与紫色菜花颜色相关的分子标记及其应用

1.本发明涉及生物分子检测及育种领域，具体涉及与紫色菜花颜色相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.菜花，又称花菜、花椰菜或椰菜花，是一种美味且富含营养的常见蔬菜。菜花叶片颜色不同，呈现出不同花色的菜花。相比普通的白色菜花，紫菜花因含有更高水平的植物色素，具有更多的营养价值。因此，选育紫色菜花品种具有很高的实用价值。
3.研究表明菜花中紫色(pr)基因突变后可以呈现出强烈的紫色突变表型。pr基因编码的蛋白是r2r3 myb，属于转录因子，与植物的颜色差异密切相关。(chiu li-wei,et al.the purple cauliflower arises from activation of a myb transcription factor.[j].plant physiol,2010,154:1470-80.)。or基因编码具有富含dnaj cys结构域的蛋白，控制菜花有色体的形成，影响叶片颜色。(lu shan,et al.the cauliflower or gene encodes a dnaj cysteine-rich domain-containing protein that mediates high levels of beta-carotene accumulation.[j].plant cell,2006,18:3594-605.)。通过基因组测序，与参考基因组相比，寻找紫色菜花所具有的特征snp变异及indel变异，进行bsa关联分析，特别是针对pr和or基因上的多态位点进行菜花颜色关联分析，可以鉴定到与紫色菜花相关的多态性位点。
[0004]
竞争性等位基因特异pcr(kasp)技术是近年来应用广泛的、先进的分子标记技术，可以对基因组(dna)中snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。kasp技术检测分子标记的方法是一种低成本、高通量的新型快捷的鉴定方法，在作物育种中应用较为广泛。然而目前尚缺少够区分紫色菜花品种的kasp分子标记。因此，开发菜花紫色颜色相关基因的kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，以及提高我国紫色菜花育种效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供与一种与紫色菜花颜色相关的分子标记及其应用。
[0006]
本发明进一步提供了一种与紫色菜花颜色相关的分子标记，所述分子标记的序列如seq id no:1所示，其中，在所述seq id no:1第51bp处发生t/a突变，第51bp处碱基为t时菜花颜色为紫色；
[0007]
如seq id no:2所示，其中，在所述seq id no:2第56bp处发生a/dela突变，第56bp处碱基为aa时菜花颜色为紫色；
[0008]
如seq id no:3所示，其中，在所述seq id no:3第52bp处发生ins/del突变(ins gccatc/del gccatc)，第56bp处碱基为ins/ins时菜花颜色为紫色；
[0009]
如seq id no:4所示，其中，在所述seq id no:4第102bp处发生ins/del突变，第
102bp处碱基无法扩增时菜花颜色为紫色；
[0010]
一种扩增与菜花紫色颜色相关的分子标记的kasp引物，所述kasp引物包括上游引物1、上游引物2以及下游引物，其中，seq id no:1上游引物1的序列如seq id no:5所示，上游引物2的序列如seq id no:6所示，下游引物的序列如seq id no:7所示。
[0011]
本发明中，进一步的，所述kasp引物包括上游引物1、上游引物2以及下游引物，其中，seq id no:2上游引物1的序列如seq id no:8所示，上游引物2的序列如seq id no:9所示，下游引物的序列如seq id no:10所示。
[0012]
本发明中，进一步的，所述kasp引物包括上游引物1、上游引物2以及下游引物，其中，seq id no:3上游引物1的序列如seq id no:11所示，上游引物2的序列如seq id no:12所示，下游引物的序列如seq id no:13所示。
[0013]
本发明中，进一步的，所述kasp引物包括上游引物1、上游引物2以及下游引物，其中，seq id no:4上游引物1的序列如seq id no:14所示，上游引物2的序列如seq id no:15所示，下游引物的序列如seq id no:16所示。seq id no:1-seq id no:16的具体序列如下：
[0014] sequenceseq id no：1tataccgtttattgttgctgcaacggttgatatatatggtctctatgtat[t/a]tgaacaacaaaacatgtattatctgttttcgtaacacttatgttaattagseq id no：2ttataaagaatttatttaaaaagttgaccaacatgtcatttatgatttaaatttt[a/]gttacagttactacaagaattattctctatttattaactgatcattatagseq id no：3ggctctgatctttactcctaaatgtcttttgaggtatcaaacctctgcttt[gccatc/]gccatcgccaccgttgtctccgcctcctctatctctgccgcctccaccgcseq id no：4gattggagtaaaaacgcccaggcctactagttagtagccttagtgagtaaa[a/g]ttaggttctaagatgataatcgcttctaagtaatacttttcactaattctseq id no：5gaaggtgaccaagttcatgctcggttgatatatatggtctctatgtattseq id no：6gaaggtcggagtcaacggattcggttgatatatatggtctctatgtataseq id no：7gtgttacgaaaacagataatacatgttttgttgseq id no：8gaaggtgaccaagttcatgcttgaccaacatgtcatttatcatttaaattttaseq id no：9gaaggtcggagtcaacggattgaccaacatgtcatttatgatttaaattttgseq id no：10cagttaataaatagagaataattcttgtagtaactgseq id no：11gaaggtgaccaagttcatgctacaacggtggcgatggcgseq id no：12gaaggtcggagtcaacggattagacaacggtggcgatggcaseq id no：13ttactcctaaatgtcttttgaggtatcaaacseq id no：14gaaggtgaccaagttcatgctttagaagcgattatcatcttagaacctaatseq id no：15gaaggtcggagtcaacggatttagaagcgattatcatcttagaacctaacseq id no：16gagtaaaaacgcccaggcctact
[0015]
一种鉴定紫色菜花颜色的方法，包括如下步骤：
[0016]
(1)提取菜花叶片基因组dna，以所述基因组dna为模板，设计引物，pcr扩增获得seq id no：1所示的产物；seq id no：2所示的产物；seq id no：3所示的产物；seq id no：4所示的产物；
[0017]
(2)对所述产物进行分析或测序；
[0018]
(3)结果判定：
[0019]
在所述seq id no：1第51bp处碱基为t时菜花颜色为紫色；在所述seq id no：2第56bp处碱基为aa时菜花颜色为紫色；在所述seq id no：3第52bp处碱基为ins/ins时菜花颜色为紫色；在所述seq id no：4第102bp处发生ins/del突变，第102bp处碱基无法扩增时菜花颜色为紫色；
[0020]
本发明中，进一步的，所述kasp引物在鉴定与菜花叶片颜色相关的snp多态性及基因型产品中的应用。
[0021]
本发明中，进一步的，该分子标记在菜花育种中的应用。
[0022]
综上所述，本技术的有益效果：
[0023]
可在幼苗阶段对菜花颜色进行准确预测，kasp基因分型技术可以大批量检测应用，有助于提高紫色菜花品种的鉴定效率，缩短鉴定时间。
附图说明
[0024]
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0025]
图1为基因分型图示例；
[0026]
图2为为琼脂糖凝胶电泳检测抽取的96份样品的dna条带；
[0027]
图3bsa分析的可视化结果；
[0028]
图4为p02-636多态位点的kasp检测分型图；
[0029]
图5为p04-958多态位点(左a)和p09-648多态位点(右b)kasp检测分型图；
[0030]
图6为pr06-571位点kasp检测分型图。
具体实施方式
[0031]
下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
[0032]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
[0033]
一、实验方案和检测流程
[0034]
1.1 dna提取
[0035]
采用常规的ctab法对163份菜花叶片样品进行dna提取。通过微量分光光度对dna样品进行质检和dna浓度测定，同时通过琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。
[0036]
1.2 bsa混池构建和基因组重测序
[0037]
对紫、白、黄每个颜色的菜花，分别取30个体，用nanodrop对提取的dna进行浓度测定，对30个个体的dna等量混合；使用ultra
tm
dna library prep kit for(neb,usa)试剂盒构建paired-end测序文库，文库插入片段长度350bp。使用illumina hiseq测序平台进行高通量测序，序列读长150bp；使用fastqc对原始数据进行质控，包括对原始序列进行去接头、删除低质量的reads；最终，生成每个颜色的花菜的clean数据。
[0038]
1.3变异位点检测
[0039]
利用bwa软件将经过质控的reads与botrytis型菜花(brassica oleracea var.botrytis cv.korso)的参考基因组序列进行比对(基因组序列下载自：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5392466)；利用picard软件去除测序过程中pcr产生的重复；使用gatk软件检测出不同颜色菜花与参考基因组相比所具有的snp变异及indel变异，并分别用gatk的variantfiltration模块和vcftools软件对变异结果质控过滤，去掉低质量变异结果，并生成最终的vcf文件。
[0040]
1.4 pr与or基因内部的变异位点
[0041]
根据1.3产生的vcf文件，抽取pr与or两个基因内部及上下游1kb区间内所检测出
的所有snp和indel变异位点。使用的shell命令为“tabix all_three_cultivar.clean.vcf.gz c06:41795078-41798687》pr_bolk_6g38820_plus1kb.vcf；tabix all_three_cultivar.clean.vcf.gz c09:4798004-4801986》or_bolk_9g07710_plus1kb.vcf”。
[0042]
1.5 bsa关联分析
[0043]
选择具有极端表型的个体进行混样，通过比较不同极端混样池之间的多态性并结合表型进行目标基因的定位。具体来讲，主要是寻找混池之间基因型频率的显著差异，用δ(snp-index)统计。标记snp与性状关联度越强，δ(snp-index)越接近于1。根据vcf文件中检测出的变异位点，利用qtl-seq方法中的qtlplot软件分别计算黄、白、紫色三个性状混池样本的snp-index，并且分别计算黄色与白色、紫色与白色极端性状混池之间的频率差值，即δ(snp-index)。挑出δ(snp-index)超过99％阈值且值接近于1所对应的snp区间。
[0044]
1.6 snp/indel位点引物设计和合成
[0045]
根据步骤1.4和1.5关联分析得到的snp或者indel位点，设计kasp检测引物。具体步骤为，获取snp/indel位点侧翼的基因组序列，序列长度不低于100bp。根据序列分别设计了两个正向引物和一个通用反向引物(kasp标记引物)。本项目涉及的snp/indel位点序列和相应的引物序列见结果部分。两个正向引物的3’端最后一个碱基分别对应snp位点的两个基因型，5’端分别带有fam或hex荧光基团的接头序列。引物合成后，将每组引物的两个正向引物和反向引物混合，作为pcr扩增引物进行后续pcr扩增。
[0046]
1.7 snp分型实验步骤
[0047]
1.7.1 dna样品在pcr板上排列
[0048]
将要检测的基因组dna样品按照一定顺序加入任何合适的pcr板上。推荐每孔基因组dna用量为4-10ng。
[0049]
1.7.2 pcr反应体系配置
[0050]
pcr反应体系中包含4个部分，分别为kasp 2xmix、snp primer mix、dna样品和无菌水。计算每一个snp引物需要的反应数目(需包含必需的对照)，进一步根据表1计算反应需要的总体积。将kasp 2xmix和primer mix轻微斡旋混匀，离心后吸出需求的量加到一个新的离心管中，同时加入等比例量的无菌水。盖上管盖，轻微斡旋混匀，离心，然后将pcr反应液分装到pcr板上。加盖封板膜，离心。
[0051]
表1.基因分型系统pcr扩增体系构成
[0052]
名称5μl反应体系kasp 2xmix2.5μlsnp primer mix0.07μldna样品25-100ng
[0053]
1.7.3 pcr扩增程序设定和扩增
[0054]
通常使用的pcr扩增程序如表2所示，该pcr程序能够提高pcr扩增的特异性和准确性。在特殊情况下，也可使用如下程序进行扩增：95℃预变性10min，然后95℃变性20s,57℃退火和延伸45s，共计40个循环。pcr热循环扩增可在任何合适的pcr基因扩增仪上进行。
[0055]
表2.基因分型pcr扩增热循环条件
[0056][0057]
1.7.4荧光值读取
[0058]
pcr扩增循环结束后，在35℃的环境下，利用荧光定量pcr仪读取荧光值。kasp基因分型系统使用荧光团fam和hex来区分两个等基因位点。rox用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。
[0059]
1.7.5数据分析和基因型数据获取
[0060]
我们利用第三方独立软件对步骤4的结果数据进行分析。在该软件中，hex和fam数据分别绘制在x轴和y轴上。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型，具体如图1所示。
[0061]
二、测试结果
[0062]
2.1 dna质检和混池构建
[0063]
分别采用nanodrop和琼脂糖凝胶电泳对提取的dna样品进行浓度测定和完整性检测。nanodrop检测显示，所有样品浓度都达到预定范围，od260/280比值在1.8-2.1之间，符合实验需求，具体dna浓度见表3。琼脂糖凝胶电泳检测显示，抽取的96份样品均具有完整清晰的dna条带，具体见图2。针对每个颜色菜花群体，随机选取30个样品，进行混池构建，具体为每个菜花吸取1.0μg，混合后构建dna测序文库。
[0064]
表3.菜花材料信息及dna提取浓度测定
[0065]
[0066]
[0067]
[0068][0069][0070]
其中，o1-o54为黄色花球(橙色)：编号o，材料为1-7，9-36号；p55-p108为紫色花
球：混样编号p，材料为55-65，67-90号；w109-w163为白色花球：编号w，材料为117-122，124-150，152-153。
[0071]
2.2基因组重测序、变异检测及bsa分析结果
[0072]
每个颜色的花菜分别生成50gb的基因组重测序数据。通过与花菜的参考基因组序列进行比对，过滤掉低质量的变异位点后，共检出1,824,148个snp变异及468,097个indel变异。把三个颜色花菜的变异检测结果整合生成最终的vcf文件，具体结果见压缩文件(all_three_cultivar.clean.vcf.gz)(百度网盘：https://pan.baidu.com/s/16n8sb01ypbf-x8ttldrrua；下载密码：3wy2)。
[0073]
根据vcf文件中检测出的变异位点，利用qtl-seq方法中的qtlplot软件分别计算白、紫色三个性状混池样本的snp-index，并且分别计算黄色与白色、紫色与白色极端性状混池之间的频率差值，即δ(snp-index)。挑出δ(snp-index)超过99％阈值且值接近于1所对应的snp区间，共有95,574个变异位点满足这个要求(详见文件snp_index.p99.tsv.zip)(百度网盘：https://pan.baidu.com/s/16n8sb01ypbf-x8ttldrrua；下载密码：3wy2)。使用r软件对结果进行可视化，结果如图3所示。
[0074]
2.3 pr与or基因内部的变异位点结果
[0075]
根据变异检测生成的vcf文件，抽取pr与or两个基因内部及上下游1kb区间内所检测出的所有snp及indel变异位点。其中，pr基因鉴定出18个变异位点(详见表4)，or基因鉴定出47个变异位点(详见表5)。根据变异检测生成的vcf文件，抽取pr基因内部及上下游1kb区间内所检测出的所有snp及indel变异位点。pr基因鉴定出18个变异位点。
[0076]
表4.pr基因鉴定出18个变异位点
[0077][0078][0079]
表5.or基因鉴定出47个变异位点
[0080]
[0081][0082]
2.4候选snp/indel位点
[0083]
在本项目中，紫菜花特异的等位基因位点是指某一个多态基因位点对应的一个基因型只分布在紫菜花样品中，在黄菜花和白菜花中分布为不同的基因型；同样，黄菜花特异的等位基因位点是指某一个多态基因位点对应的一个基因型只分布在黄菜花样品中，在紫菜花和白菜花中分布为不同的基因型。根据这一标准和bas混池测序结果，在c02、c04、c06、c07和c09号染色体上供筛选获取了15个紫菜花或黄菜花特异的等位基因位点。同时，本项目详细分析了pr和or两个基因上的多态位点，在两个基因上分别获得了1个在3种不同材料之间具有分布差异多态性的位点。对于在3个材料之间分布差异明显的snp位点进行进一步的序列分析和kasp预实验，供选取7个snp位点进行菜花群体实验研究，具体位点信息见表6。7个snp位点对应的kasp引物序列见表7。
[0084]
表6.菜花差异snp/indel位点
[0085][0086][0087]
表7.7个snp位点对应的kasp引物序列
[0088][0089]
2.5 snp/indel kasp分型结果
[0090]
利用表6中的7个snp位点，分别对163份菜花样品进行基因分型，进一步统计各个snp位点对应基因型在不同颜色菜花中的分布频率(表8)。根据基因型分布频率推断snp位点对菜花颜色鉴定的特异性。7个snp位点基因分型结果和分布频率如下：
[0091]
表8.163份菜花样品中7个snp位点对应的基因型
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096][0097]
其中，o1-o54为黄色花球(橙色)：编号o，p55-p108为紫色花球：混样编号p；w109-w163为白色花球：编号w。
[0098]
2.5.1 p02-636
[0099]
p02-636多态位点为a/t，从kasp分型分型结果来看(图4)，所有菜花样品均为a/a
或t/t基因型。从分布频率来看，黄菜花和白菜花所有样品的基因型均为a/a基因型，没有a/t或t/t基因型。在紫菜花中约有28％的样品为a/a基因型，72％的样品为t/t基因型(表9)，这表明p02-636多态位点的t等位基因与菜花色性状具有紧密连锁，该位点的t等位基因可以用来鉴定部分菜花是否为紫色。在紫菜花中，有15个样品为aa基因型，对应的样品编号见表格表12。
[0100]
表9.p02-636多态位点在不同颜色菜花中的分布
[0101]
p02-636a/aa/tt/tnoamptotal黄菜花5300154紫菜花15039054白菜花5300055
[0102]
2.5.2 p04-958
[0103]
p04-958为单碱基缺失型snp位点，等位基因为a和dela。与p02-636多态位点相似，所有样品只有两种基因型，不存在杂合类型(图5a)。从基因型分布频率来看，约98％黄菜花和白菜花基因型均为a碱基缺失纯合基因型，相反只有约19％的紫菜花为a碱基缺失纯合基因型(表10)。在检测样品中，黄菜花和白菜花分别仅有一个样品为aa基因型(两个样品编号为e-206和ss-195)，与黄菜花和白菜花相反，紫菜花约有81％的样品为aa纯合基因型(表10)。因此，p04-958多态位点的a等位基因与菜花色性状具有较高的紧密连锁关系，该位点的a等位基因可以用来鉴定部分菜花是否为紫色。在紫菜花中，有10个样品基因型为dela/dela纯合，对应的样品编号见表格表12。
[0104]
表10.p04-958多态位点在不同颜色菜花中的分布
[0105]
p04-958aaa/deladela/delanoamptotal黄菜花1053054紫菜花44010054白菜花1053055
[0106]
2.5.3 p09-648
[0107]
p09-648为插入缺失型多态位点，等位基因为gccatc 6个碱基的插入或缺失。从kasp分型图来看，该位点具有较好的分型效果(图5b)。基因分型检测结果显示，黄菜花和白菜花样品中没有插入纯合基因型，仅有杂合和缺失纯合基因型(表11)。从基因型分布比例上来看，黄菜花中缺失纯合基因型占比更高，约为90％，相应白菜花中缺失纯合基因型占比约为76％。紫菜花样品的分型结果与黄菜花和白菜花样品正好相反，所有紫菜花样品中没有缺失纯合基因型样品，约83％的样品为插入纯合基因型，17％为杂合基因型。因此，p09-648插入纯合基因型可以用于部分紫菜花品种的鉴定。在紫菜花中，有9个样品基因型为ins/del，对应的样品编号见表格表12。
[0108]
表11.p09-648多态位点在不同颜色菜花中的分布
[0109]
p09-648ins/insins/deldel/delnoamptotal黄菜花0549054紫菜花4590054白菜花01242155
[0110]
进一步对紫菜花样品基因型统计分析发现，p02-636位点15个aa基因型样品中有10个样品与p04-958位点的10个dela/dela基因型样品为相同样品，同时p02-636位点15个aa基因型样品有8个样品与p09-648位点的8个ins/del基因型样品为相同样品(表12)。此外，p04-958位点的10个dela/dela基因型样品与p09-648位点的9个ins/del基因型样品有6个重叠(表12)。这些结果暗示这些样品之间，可能具有相似的遗传背景，可能来源于用同一个杂交组合或者具有共同的亲本材料。
[0111]
表12.在紫菜花样品中p02-636位点aa基因型、p04-958位点dela/dela基因型和p09-648位点ins/del基因型对应的样品统计
[0112][0113][0114]
2.5.4 pr06-571位点
[0115]
pr06-571为插入缺失型位点，等位基因为tgagacact 9个碱基的插入或缺失。从kasp分型图来看，该位点具有较好的分型效果(图6)。基因分型检测结果显示，两个等位基因在三种颜色菜花中均有分布，但是分布频率在三种菜花中具有明显的差异(表13)。所有白菜花都携带有缺失等位基因，约89％的白菜花为tgagacact缺失纯合，约9％的白菜花为杂合。在黄色和紫色菜花样品中，同样存在缺失纯合的基因型，但分布比例较低，分别约为22％和18％，说明缺失纯合的基因型分布更倾向于白色菜花。和白菜花相比，更多的黄菜花携带插入型等位基因，共有约76％黄菜花样品携带有插入型等位基因。同时，紫菜花中也存在一定比例的插入纯合和杂合样品，但比例较低，约为15％。在紫菜花中存在大量未扩增样品，暗示这些紫菜花样品中不存在pr06-571等位基因位点。为证明该猜想，在该位点两侧设计了一对常规pcr扩增引物，分别选取了1个插入纯合、杂合、缺失纯合样品和2个无扩增样品进pcr扩增和电泳检测，结果显示kasp检测无扩增样品在电泳中同样没有扩增条带，这表明部分紫菜花样品中不存pr06-571等位基因位点。
[0116]
表13.pr06-571多态位点在不同颜色菜花中的分布
[0117] ins/insins/deldel/delnoamptotal黄菜花63512154
紫菜花44103654白菜花0549155
[0118]
以上描述仅为本技术的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。