芳基化偶联剂、荧光染料偶联物及相关应用

本发明涉及蛋白标记领域，具体而言，涉及一种芳基化偶联剂、荧光染料偶联物及相关应用。

背景技术：

1、荧光成像技术的发展同时依赖于荧光显微镜和荧光染料的共同进步，同时显微镜和染料两者在技术层面又彼此相互促进和制约。例如：能够实现光转换(photoswitch)的荧光染料技术的出现使得storm(随机光学重建显微法，stochastic opticalreconstruction microscopy)的超分辨显微技术成为了可能；共聚焦显微镜和sted(受激发射损耗荧光显微镜,stimulated emission depletion microscopy)超分辨显微镜相对于普通荧光显微镜更强的激光，也对染料的光稳定性提出了更高的要求。目前，成像领域内的共识是希望能够实现大范围、活体(包括细胞到组织各个层面)、实时、长时间、高时空分辨率(细胞层面则应对应超分辨级别)的成像。因此，开发高光稳定、低光毒性、高亮度的生物相容性好的荧光染料便成为了领域内的共同追求。

2、生物偶联反应可以实现将染料小分子和生物大分子共价连接，通过荧光成像或检测手段对连接上生物大分子的荧光染料在体内或体外的时间或空间上的监测便成为了荧光成像领域中十分重要的部分。其中，蛋白质的共价修饰对于荧光显微技术十分关键，无论是smfret(单分子荧光共振能量转移,single molecule fluorescence resonance energytransfer)的单分子层面，还是免疫荧光成像的细胞或组织层面，都需要通过特定的生物偶联反应将染料和蛋白共价连接起来。一般而言，由于侧链基团具有较好的亲和特性，对于特定蛋白质的标记最常用的两种策略为赖氨酸和半胱氨酸的标记。其中关键性的差别在于赖氨酸的丰度较高(5.9％)，而半胱氨酸的丰度较低(1.9％)，且由于亲疏水性的特点，赖氨酸在几乎所有蛋白质表面都非常普遍，通常甚至可以提供20个位点用于连接染料、生物素、聚合物、纳米颗粒或者玻璃表面等，因此被广泛应用于对蛋白质的非特异性标记。而对于半胱氨酸而言，因其低丰度，而往往被允许使用定点突变来实现对于蛋白质的特异性位点标记而进行对于空间精度需求更高的研究。

3、具体地，上述两种蛋白质修饰技术的基本原理如下：

4、(1)琥珀酰亚胺酯与赖氨酸修饰

5、蛋白质修饰技术中最古老和最通用的便是基于可以与伯胺反应的基团开发而成的，其中非常重要的原因便是对于蛋白质中的所有官能团而言，去质子化的伯胺亲核性最强。而在氨基的所有修饰方法中，最经典的方法便是基于nhs酯(n-hydroxy succinimide，n-羟基琥珀酰亚胺)的方法。一般而言，由于烷氧基的离去能力很差，羧酸的烷基酯在水溶液中对胺反应难以发生，因此，使用离去能力更强同时水溶液体系较为稳定的基团便十分重要。nhs酯最早在1963年作为对于酰胺键形成反应中对苯酯的替代品而出现，相比于其他的胺选择性试剂而言，具有几个很大的优势：第一，ph在7-8时即可反应，与生理条件接近并明显低于其他试剂，如异硫氰酸酯；第二，任何含有羧基官能团的分子均可以比较方便的得到对应的nhs酯，使用时十分方便；第三，nhs酯在水中稳定性较好，ph等于7时半衰期为4-5小时，ph为8时约1小时，而ph等于8.6时为10分钟，这样的时间量级足够完成反应；第四，形成的酰胺键十分稳定，在水中有着7年之久的半衰期，可以将偶联后的产物长时间储存。正因为上述种种优势，nhs酯目前已经被认为是最强大的蛋白质修饰试剂之一，并几乎代表了生物偶联反应的金标准。

6、(2)半胱氨酸修饰

7、在蛋白质修饰中，半胱氨酸和赖氨酸应用上的最大区别来自于两者在丰度上的差别，作为丰度第二低的氨基酸(1.9％)，且可以方便的通过定点突变将其引入特定性的位置，使得半胱氨酸成为了特异性标记的首选方法。同时，从反应性上来看，巯基，特别是去质子化的硫醇盐形式，大大超过了其他蛋白质中的其他任何亲核功能。另外，考虑巯基的解离能力，蛋白质中半胱氨酸巯基的pka值约在8-9之间，与质子化的氨基相近，在生理ph条件下具有很好的反应性。

8、巯基和马来酰亚胺(mal，maleimide)的反应自1949年被开发为半胱氨酸的特异性反应之后，由于其快速的动力学和良好的选择性，便被广泛应用于各种生物偶联策略之中，甚至可能是最多使用的生物偶联方式。

9、也正因为上述两种反应的种种优势，基于这两种反应的试剂得到了广泛的商业化，对于荧光技术而言，可以十分方便的商业获取含有马来酰亚胺和琥珀酰亚胺酯作为连接子的染料并用于生物实验。

10、但申请人首次发现，在mal标记策略的特异性标记条件下，存在使染料的光稳定性变差的显著缺点。为此，在现有标记策略下，如何提高荧光染料的发光稳定性便成一个需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种芳基化偶联剂、荧光染料偶联物及相关应用，以解决现有技术中的mal偶联剂与荧光染料偶联时导致染料发光稳定性差的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种芳基化偶联剂，该芳基化偶联剂具有式i、式ⅱ或式ⅲ所示的结构式：

3、

4、其中，r1为h或任意一种氨基的保护基，r2选自烷基，r3选自取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的杂亚环烯基，且当r3为取代的亚芳基、取代的亚烷基或取代的杂亚环烯基时，取代基位于亚芳基、亚烷基或杂亚环烯基的任意可取代的位置，取代基选自不含杂原子的c1～c6的烷基、含杂原子的c1～c6的烷基、卤素、氨基及硝基中的任意一种或多种，杂亚烷基、杂亚环烯基或含有杂原子的c1～c6的烷基中的杂原子各自独立地选自o、s或n，杂原子位于任意一个碳原子的位置；x为f或cl。

5、进一步地，r1为boc、cbz、fmoc、alloc、teoc、pht、tos、tfa、trt、dmb、rmb或bn中的任意一种；r2选自甲基、乙基、丙基、或丁基中的任意一种。

6、进一步地，式i所示的芳基化偶联剂中，r3选自取代的亚芳基或取代的杂亚环烯基，其中，取代基为不含杂原子的c1～c6的烷基、含杂原子的c1～c6的烷基、卤素、氨基及硝基中的任意一种或多种，杂亚烷基、杂亚环烯基与含有杂原子的c1～c6的烷基中的杂原子各自独立地选自o、s或n，更优选为o。

7、进一步地，式i所示的芳基化偶联剂中，r3选自未取代的c1～c6的烷基或杂烷基，其中杂原子为o。

8、进一步地，r3选自如下任意一种基团：

9、

10、

11、-ch2-、

12、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种荧光染料偶联物，荧光染料偶联物通过荧光染料及偶联剂偶联而成，其中，偶联剂为前述芳基化偶联剂。

13、进一步地，荧光染料选自如下任意一种：花青类染料、罗丹明类染料、香豆素类染料、荧光素类染料、方酸类染料、卟啉类染料及bodipy类染料；优选地，花青类染料和罗丹明类染料选自如下任意一种：cy3、cy3.5、cy5、cy7、cy3b、cy5b、cy7b、四甲基罗丹明、alexafluor 488或alexa fluor 568。

14、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种生物分子的标记方法，该标记方法包括：将含有巯基的生物分子与前述荧光染料偶联物共孵育，生物分子通过巯基与荧光染料偶联物形成硫醚键而将荧光染料标记于生物分子上，从而得到被荧光染料标记的生物分子。

15、进一步地，生物分子选自核酸、蛋白或多肽。

16、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种带荧光标记的生物分子，带荧光标记的生物分子通过前述的方法标记得到。

17、进一步地，在单分子荧光测试条件下，带荧光标记的生物分子的总光子数是同种荧光染料的马来酰亚胺偶联物标记得到的生物分子的总光子数的1.5～2倍。

18、进一步地，生物分子中硫醚键中硫原子的电子密度为-0.0032～+0.02942。

19、根据本发明的第五个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括前述芳基化偶联剂，荧光染料偶联物，或者带荧光标记的生物分子。

20、根据本发明的第六个方面，提供了前述芳基化偶联剂在制备荧光染料偶联物或标记生物分子的试剂盒中的应用。

21、为了实现上述目的，根据本发明的七个方面，提供了一种芳基化偶联剂的制备方法，该制备方法包括：将化合物1和二硫化碳置于含碱性溶液的第一溶剂中进行第一反应，得到化合物2；将化合物2和碘甲烷置于第二溶剂中进行第二反应，得到中间产物；将中间产物与带氨基保护基团的溴化胺类化合物置于第三溶剂中进行第三反应，得到化合物3；将化合物3与间氯过氧苯甲酸置于第四溶剂中进行第四反应，得到前述式i所示的芳基化偶联剂；其中，芳基化偶联剂中r1为h或任意一种氨基的保护基；r2选自烷基；r3为化合物1、化合物2和化合物3的结构式分别如下：

22、

23、进一步地，将化合物1、二硫化碳与第一碱溶于第一溶剂中进行第一反应，其中，化合物1与二硫化碳的摩尔比为(2～20)：1；化合物1与第一碱的摩尔比为(2～20)：1；优选地，第一反应的温度为85～95℃，第一反应的时间为18～24h；优选地，第一碱选自如下任意一种：koh或naoh，优选地，第一溶剂选自如下任意一种：无水乙醇或无水甲醇。

24、进一步地，将化合物2与n，n-二异丙基乙胺溶于第二溶剂中，得到化合物2溶液；将碘甲烷溶于第二溶剂中，得到碘甲烷溶液；将碘甲烷溶液滴加至化合物2溶液中进行第二反应；优选地，化合物2与碘甲烷的摩尔比为(0.8-1.2)：1；化合物2与n，n-二异丙基乙胺的摩尔比为(2～20)：1；优选地，第二反应在冰浴条件下反应30-60min，优选35-45min；优选地，第二溶剂选自如下任意一种：四氢呋喃、丙酮、2-甲基四氢呋喃或乙醚。

25、进一步地，将中间产物溶于第三溶剂中，然后向第三溶剂中依次加入第二碱和带氨基保护基团的溴化胺类化合物，进行第三反应；优选地，化合物2与第二碱的摩尔比为(2～10)：1；优选地，化合物2与带氨基保护基团的溴化胺类化合物的摩尔比为(2～20)：1；优选地，第三反应的温度为15～30℃，第三反应的时间为2～4h；优选地，带氨基保护基团的溴化胺类化合物选自带氨基保护基团的c2～c4的烷基溴化胺，更优选为带氨基保护基团的c2或c3的烷基溴化胺；优选地，氨基保护基为boc、cbz、fmoc、alloc、teoc、pht、tos、tfa、trt、dmb、rmb或bn中的任意一种；更优选地，带氨基保护基团的溴化胺类化合物为boc-hn-ch2-ch2-br或boc-hn-ch2-ch2-ch2-br；优选地，第二碱选自如下任意一种：无水碳酸钠、无水碳酸钾、无水碳酸锂或无水碳酸铯，第三溶剂选自如下任意一种：二甲基甲酰胺、二甲亚砜或环丁砜。

26、进一步地，化合物3与间氯过氧苯甲酸的摩尔比为(2～10)：1；优选地，第四溶剂选自如下任意一种：二氯甲烷、氯仿、二氧六环或四氢呋喃。

27、为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种芳基化偶联剂的制备方法，该制备方法包括：将化合物4与带氨基保护基团的乙二胺置于第五溶剂中进行第五反应，并在酸胺缩合剂和有机碱的作用下，得到前述式ii所示的芳基化偶联物；

28、

29、其中，第五溶剂为乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺；酸胺缩合剂选自碳二亚胺类或鎓盐类，有机碱选自三乙胺和n,n-二异丙基乙胺；当酸胺缩合剂选自碳二亚胺类时，反应体系中还包括助剂，助剂为hobt；优选地，碳二亚胺类的酸胺缩合剂选自dcc，edci或dic；鎓盐类的酸胺缩合剂选自hatu、hbtu或bop；优选地，化合物4与带氨基保护基团的乙二胺的摩尔比为(2～20)：1；优选地，氨基保护基为boc、cbz、fmoc、alloc、teoc、pht、tos、tfa、trt、dmb、rmb或bn中的任意一种。

30、根据本发明的第九个方面，提供了一种芳基化偶联剂的制备方法，该制备方法包括：将化合物5和4-n-叔丁氧羰基氨基哌啶(tert-butyl piperidin-4-ylcarbamate)分别溶于第六溶剂中，得到化合物5溶液和4-n-叔丁氧羰基氨基哌啶溶液；向4-n-叔丁氧羰基氨基哌啶溶液中加碱，得到碱性溶液；在0-4℃下向碱性溶液中滴加化合物5溶液，得到混合溶液；将混合溶液置于室温下反应1.5-2.5h，得到权利要求1中式iii所示的芳基化偶联物；其中，第六溶剂为二氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙腈、二氧六环或四氢呋喃；优选地，化合物5与4-n-叔丁氧羰基氨基哌啶的摩尔比为：(1～20)：1。

31、为了实现上述目的，根据本发明的第十个方面，提供了一种荧光染料偶联物的制备方法，该制备方法包括：将荧光染料与前述芳基化偶联剂进行反应，得到荧光染料偶联物。

32、进一步地，荧光染料选自花青类染料、罗丹明类染料、香豆素类染料及bodipy类染料中的任意一种；优选地，染料选自如下任意一种：cy3、cy5、cy3b、cy5b、af488、af568和tmr。

33、进一步地，制备方法包括：将芳基化偶联剂中可选的氨基保护基团进行脱保护，得到脱氨基产物；将脱氨基产物与荧光染料及n，n-二异丙基乙胺置于dmf溶剂中进行反应，得到荧光染料偶联物；当荧光染料为cy3、cy5、cy7、af488、af568或tmr时，以cy3-nhs、cy5-nhs、cy7-nhs、af488-nhs、af568-nhs或tmr-nhs的形式与脱氨基产物进行反应；当荧光染料为cy3b、cy5b或cy7b时，以cy3b-cooh、cy5b-cooh或cy7b-cooh的形式与脱氨基产物进行反应；优选地，将芳基化偶联剂置于二氯甲烷和盐酸·二氧六环中将氨基保护基团进行脱保护；优选地，芳基化偶联剂与n，n-二异丙基乙胺的摩尔比为(2～20)：1。

34、应用本发明的技术方案，通过对于需要特异性荧光染料标记的生物大分子缀合物中的硫醚电子性质的调节，采用式i、式ⅱ或式ⅲ所示的化合物作为连接子(或偶联剂)替代传统的马来酰亚胺偶联剂，能够在不同生物大分子上实现以1.2-4.5倍的不同比率提高染料在染料-生物大分子缀合物中的光稳定性。