荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子PlPeL8及其应用

荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8及其应用
技术领域
1.本发明属于分子植物病理学技术领域，特别涉及一种荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8及其应用。


背景技术：

2.荔枝霜疫霉(peronophythora litchii chen ex ko et al.)是半活体营养型卵菌，其引起的荔枝霜疫病是威胁荔枝生产最严重的病害之一，且尚无发现有效的抗病荔枝种植品种。从抽生花穗到果实成熟，以及果实采后的贮藏运输，荔枝都可能遭受荔枝霜疫病为害，进而引起大量花腐、落果和烂果，经济损失率可达30％～50％。
3.目前对荔枝霜疫霉的防治仍然以农药防治和农业防治为主，且存在下面几个方面的困难：荔枝育种困难、抗性资源少、抗药风险大。鉴于荔枝霜疫霉对荔枝的巨大破坏性以及防治手段的局限，因此对于该病原菌和荔枝互作机制的研究具有十分重要的意义。
4.植物为了识别和抵御病原物，发展出复杂和多层次的免疫系统，其中一种是病原体或微生物相关分子模式(pamps/mamps)触发的植物免疫途径(pti)。pamps/mamps往往是微生物生存所必需的结构或病原体重要的毒力因子，可以被植物细胞的模式识别受体(prrs)感知，从而引发免疫反应，如包括ca
2+
内流、活性氧(ros)的产生、防御相关基因的表达、胼胝质沉积以及被称为过敏性反应(hr)的局部性快速细胞死亡等生理特性。yin等在卵菌病原菌辣椒疫霉中鉴定了碳水化合物结合模块家族成员pccbp3能够激发敏性反应和诱导植物抗性从而抑制病原菌的侵染(2021)。
5.目前，国内外从荔枝霜疫霉分离鉴定能够引起植物免疫反应的激发子较少，situ等人鉴定荔枝霜疫霉效应分子plavh142可以诱导多种植物的细胞死亡和免疫反应(2020)。因此，从荔枝霜疫霉中寻找新的蛋白激发子，不仅对揭示该病原菌和荔枝互作机制提供理论依据，还能够为开发提高植物免疫抗性的蛋白质生物农药提供有效的资源。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8。
7.本发明的另一目的在于提供所述荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的编码基因。
8.本发明的再一目的在于提供所述荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一种荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.所述荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的编码基因，其核酸序列如seq id no.2所示。
12.含有所述荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
13.所述的荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8在提高植物抗病能力、提高植物防御能力(诱导植物防御反应)和/或提高植物对病原菌抗性中的应用。
14.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
15.所述的病原菌为疫霉菌；优选为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。
16.所述的提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过过表达荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的方式实现；所述的过表达荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8通过如下步骤实现：
17.(1)将上述荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的基因连接到植物表达载体上，然后转化大肠杆菌，获得重组质粒；
18.(2)将重组质粒转入农杆菌，并在植物上瞬时表达。
19.步骤(1)中所述的植物表达载体优选为pbin载体。
20.步骤(1)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌jm109。
21.步骤(2)中所述的农杆菌优选为农杆菌gv3101。
22.所述的荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8在诱导植物活性氧迸发，和/或上调植物免疫相关通路标志基因(免疫反应的蛋白)的表达方面的应用，可通过过表达荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8的方式实现。
23.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
24.所述的植物免疫相关通路标志基因包括水杨酸(sa)信号路径标志基因pr1、pr2，以及茉莉酸(ja)信号路径标志基因lox中的至少一种。
25.所述的荔枝霜疫霉分泌型蛋白激发子plpel8在防治植物病原菌(减少病原菌的侵染)或植物育种(培育抗病植株)方面的应用。
26.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
27.所述的病原菌为疫霉菌；优选为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。
28.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
29.1、本发明中的蛋白激发子plpel8可以诱导植物防御反应，包括引起植物细胞过敏性坏死，诱导活性氧迸发和植物免疫相关通路(水杨酸和茉莉酸通路)标志基因的上调表达，能够显著提高植物对辣椒疫霉的抗性；此外，蛋白激发子plpel8在大豆疫霉和辣椒疫霉中的同源蛋白也能够诱导本氏烟草过敏性坏死，表明具有激发子plpel8及其同源蛋白诱导植物抗性的能力具有广泛性，为提高植物抗病性、减轻病害发生提供了新的途径，因而在现代农业绿色发展上具有广阔的应用前景。
30.2、本发明中的蛋白激发子plpel8提高植物的抗病性：将蛋白激发子plpel8的编码基因构建入植物表达载体中，重组质粒转化农杆菌并在本氏烟草细胞瞬时表达，利用农杆菌注射烟草的技术使激发子plpel8在本氏烟草瞬时表达使所述植物的免疫反应激发和提高对辣椒疫霉的抗病性，因此，可将plpel8一种诱导植物免疫的激发子应用到植物病害的防治领域。
附图说明
31.图1是蛋白激发子plpel8与其他卵菌中同源蛋白的序列多重比对结果图。
32.图2是蛋白激发子plpel8及其同源蛋白引起本氏烟草细胞的过敏性坏死实验结果
图。
33.图3是蛋白激发子plpel8诱发烟草烟草叶片活性氧迸发实验结果图。
34.图4是蛋白激发子plpel8诱导本氏烟草免疫相关通路标志基因的上调表达实验结果图；其中，a和b分别为水杨酸(sa)信号路径标志基因nbpr1、nbpr2；c为茉莉酸(ja)信号路径标志基因nblox。
35.图5是蛋白激发子plpel8诱导烟草对辣椒疫霉的抗性反应实验结果图；其中，a为辣椒疫霉侵染本氏烟草叶片表型图；b为辣椒疫霉侵染本氏烟草叶片病斑直径生物学统计分析图；c为本氏烟草叶片中辣椒疫霉生物量统计分析图。
具体实施方式
36.下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.本发明实施例中涉及的荔枝霜疫霉(peronophythora litchii chen ex ko et al.)和辣椒疫霉(phytophthora capsici)为常规植物病原卵菌，可通过商业途径或自然界分离获得。
38.本发明实施例中涉及的大肠杆菌jm109感受态细胞和农杆菌gv3101可以通过常规市售获得。
39.本发明实施例中涉及的pbin-ha由pbin-gfp载体(可通过常规市购获取)替换标签改造而来，改造步骤如下：hemagglutinin(ha)标签的全长由上海生工进行合成(片段n端引入kpni和sami酶切位点；c端引入ecori酶切位点)，其核酸序列如seq id no.3所示。pbin-gfp载体和ha合成片段经kpni和ecori限制性内切酶双酶切后，利用t4 dna ligase连接，获得植物表达载体pbin-ha。
40.hemagglutinin(ha)标签核酸序列(seq id no.3)：
41.ggtacccccggggatcctctagagattgcggccgcgtacccatacgatgttcctgactatgccgagtatccatatgacgttccagattacgctgtctacccatacgatgttccagattacgcttgagaattc。
42.实施例1：plpel8基因的克隆和获取
43.大多数植物病原生物都会分泌大量的细胞壁降解酶(cwdes)，从而降解植物细胞壁获得生长所需的营养并且完成侵染。与此同时，部分cwdes或由cwdes降解细胞壁多糖释放的分子可以作为植物免疫反应的诱导剂。其中果胶裂解酶(pectate lyase，pl)细胞壁降解酶的主要成员。基于荔枝霜疫霉基因组和转录组测序的完成，我们预测荔枝霜疫霉可能编码共19个果胶裂解酶基因。我们设计果胶裂解酶8(plpel8)的全长特异性引物，引物包含载体克隆位点两端的同源序列，正向引物plpel8-f：5
’‑
gatagccggtacccccatggctcgtatcatctcac-3’，反向引物plpel8-r：5
’‑
ctctagaggatccccgtagaactcgatcttgtcc-3’(下画线标出的序列是引入与载体pbin-ha两末端完全对应一致的序列，便于后续同源重组)。
44.荔枝霜疫霉基因组rna的提取采用上海生工dna/rna提取试剂盒(b618003)，将得到rna使用takara的prime scripttm rt msater mix(perfect real time)逆转录试剂盒，进行cdna的合成。
45.采用诺唯赞高保真酶(turbo super-fidelity dna polymerase)，以荔枝霜疫霉cdna为模板扩增plpel8全长，具体pcr体系(50μl)：cdna模板1μl，10μmol/l引物plpel8-f和plpel8-r各2μl，dntp 1μl，2
×
buffer 25μl，phanta 1μl，ddh2o 18μl。
46.pcr反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃30s，最后延伸72℃5min，34个循环。
47.pcr产物经dna回收试剂盒(omega)回收，随后采用clonexnase
tmⅱone step cloning kit试剂盒(vazyme)将smaⅰ酶切后植物表达载体pbin-ha与目的片段进行连接。将获得的重组质粒pbin-plpel8-ha转化到大肠杆菌jm109感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上进行筛选。菌株经质粒抽提试剂盒(omega)抽提质粒，由上海生工进行测序，最终确定plpel8基因的开放阅读框，其核酸序列如seq id no.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示：
48.plpel8蛋白序列(seq id no.1)：
49.mariisllcavlaattsvssawptskgsvryngvkvikkgetfdggmktyqrsdikckgqsegswrdavfkleagaklknviigpdqregvhcddndctvenvwwedvcedalsikggnknsvtnvlacgaknaddkviqhngyghvningfyaenfgklyrscgtcgnikrtvslnhvwgnnpkvslvtvnanngdvatftndihvhtskganavcqtttstngkepkvtskgpskncvfnkdkiefy；
50.plpel8基因序列(seq id no.2)：
51.atggctcgtatcatctcacttctctgcgccgtgctcgctgccaccacctccgtctcctccgcctggcccacttccaaggggagtgttcgctacaatggcgtcaaggtcatcaagaaaggagaaaccttcgacggagggatgaagacgtaccagcgttccgacatcaaatgcaagggtcagtccgagagaagctggcgtgacgccgtcttcaagctcgaagccggtgccaaactcaagaacgtcatcatcggacctgaccagcgtgagggcgtacactgcgacgacaacgactgcaccgtcgagaacgtctggtgggaggacgtctgcgaggacgcactgagtatcaagggtggtaacaagaacagcgtcaccaacgtgctcgcatgcggcgccaagaacgccgacgacaaggtcatccagcacaacggatacggccacgtcaacatcaatggcttctacgccgagaacttcggcaaactctaccgttcgtgtggcacgtgcggcaacatcaagcgcacggtgtcactcaaccacgtgtggggaaacaaccccaaggtgagtctcgtgaccgtgaacgccaacaacggagacgtcgccaccttcaccaatgacatccacgtgcacacgagcaagggtgccaacgccgtgtgtcagaccacgacgtccacgaacggcaaggagcccaaggtcacgagcaaggggccgtccaagaactgtgtcttcaacaaggacaagatcgagttctactaa。
52.实施例2：蛋白激发子plpel8在卵菌中同源蛋白预测
53.使用seqhunter2.0软件，jgi基因组数据库(https://genome.jgi.doe.gov/)、ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因组数据库为基础，通过blast进行plpel8同源蛋白分析。3个plpel8同源蛋白：ps_141345(ncbi登录号：xp_009520586.1)、pc_15766(ncbi登录号：kag1685646.1)、pitg_gn244_atg14395(ncbi登录号：kaf4033686.1)，分别来自大豆疫霉(phytophthora sojae)、辣椒疫霉(p.capsici)和致病疫霉(p.infestans)，与plpel8同源率在90％以上，高度保守；终极腐霉(pythium ultimum)同源蛋白pyu1_t002542(ncbi登录号：kaf1335911.1)同源率为53.1％。
54.利用bioedit软件对plpel8和ps_141345、pc_15766、pitg_gn244_atg14395、pyu1_t002542进行序列多重比对，发现序列在荔枝霜疫霉和疫霉菌中高度保守(图1)。
55.实施例3：plpel8及其同源蛋白在本氏烟草瞬时表达，诱导细胞过敏性坏死
56.将实施例1中获得的重组质粒pbin-plpel8-ha转入到100μl农杆菌gv3101感受态
中，利用含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的lb固体培养基进行筛选，单克隆经菌落pcr验证后液体lb摇菌，28℃，180rpm振荡培养1～2天(d)。
57.菌体4000rpm离心4min，弃上清，用10mmol/l mgcl2悬浮菌体，共洗涤3～4次，将od
600
调至0.4～0.6。用1ml无菌不带针头注射器在生长旺盛的5～6叶期的本氏烟叶片背面注射农杆菌悬浮液，使目的基因在本氏烟草细胞中瞬时表达；同时每个叶片注射pbin-rfp-ha重组农杆菌(将如seq id no.4所示的rfp基因序列替换上述pbin-plpel8-ha中的plpel8序列，构建重组质粒pbin-rfp-ha，再转化农杆菌gv3101)为对照，注射3～5d观察烟草过敏性反应。plpel8的同源蛋白ps_141345和pc_15766(参考实施例1，分别提取大豆疫霉(phytophthora sojae)和辣椒疫霉(p.capsici)基因组rna，并逆转录为cdna，再利用上下游引物ps_141345-f和ps_141345-r，pc_15766-f和pc_15766-r进行pcr扩增，获得的目的片段连接到表达载体pbin-ha上，获得重组质粒pbin-ps_141345-ha、pbin-pc_15766-ha，再转化农杆菌gv3101)，也根据同样的方法在本氏烟草细胞中瞬时表达。三次重复。
58.rfp核酸序列(seq id no.4)：
59.atggcctcctccgaggacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttccagtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagatgaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgccgaggtcaagaccacctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaagaccgacatcaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgcgccgagggccgccactccaccggcgcctaa。
60.ps_141345-f：
[0061]5’‑
gatagccggtacccccatgacccgcatcgtctcgctc-3’；
[0062]
ps_141345-r：
[0063]5’‑
ctctagaggatccccgtagaactcgatcttgtccttg-3’；
[0064]
pc_15766-f：
[0065]5’‑
gatagccggtacccccatggctcgcatcatctccatcgtc-3’；
[0066]
pc_15766-r：
[0067]5’‑
ctctagaggatccccgtagaactcgatcttgtccttgttg-3’。
[0068]
注：下画线标出的序列是引入与载体pbin-ha两末端完全对应一致的序列，便于后续同源重组。
[0069]
结果：在注射含有pbin-plpel8-ha、pbin-ps_141345-ha、pbin-pc_15766-ha重组载体农杆菌的叶片部位在48h开始有明显的细胞坏死出现，而注射含pbin-rfp-ha农杆菌的对照区域没有坏死。由此表明plpel8及其同源蛋白能引起本氏烟草的过敏性坏死(图2)，活性具有广泛性。
[0070]
实施例4：plpel8诱导本氏烟草叶片活性氧迸发
[0071]
按实施例3中的方法将重组质粒pbin-plpel8-ha转化农杆菌gv3101，菌体培养离
心后用10mmol/l mgcl2悬浮菌体，并将od
600
调至0.4～0.6。用1ml无菌不带针头注射器从生长旺盛的5～6叶期的本氏烟叶片背面注射农杆菌悬浮液，同时每个叶片注射pbin-rfp-ha重组农杆菌(构建方法同实施例3)为对照。注射24h后，取注射后叶片至于烧杯中，1mg/ml dab染色液(1mg/ml二氨基联苯胺(3,3
’‑
diaminobenzidine)，ph＝3.8)加至烧杯中，液面高于叶片。室温避光处理8h，倒去dab溶液，加入无水乙醇煮沸进行脱色，待叶片中绿色完全洗脱，于室温95％(质量分数)乙醇中浸泡5min，取出叶片观察拍照。三次重复。
[0072]
结果：在注射含有pbin-plpel8-ha重组载体农杆菌的叶片部位有明显的褐色沉积物出现，对照部位没有褐色沉积物(图3)。表明plpel8诱导本氏烟草叶片活性氧迸发。
[0073]
实施例5：蛋白激发子plpel8诱导本氏烟草免疫相关通路标志基因的上调表达
[0074]
按实施例3中的方法将重组质粒pbin-plpel8-ha转化农杆菌gv3101，菌体培养离心后用10mmol/l mgcl2悬浮菌体，并将od
600
调至0.4～0.6。用1ml无菌不带针头注射器从生长旺盛的5～6叶期的本氏烟叶片背面注射农杆菌gv3101悬浮液，同一叶片左半侧注射含有pbin-plpel8-ha重组载体农杆菌，右半侧注射pbin-rfp-ha重组农杆菌(构建方法同实施例3)为对照。注射24、36、48h后，分别收集叶片左右两侧注射区域，利用上述rna提取试剂盒提取rna，反转录为cdna，通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测水杨酸(sa)、茉莉酸(ja)信号路径标志基因：nbpr1、nbpr2、nblox的相对表达量。三次重复。相应的引物如下：
[0075]
nbpr1-qrt-f:5
’‑
ccgccttccctcaactcaac-3’；
[0076]
nbpr1-qrt-r:5
’‑
gcacaaccaagacgtactgag-3’；
[0077]
nbpr2-qrt-f:5
’‑
catcacagggttcgtttagga-3’；
[0078]
nbpr2-qrt-r:5
’‑
gggttcttgttgttctcatca-3’；
[0079]
nblox-qrt-f:5
’‑
ccttaagaggagatggaact-3’；
[0080]
nblox-qrt-r:5
’‑
tctaagctcataagcaatgg-3’。
[0081]
实时荧光定量pcr(qrt-pcr)采用takara公司的sybr premix ex taqtm试剂盒，反应体系为：sybr premix ex taqtm(2
×
)10μl，模板2μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，rnase-free ddh2o 6.4μl。
[0082]
扩增程序：预变性95℃30s；pcr反应95℃5s，60℃30s，40cycle；熔解曲线95℃15min，60℃30s，95℃15min。反应结束后，通过配套分析软件qpcrsoft进行数据分析。
[0083]
结果：plpel8在本氏烟草叶片瞬时表达4h后，水杨酸(sa)信号路径标志基因nbpr1、nbpr2和茉莉酸(ja)信号路径标志基因nblox均较在对照叶片中显著上调表达(图4)。表明plpel8有效地诱导本氏烟草免疫相关通路标志基因的上调表达。
[0084]
实施例6：蛋白激发子plpel8诱导本氏烟草对辣椒疫霉的抗性
[0085]
按实施例3中的方法将重组质粒pbin-plpel8-ha转化农杆菌gv3101，菌体培养离心后用10mmol/l mgcl2悬浮的菌体，将od
600
调至0.4～0.6。用1ml无菌不带针头注射器从生长旺盛的5～6叶期的本氏烟叶片背面注射农杆菌悬浮液，同一叶片左半侧注射含有pbin-plpel8-ha重组载体农杆菌，右半侧注射pbin-rfp-ha重组农杆菌(构建方法同实施例3)为对照。注射24h后剪下注射后本氏烟草叶片置于湿润滤纸上；用灭菌的5mm孔径打孔器在辣椒疫霉菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，分别在叶背面左右两侧各接种一块菌饼，重复接种6片注射后叶片，于25℃保湿放置，48h后拍照并测量左右两侧病斑直径。随后进行生物量测定，分别收集左右两侧等质量被侵染叶片，3片为一组，采用上海生工dna/rna提取试剂盒
(b618003)提取dna。以烟草的ef1α基因和辣椒疫霉actin基因进行qrt-pcr的方法进行检测，以辣椒疫霉在表达rfp蛋白的叶片中侵染量为参照设为1，分析辣椒疫霉在表达plpel8的烟草叶片中的生物量。相应的引物如下：
[0086]
nbef1α-qrt-f:5
’‑
tggtgtcctcaagcctggta-3’；
[0087]
nbef1α-qrt-r:5
’‑
acgcttgagatccttaaccgc-3’；
[0088]
pcactin-qrt-f:5
’‑
gtactgcaacatcgtgctgtcc-3’；
[0089]
pcactin-qrt-r:5
’‑
ttagaagcacttgcggtgcacg-3’。
[0090]
结果：通过观察和生物学统计，辣椒疫霉在表达plpel8的本氏烟草叶片中，辣椒疫霉侵染面积和生物量较在对照(rfp)中显著减小(图5)。由此表明，激发子plpel8在烟草中表达能够诱导植物抗性，抑制辣椒疫霉侵染。
[0091]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。