/ml范围)进行干预，得到稳定分化率在90％以上的心肌细胞；采用胰岛素添加的essential 8
tm
基础培养基将分化后的心肌细胞继续培养至成熟。
8.所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1制备具体分离获取方法如专利(公开号：cn110917208a)中所示，其分子式为glca3man3(so3h)
8-15
，其化学结构：
[0009][0010]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的浓度为0～10μg/ml。
[0011]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的浓度为6～10μg/ml。
[0012]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1为中硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖或高硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖。
[0013]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1为高硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖。
[0014]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的剂型为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
[0015]
进一步地，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的制剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。
[0016]
本发明的有益效果是：采用硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1作为诱导性多能干细胞定向心肌分化的促进因子，可以实现诱导性多能干细胞向心肌细胞的稳定、高效分化，分化率稳定在90％以上。且在达到相同诱导效率的基础上，与其它诱导剂相比，显著了降低了试剂成本。硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖可以提高诱导性多能干细胞定向心肌细胞的分化效率，为诱导干细胞心肌分化提供了一种高效、经济的手段。
附图说明
[0017]
图1：人源诱导性多能干细胞定向心肌分化过程的示意图；
[0018]
图2：正常的人源诱导性多能干细胞的形态图
[0019]
其中标尺大小为100微米；
[0020]
图3：不同浓度硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导6天后心肌细胞分化效率统计结果
[0021]
其中纵坐标—心肌细胞标志物ctnt阳性细胞率
[0022]
横坐标—硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1添加的剂量，从左到右分别为0，2，4，6，8，10μg/ml；
[0023]
图4：硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导hipscs心肌分化的免疫荧光检测结果
[0024]
1—对照组红色荧光nkx2.5阳性细胞(6天)(gm6s1，0μg/ml)
[0025]
2—对照组绿色荧光ctnt阳性细胞(6天)(gm6s1，0μg/ml)
[0026]
3—对照组蓝色荧光细胞核(6天)(gm6s1，0μg/ml)
[0027]
4—对照组1，2和3的叠加图(6天)(gm6s1，0μg/ml)
[0028]
5—硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6μg/ml)诱导组(诱导6天)红色荧光nkx2.5阳性细胞(gm6s1，6μg/ml)
[0029]
6—硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6μg/ml)诱导组(诱导6天)绿色荧光ctnt阳性细胞(gm6s1，6μg/ml)
[0030]
7—硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6μg/ml)诱导组(诱导6天)蓝色荧光细胞核(gm6s1，6μg/ml)
[0031]
8—硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6μg/ml)诱导组(诱导6天)5，6和7的叠加图(gm6s1，6μg/ml)；
[0032]
图5：硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导hipscs心肌分化的流式检测结果
[0033]
其中1—对照组(硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(0μg/ml))(6天)
[0034]
2—诱导组(硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1(6μg/ml))(诱导6天)
[0035]
纵坐标—细胞数量
[0036]
横坐标—ctnt标记的细胞荧光强度。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
[0038]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径市售获得。
[0040]
实施例1：硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖的制备
[0041]
1、甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备
[0042]
将干海带采用30倍质量的蒸馏水100℃下提取3小时，提取液经过过滤，浓缩后，加乙醇至终浓度为75％沉淀，静置12小时后收集沉淀，沉淀经真空干燥得到海带多糖。将海带多糖样品溶于质量浓度为4％的硫酸溶液中(料液比为60mg/ml)加热回流5小时，用氢氧化钡中和至ph＝6～7，离心，上清液浓缩至原始体积的五分之一，浓缩液上活性炭柱层析，首先用蒸馏水平衡，然后用50％～90％乙醇梯度洗脱，将50％～90％乙醇洗脱液浓缩至原始体积的五分之一，蒸去乙醇，直接上bio-gel p4柱层析，分离得到甘露葡萄糖醛酸八糖(gm8)，六糖(gm6)，四糖(gm4)和二糖(gm2)。
[0043]
2、硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的制备
[0044]
将1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体gm6在氮气保护条件下溶于dmf(0.05g/ml)中，再加入2.85g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，中和，sephadex g10脱盐。将洗脱液浓缩，bio-gel p4分离纯化得到gm6s1。质谱结果显示gm6s1为glca3man3(so3h)
8-15
。
[0045]
实施例2：人源诱导多能干细胞干细胞的培养
[0046]
选取人源诱导性多能干细胞(hipscs)，从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库直接购买，将其置于essential 8
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培养基(thermo fisher scientific公司)，并放置于37℃、5％co2条件下的细胞培养箱中进行培养。
[0047]
hipscs细胞状态如图2所示，使用essential 8
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培养基，放置于37℃、5％co2条件
下的细胞培养箱中进行培养，hipscs细胞的形态良好。
[0048]
实施例3：硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1促进hipscs定向分化为心肌细胞
[0049]
在诱导性多能干细胞心肌分化过程中，先后经历了中胚层诱导，心肌祖细胞诱导的生成和心肌分化以及心肌细胞成熟与维持。hipscs铺在六孔板中生长至90％融合时，即诱导分化第0天，将essential 8
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培养基改为分化基础培养基进行培养，其中分化基础培养基主要包含essential 8
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培养基、chir99021(tocris bioscience公司)和iwp2(tocris bioscience公司)。诱导分化第0天：使用含0.5μm chir99021的e8基础培养基替换原先的培养液继续培养24小时。诱导分化第1天：弃上清，加入e8基础培养基培养24小时。诱导分化第2天：弃上清，添加含0.3μm iwp2的e8基础培养基继续培养72小时。诱导分化第5天：弃上清，加入e8基础培养基培养48小时；诱导分化第7天及以上，将含0.15μg/ml胰岛素(sigma-aldrich公司)添加到e8基础培养基中维持诱导后的心肌细胞，后采用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜检测心肌细胞标志物ctnt(developmental studies hybridoma bank公司)和nkx2.5(abcam公司)，计算阳性细胞诱导比率。
[0050]
按照上述诱导方法，我们分别设置硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导组和对照组，硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导组中，诱导第1天至第6天维持硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1存在，硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1添加的剂量在0～10μg/ml(0，2，4，6，8，10μg/ml)范围之间。而对照组中则无需添加硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1，其它条件均和硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1诱导组一致。最后采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术检测心肌细胞标志物ctnt的表达情况及阳性细胞的比率。
[0051]
结果如图3所示，硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1在0～10μg/ml浓度范围内，心肌细胞分化的效率随着硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1的浓度提高而上升，其中硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s浓度开始为4μg/ml时诱导效率可达80％以上，浓度在6～10μg/ml范围内的诱导效率为97.1～98％。
[0052]
实施例4：gm6s1浓度为6μg/ml诱导6天后，免疫荧光检测的心肌细胞标志物ctnt和nkx2.5的表达情况
[0053]
选取激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿，即35毫米玻璃底的培养皿(规格型号:d35-20-1-n，cellvis)，按实施例2中所述方式进行多能干细胞诱导，其中gm6s1诱导浓度为6μg/ml，诱导6天；弃除诱导后的细胞培养上清，dpbs(thermo fisher scientific公司)清洗3次；加入4％多聚甲醛固定15分钟；弃除多聚甲醛，添加dpbs洗3次，加入缓冲液a(10％山羊血清的dpbs缓冲液)，室温下孵育30分钟；弃去缓冲液a，dpbs洗3次；加入1ml缓冲液b(0.2％triton x-100的dpbs缓冲液)孵育10分钟；分别加入1ml一抗抗体(两个心肌细胞特异性标记蛋白：鼠抗ctnt，稀释倍数1:500；兔抗nkx2.5，稀释倍数1:500)，4℃孵育1小时；dpbs洗3次，加入相应的荧光二抗(fitc标记山羊抗小鼠igg(h+l)和pe标记山羊抗兔igg(h+l))，4℃孵育30分钟；dpbs洗1次，加入dapi(thermo fisher scientific公司)进行核染，室温避光孵育15分钟；dpbs洗3次；使用激光共聚焦荧光显微镜下观察、记录和分析。
[0054]
激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，clsm)对上述多能干细胞诱导的心肌细胞进行免疫荧光鉴定。如图4所示，蓝色标记的为细胞核，绿色标记的为ctnt阳性细胞，红色标记为nkx2.5阳性细胞，硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1浓度为6μg/ml，诱导6天后生成的心肌细胞显著表达ctnt和nkx2.5(心肌细胞的两个标志性蛋白)。
[0055]
实施例5：gm6s1浓度为6μg/ml诱导6天后，流式细胞术检测心肌细胞标志物ctnt阳性细胞比率
[0056]
按实施例2中所述方式进行多能干细胞诱导，其中gm6s1诱导浓度为6μg/ml，诱导时间为6天；将诱导后细胞经tryple(thermo fisher scientific公司)消化后，在室温下悬浮于10％的山羊血清(thermo fisher scientific公司)中孵育30分钟；pbs清洗后，分别和一抗抗体(鼠抗ctnt，稀释倍数1:500)在4℃条件下孵育1小时；dpbs清洗3次，加入fitc标记山羊抗小鼠igg(h+l)，4℃孵育30分钟；dpbs洗1次，加入dapi进行核染，室温避光孵育15min；dpbs清洗3次；最后使用流式细胞仪(型号：bd facscanto
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)检测ctnt阳性细胞比率。
[0057]
结果如图5所示，硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖gm6s1浓度为6μg/ml，持续诱导6天后生成的ctnt阳性细胞比例可达97％。
[0058]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。