一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型及其应用

本发明属于生物医学工程下属的组织工程和生物制造，具体涉及一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型及其应用。

背景技术：

1、血脑屏障指在脑血管和大脑之间存在一种选择性地阻碍某些特定物质由血液通过脑血管进入大脑的“屏障”。血脑屏障的实质是存在于外周血液和脑组织之间的一个复杂细胞或组织结构，它控制着血液与脑脊液之间的物质通过与交换，调节和保证大脑内环境的稳态。构成血脑屏障的细胞主要为内皮细胞，内皮细胞在各种紧密连接蛋白的作用下形成紧密连接结构，并与胶质细胞和周细胞等细胞相互作用形成血脑屏障这一特殊的屏障系统。

2、由于血脑屏障具有低通透性，这使得其成为向脑内输送药物的天然障碍，阻碍药物有效地向脑内进行运输。因此，向脑内输送药物的研究与开发需考虑到能有效地穿透血脑屏障。此外，血脑屏障的发育异常和功能丧失会破坏大脑微环境的稳态，导致神经系统功能障碍从而引发中风、阿尔茨海默病、帕金森病等众多神经系统疾病。因此，对血脑屏障体外模型的开发以及深入研究将会为神经系统疾病的药物开发以及疾病诊疗提供重要的理论基础。

3、现有的血脑屏障模型主要包含：体内的动物模型、体外的基于微流控芯片技术的模型以及基于transwell小室的模型。其中，体内的动物模型多采用小鼠、大鼠、兔子等动物的血脑屏障进行研究，由于小型动物与人体之间的种属差异，导致血脑屏障模型的准确性难以保证。体外的基于微流控芯片的模型可以较好地重现人体血脑屏障的微环境。然而，基于微流控芯片的模型操作难度大、技术门槛高阻碍了其广泛应用。体外的基于transwell小室的模型具有操作方便的特点，使用人源的细胞可以尽可能地降低种属差异。然而普通transwell小室的模型难以很好地促进细胞之间形成紧密连接结构，导致血脑屏障的有效性难以保障。

4、因此，提供一种操作简便、技术门槛低、能够促进细胞之间形成紧密连接的有效的血脑屏障模型显得很有必要。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型，该血脑屏障模型可以有效地模拟体内血脑屏障功能，并且具有操作简便、技术门槛低的特点，具有巨大的商业价值。

2、本发明还提供上述具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型在血脑屏障相关药物研发中的应用。

3、一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型，包括：

4、管状的孔板支架；

5、对孔板支架底部进行封端的网状衬底支架；

6、负载于所述衬底支架上并具有紧密连接结构的细胞膜片；

7、以及将所述细胞膜片、衬底支架和孔板支架封装为一个整体的水凝胶结构。

8、上述具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型构建完成后，需要将下端(细胞膜片)置于细胞培养基中以保持细胞活性。孔板支架的横截面为圆形、方形、矩形、三角形或异形。

9、细胞膜片由一种或多种血脑屏障相关细胞组成，可以用来模拟血脑屏障细胞间紧密连接结构。

10、作为优选，所述孔板支架为圆管结构。为便于加工、安装并提高血脑屏障模型的密封效果，所述衬底支架为与孔板支架的圆管结构相匹配的圆形片状结构。

11、作为优选，所述孔板支架的上端设有对所述孔板支架进行定位的定位部。所述定位部的作用是对血脑屏障模型进行定位，使带有细胞膜片的孔板支架下端能够悬置于细胞培养基中，如此细胞膜片可以将细胞培养基分隔为血脑屏障模型的内外两部分，用于模拟血脑屏障的内外两部分，进而实现在体外重现血脑屏障的生理功能。其中，血脑屏障模型的内部(细胞培养基)作为上室，外部(细胞培养基)作为下室。

12、作为进一步优选，所述定位部为与所述孔板支架中心轴线垂直并与孔板支架上端固定连接的定位杆，孔板支架置于装有细胞培养基的容器中时，定位杆的外端(不与孔板支架连接的一端)置于该容器顶部。孔板支架的尺寸根据容器的尺寸进行设置。

13、作为更进一步优选，所述定位杆设有三个，三个定位杆沿所述孔板支架上端周向均匀分布。

14、为提高定位部结构的稳定性，作为更进一步优选，所述定位部还包括套设于孔板支架外部的定位环，所述定位杆分别与孔板支架上端和定位环连接，且定位环的半径小于孔板支架的半径与定位杆的长度之和。

15、作为优选，所述孔板支架的下端设有安装所述衬底支架的支撑部。所述支撑部为沿所述孔板支架下端内壁设置的环状安装台，所述安装台的内径大于所述衬底支架的外径。

16、作为优选，所述衬底支架为近场直写高精度3d打印的聚己内酯(pcl)支架，其中，相同方向上相邻两根丝之间的距离为0.1～10mm。进一步优选为0.8～1.2mm。

17、作为优选，所述水凝胶结构材料为受外界条件(如温度、光线等)刺激后由液态转变为凝胶态的物质。

18、作为进一步优选，所述水凝胶结构材料为明胶、明胶衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、海藻酸盐类化合物、pluronic f-127、纤维蛋白原、胶原、丝素蛋白、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷中的一种或多种。更进一步优选为甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)。

19、作为优选，所述具有紧密连接结构的细胞膜片的培养方法包括：

20、将经培养基重悬后的细胞接种于培养容器内的底部支撑液体上，并在底部支撑液体表面完成培养后，形成所述具有紧密连接结构的细胞膜片；

21、所述底部支撑液体的密度大于培养基的密度，且不与所述培养基互溶。

22、上述细胞膜片的培养方法中，采用底部支撑液体作为细胞的生长支撑，液态基质培养时，细胞分泌的细胞外基质无法依附于液态基质上，只能依附于相邻的其他细胞上，从而导致细胞分泌更多的细胞外基质，形成高细胞密度的紧密连接的细胞膜片。

23、作为进一步优选，所述底部支撑液体包括但不限于氟化油、氟代烷烃类化合物、硅氧烷类化合物(如硅油、未固化的聚二甲基硅氧烷)、酯类化合物(如碳酸二甲酯、硫酸二甲酯)中的一种或多种的混合物。

24、选用以氟化油为代表的疏水性液体作为底部支撑液体的主要因素是液态基底的氟化油的疏水效应会为细胞提供了来自各方面的径向内向表面张力。细胞的形状由杨-拉普拉斯方程控制；也就是说，在每个细胞体积守恒的约束下，势能被最小化，从而细胞变成立体球状体，立体球状细胞自发地自组装，形成六边形的紧密连接结构。

25、作为更进一步优选，所述底部支撑液体为3m novec hfe系列氟化油(如hfe7500)、3m fluorinert fc系列氟化油、teccem fluoronox系列氟化油、硅油、未固化的聚二甲基硅氧烷、碳酸二甲酯、硫酸二甲酯中的一种或多种的混合物。

26、作为进一步优选，培养容器内，所述底部支撑液体的添加量大于0.08ml/cm2。作为更进一步优选，所述底部支撑液体的添加量为0.3～0.7ml/cm2。

27、作为进一步优选，所述细胞为复苏后的冻存细胞或传代消化后的细胞。

28、作为进一步优选，所述细胞为血脑屏障模型相关细胞，包括但不限于内皮细胞、胶质细胞和周细胞中的一种或多种。更进一步优选为内皮细胞。

29、作为进一步优选，进行细胞培养时，细胞的接种浓度为2×104～2×108个/cm2。更进一步优选为1×106个/cm2～2×106个/cm2。

30、作为进一步优选，细胞培养的培养温度为35～39℃，培养时间为1～28天。更进一步优选为，培养温度为37℃，培养时间为1～14天，培养后的细胞形成具有紧密连接结构的膜状细胞片。

31、作为进一步优选，细胞接种后在浓度为5％的二氧化碳培养箱中进行培养。

32、作为进一步优选，细胞培养期间每10～15h更换一次培养基，更换的细胞培养基体积为原细胞培养基体积的70～90％。更进一步优选为，培养期间每12h更换一次培养基。

33、作为更进一步优选，更换培养基时，新的培养基经预热后再进行更换。

34、作为进一步优选，所述底部支撑液体经过灭菌后添加至培养容器内。

35、作为进一步优选，所述底部支撑液体采用化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌中的一种或多种灭菌方式进行灭菌。更进一步优选为紫外光灭菌。

36、培养容器可以是培养板、培养皿，也可以是适用于普通细胞培养的任何容器。培养容器也可为自定义材质、形状、结构的容器。作为优选，培养容器为商业化的多孔培养板。

37、作为进一步优选，先将衬底支架埋入底部支撑液体中，再进行细胞接种，待细胞培养结束形成细胞膜片后，将衬底支架向上提起取出，期间细胞膜片贴附于衬底支架上，得负载细胞膜片的衬底支架。由于形成的细胞膜片比较脆弱，在不借助外力的前提很难将其完整的取出。本技术方案将网状的衬底支架作为细胞膜片的支撑结构，在衬底支架的支撑下将细胞膜片完整地取出，并将衬底支架和细胞膜片作为整体应用于血脑屏障模型中。

38、为方便衬底支架的取出，作为进一步优选，可增加收集支架作为辅助取放工具对衬底支架进行取放，收集支架包括位于底部的环状结构以及与环状结构连接的提竿，环状结构的内侧设有用于安装衬底支架的环形凸台；

39、提竿平行于环状结构的中心轴线，其下端与环状结构连接，上端设有折弯的提手。将收集支架置于培养容器中时，提手可挂于培养容器的顶部。收集支架的尺寸根据培养容器的尺寸进行设置。

40、使用时，先将衬底支架先安装在收集支架上再放入底部支撑液体内，待形成细胞膜片后取出时，直接将收集支架取出，再将衬底支架和细胞膜片从收集支架上取下即可。

41、作为进一步优选，所述收集支架为3d打印的聚乳酸(pla)支架。

42、作为优选，所述衬底支架和收集支架经灭菌后添加至培养容器内。作为进一步优选，采用化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌中的一种或多种灭菌方式进行灭菌。更进一步优选为紫外光灭菌。

43、作为优选，将载有细胞膜片的衬底支架从收集支架上取下后，安装于孔板支架上，将载有细胞膜片的衬底支架通过孔板支架的定位部悬置于装有细胞培养基的容器中即得到所述体外血脑屏障模型。

44、以细胞培养在12孔培养板中进行为例，上述具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型的构建过程如下：

45、(1)制备具有紧密连接结构的细胞膜片

46、准备一洁净灭菌的12孔培养板，在其内依次放入洁净灭菌的定制尺寸的收集支架和衬底支架(衬底支架安装于收集支架上)。

47、所述定制尺寸的收集支架外直径略小于12孔培养板内直径；高度略高于12孔培养板孔深度。

48、向12孔培养板内依次加入底部支撑液体(液面至少没过衬底支架)和含有细胞的细胞培养基进行培养，培养结束后在底部支撑液体的表面形成具有紧密连接结构的细胞膜片；

49、其中，所述底部支撑液体的密度大于培养基的密度，且不与培养基互溶。

50、(2)建立体外血脑屏障模型

51、准备另一洁净灭菌的6孔培养板，将收集支架从12孔培养板中缓慢取出，期间细胞膜片贴附于衬底支架上；将载有细胞膜片的衬底支架与收集支架分离并放入洁净灭菌的定制尺寸的孔板支架中；

52、孔板支架需悬架于孔板上，孔板支架底部(即细胞膜片)与孔板之间的间距为1～10mm。

53、用水凝胶将载有细胞膜片的衬底支架与孔板支架进行封装，封装后的孔板支架放入至添加有细胞培养基的6孔培养板中进行培养，以保持细胞活性。

54、作为优选，所述收集支架为3d打印的聚乳酸(pla)支架，其外直径为21.2mm，高度为19mm。

55、作为优选，衬底支架为圆形网状结构，其直径为15-21mm，丝间距为0.1～10mm。

56、作为优选，衬底支架为近场直写高精度3d打印的聚己内酯(pcl)支架，其直径为19mm，丝间距为1mm。

57、作为优选，所述孔板支架为3d打印的聚乳酸(pla)支架，其外直径为35mm，高度为17mm，孔板支架底部与孔板之间的间距为5mm。

58、一种上述任一项所述的具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型在血脑屏障相关药物研发中的应用。

59、作为优选，将所述血脑屏障模型的底部(细胞膜片)悬置于细胞培养基中，向血脑屏障模型内部的细胞培养基(上室)中添加血脑屏障相关药物，通过检测血脑屏障模型外部细胞培养基(下室)中该药物的浓度，进而判断该药物在血脑屏障模型中的渗透效果。

60、本发明的一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型的建立方法，将血脑屏障相关的内皮细胞制备成具有紧密连接结构的细胞膜片，并将细胞膜片与定制尺寸的孔板支架和衬底支架通过水凝胶封装为一个整体并将孔板支架分隔为上下两部分，用于模拟血脑屏障的内外两部分，可以在体外重现血脑屏障的生理功能，观察药物在血脑屏障中的通透性。

61、本发明的一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型的建立方法，构建了一个模拟体内血脑屏障的平台，该平台可以应用于生命科学和临床医学研究中，为神经系统疾病的药物开发以及疾病诊疗提供重要的理论基础。

62、本发明提供了一种具有紧密连接结构的体外血脑屏障模型的建立方法，包括以下步骤：(1)通过产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法培养细胞膜片；(2)打印细胞膜片衬底支架；(3)打印定制化尺寸的孔板支架；(4)通过水凝胶将细胞膜片、衬底支架与孔板支架进行封装。

63、细胞膜片由一种或多种血脑屏障相关细胞组成，可以用来模拟血脑屏障细胞间紧密连接结构；细胞膜片衬底支架用于捞取细胞膜片并为其提供机械支撑；孔板支架可悬架于不同型号的孔板中，将孔板分隔为上下两个腔室。本发明将体外血脑屏障模型的构建、表征、屏障功能以及药物评价等功能集成于一体，可以用于血脑屏障模型的体外模拟以及血脑屏障相关药物测试应用。本发明与现有血脑屏障模型相比，解决了体外血脑屏障模型构建的准确性与简便性之间的矛盾，更接近体内真实环境，提升实验效率，在血脑屏障相关疾病的研究与药物开发中具备良好的应用前景。

64、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

65、(1)本发明的血脑屏障模型与体内的血脑屏障动物模型相比消除了种属差异，通过本平台(血脑屏障模型)获得的实验数据更符合人体的真实情况，提升了血脑屏障药物研发的准确性。

66、(2)本发明的血脑屏障模型与体外的基于微流控芯片的血脑屏障模型相比降低了操作难度和技术门槛。在保证了血脑屏障模型有效性和准确性的前提下，具有操作简便、易于推广的特点，具有巨大的商业价值。

67、(3)本发明的血脑屏障模型与体外的普通transwell小室的血脑屏障模型相比促进细胞之间形成紧密连接结构，具有和人体组织真实情况相似的组织结构，形成了有效的血脑屏障模型。

68、(4)本发明首次体外构建了在组织结构、跨膜电阻数值、通透性、毒药药物反应等方面接近生理条件的血脑屏障，为神经系统疾病的药物开发以及疾病诊疗提供重要研究平台。