一种具有酪氨酸酶抑制活性的多肽及其制备方法

1.本发明涉及一种具有酪氨酸酶抑制活性的多肽及其制备方法，属于食品加工技术领域。


背景技术：

2.罗非鱼原产自非洲，属热带性鱼类，其养殖遍布140余个国家和地区，是全球第二大养殖鱼品种。中国罗非鱼养殖年产量为162.5万吨，约占世界总年产量的1/4，其中，罗非鱼鱼鳞年产量约30万吨，鱼鳞的利用主要集中在胶原蛋白方面，作为包装保鲜剂延长食品保质期。然而，除鱼鳞中的胶原蛋白能被有效利用外，鱼鳞中的其余组分尤其是鱼鳞肽的利用率不高，鱼鳞总体利用率仅达20％，造成了极大的资源浪费。
3.酪氨酸酶是控制黑色素细胞活性的关键，它决定了黑色素合成的速率，筛选酪氨酸酶抑制剂可以开发美白、祛斑等产品。对于酪氨酸酶的多肽类抑制剂，目前已知的制备方法较少，应用较为普遍的是将样品进行酶解后测定其对酪氨酸酶的抑制活性(cn111748593a)，或事先采用autodock或discovery studio软件将已知结构的物质与酪氨酸酶的活性中心进行分子对接，从中筛选出能够与酪氨酸酶活性中心有效结合的物质，进行化学合成。对酪氨酸酶的多肽类抑制剂多采用超滤膜进行分离纯化(cn108379550a、cn112321701a)，采用rp-hplc进行鉴定(cn110218240a)。这些已知方法所制备得到的肽类组分较复杂，且组分分离不够彻底。同时这些方法操作均十分复杂繁琐，不适合大批量制备生产。


技术实现要素：

4.[技术问题]
[0005]
本发明要解决的技术问题是罗非鱼磷资源浪费，现有筛选、制备酪氨酸酶多肽类抑制剂的方法效率低、步骤繁杂、不适合大批量生成。
[0006]
[技术方案]
[0007]
本发明的目的是提供一种具有酪氨酸酶抑制活性的多肽组合物及其制备方法。本发明通过螯合液的制备、上样洗脱以及旋蒸冻干等方法，得到具有酪氨酸酶抑制活性的多肽组合物，扩大混合多肽粉的应用范围。本发明首次对源于罗非鱼磷的多肽粉中能够成功螯合铜离子的多肽组分进行了洗脱分离，通过生化及细胞实验验证，得到了具有酪氨酸酶抑制活性的多肽组合物，能够有效减少黑色素的生成，有望应用于预防果蔬褐变、开发具有美白功效的化妆品以及治疗黑素瘤疾病等，具有良好的研究和开发价值。
[0008]
本发明提供了一种具有酪氨酸酶抑制活性的多肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
s1、将从罗非鱼磷多肽粉与水按照一定的质量比配成混合多肽液，向混合多肽液中添加无水硫酸铜，在适当的ph值、水浴温度以及时间下螯合，得到多肽—离子螯合溶液；将多肽—离子螯合溶液上样到c18柱；
[0010]
s2、用edta溶液、edta-2na溶液或edta与edta-2na的混合溶液竞争性结合多肽—离子螯合溶液中的金属离子，以洗脱金属离子，然后，用水溶解洗脱留在c18柱上的多肽，得到多肽溶液；
[0011]
s3、将步骤s2得到的多肽溶液进行旋蒸及冻干，得到具有离子螯合能力的多肽。
[0012]
在某些实施方式中，步骤s1所述罗非鱼磷多肽粉是从罗非鱼磷中提取得到的。
[0013]
在某些实施方式中，步骤s1所述罗非鱼磷多肽粉与水的质量比为1:20～1:25。
[0014]
在某些实施方式中，步骤s1所述罗非鱼磷多肽粉与无水硫酸铜的质量比为4:1～7:1。
[0015]
在某些实施方式中，步骤s1所述ph值为5～7。
[0016]
在某些实施方式中，步骤s1所述螯合时间为50～70min。
[0017]
在某些实施方式中，步骤s1所述的多肽—离子螯合溶液肽的上样量不超过c18柱填料体积的3倍。
[0018]
在某些实施方式中，步骤s2所述的edta洗脱目的在于除去多肽—离子螯合溶液中的离子。
[0019]
在某些实施方式中，步骤s2所述的edta溶液、edta-2na溶液或edta与edta-2na的混合溶液的浓度为10％～20％。
[0020]
在某些实施方式中，步骤s3所述的旋蒸温度为60～65℃。
[0021]
在某些实施方式中，步骤s3所述的冻干温度为-30～-40℃。
[0022]
在某些实施方式中，步骤s3冻干过程中加入适量的甘露醇作为保护剂，可使冻干效果更好，同时，样品的复溶性更好。冻干保护剂用量为5％。
[0023]
本发明提供按照上述方法制备得到的具有酪氨酸酶抑制活性的多肽组合物。
[0024]
本发明还提供所述多肽组合物在抑制酪氨酸酶活性中的应用。
[0025]
本发明还提供所述多肽组合物在抑制果蔬褐变中的应用。
[0026]
[有益效果]
[0027]
1、本发明首次从罗非鱼磷多肽粉中分离出能够与铜离子进行螯合的多肽组分，该组分生理活性稳定、易于贮藏。
[0028]
2、本发明从罗非鱼磷多肽粉中分离出的多肽组合物具有螯合铜离子的能力，生化实验及细胞实验的结果表明，该组合物能够有效抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的生成，且抑制活性优于熊果苷。
[0029]
3、本发明从罗非鱼鳞多肽粉中经过c18柱纯化得到能够抑制酪氨酸酶的组合物，不仅使鱼鳞肽资源得到充分利用，提升其经济价值，并且，采用柱层析法进行上样洗脱，便捷高效。大批量上样可得到大量离子螯合物，使螯合制备过程中原料成本大大降低，螯合率大幅提高，大大节省了人力和资源，实现规模化生产。
[0030]
4、本发明采用化学筛选方式从罗非鱼鳞多肽粉中筛选得到能够抑制酪氨酸酶的组合物，无需进行分子对接，实现快速高效筛选，大大节省了人力和资源。
附图说明
[0031]
图1是对多肽样品进行的液相色谱分析结果。
[0032]
图2是多肽对酪氨酸酶抑制作用的生化实验验证验证结果。(a)：空白组，(b)：阴性
对照组，(c)：阳性对照组，(d)：样品组；(a)：土豆切片刚刚涂抹相应药品时，(b)：土豆切片涂抹相应药品并放置两天。
[0033]
图3是采用微量比色法来检测样品对酪氨酸酶的抑制活性的测定结果。
[0034]
图4是多肽作用于小鼠黑素瘤细胞的形态学观察结果。(a)：空白组，(b)：50μg
·
ml-1
熊果苷，(c)：20μg
·
ml-1
多肽样品，(d)：50μg
·
ml-1
多肽样品。
[0035]
图5是未经本发明方法处理的罗非鱼鳞多肽粉对酪氨酸酶活性的影响情况。
具体实施方式
[0036]
下述实施例所使用的罗非鱼鳞多肽粉采购自青岛益和兴食品有限公司。
[0037]
下述实施例所使用的c18柱填料购自苏州纳微科技股份有限公司，将c18填料填置于具砂板闪式层析柱中进行实验。
[0038]
下述实施例所使用的金离子螯合率测定方法是：pan指示剂滴定法。蒸馏溶解螯合物，加入pan指示剂，用edta滴定，当溶液颜色从紫红变成淡黄色时即为滴定终点，记录此时消耗的edta体积为v1，ml。采用同样方法直接滴定螯合离子溶液(含螯合物及未螯合的肽、金属离子)，记录此时消耗的edta的体积为v0，ml。
[0039]
金属离子的螯合率＝v1/v0×
100％。
[0040]
实施例1
[0041]
s1、将罗非鱼鳞多肽粉与水按照1:25质量比配成多肽液，得到混合多肽液，加入多肽粉质量的1/6的无水硫酸铜固体，调整ph值为6、在水浴温度50℃孵育50min，得到多肽—离子螯合溶液。随后，通过pan指示剂滴定法进行金属离子螯合率测定，经测定，离子螯合率为37～40％。
[0042]
s2、将步骤s1所制备得到的多肽—离子螯合溶液采用c18柱进行上样洗脱。具体地，先利用甲醇对c18柱进行平衡，然后上样，多肽—离子螯合溶液的上样量为柱体积的3倍，加入浓度为0.2mol/l的edta溶液对组分中的金属离子进行洗脱(edta竞争性结合多肽—离子螯合物中的金属离子，使得原本与多肽螯合的铜离子转而与edta螯合，并随edta溶液一起流出)，洗脱体积为柱体积的3倍，用水溶解收集c18柱上的剩余多肽组分，得到具有金属离子螯合能力的多肽溶液。
[0043]
s3、将上述经edta洗脱后的样品溶液于60℃进行旋蒸，然后于-30～-40℃冻干，得到具有离子螯合能力的多肽。
[0044]
对比例1不经过无水硫酸铜螯合，直接用于c18柱洗脱
[0045]
s1、将罗非鱼鳞多肽粉与水按照1:25质量比配成多肽液，得到混合多肽液。不经过无水硫酸铜螯合，直接用于c18柱洗脱。
[0046]
s2、将步骤s1所制备得到的多肽—离子螯合溶液采用c18柱进行上样洗脱。具体地，先利用甲醇对c18柱进行平衡，然后上样，多肽溶液的上样量为柱体积的3倍，用水溶解收集c18柱上的多肽组分，得到经c18柱洗脱后的多肽溶液。
[0047]
随后，再将经c18柱洗脱后的多肽溶液与无水硫酸铜进行螯合，具体地，是加入与罗非鱼鳞多肽粉质量比为1:6的无水硫酸铜固体，调整ph值为6、在水浴温度50℃孵育50min，得到多肽—离子螯合溶液。经测定，多肽—离子螯合溶液的离子螯合率为23～30％。即不经过无水硫酸铜螯合，直接用c18柱对样品进行洗脱会降低洗脱物对金属离子的螯合
率，从而降低多肽样品与金属离子的螯合能力，使得能够与酪氨酸酶活性中心的金属离子进行有效结合的概率减少，对酪氨酸酶的抑制活性随之降低。
[0048]
实施例2
[0049]
s1、将罗非鱼鳞多肽粉与水按照1:25质量比配成多肽液，得到混合多肽液，加入与多肽粉质量比为1:6的无水硫酸铜固体，调整ph值为6、在水浴温度50℃孵育50min，得到多肽—离子螯合溶液。
[0050]
s2、将步骤s1所制备得到的多肽—离子螯合溶液采用c18柱进行上样洗脱。具体地，先利用甲醇对c18柱进行平衡，然后上样，多肽—离子螯合溶液的上样量为柱体积的3倍，加入浓度为0.2mol/l的edta溶液对组分中的金属离子进行洗脱，洗脱体积为柱体积的3倍，用水溶解收集c18柱上的剩余多肽组分，得到具有金属离子螯合能力的多肽溶液。
[0051]
s3、将经edta洗脱后的样品溶液于60℃进行旋蒸，然后于-30～-40℃冻干，冻干过程中加入5％的甘露醇作为保护剂，得到具有离子螯合能力的多肽。所得样品颗粒均匀，冻干效果好，同时，样品的复溶性更好，不会出现分层的情况。
[0052]
对比例2
[0053]
与实施例2的区别在于，s3冻干过程中不加入保护剂。所得样品颗粒粗糙不够均一，将样品进行复溶，会出现样品与溶液分层的情况。
[0054]
实施例1步骤3所得多肽对土豆褐变的抑制作用：
[0055]
在大小及厚度统一的土豆片表面分别涂抹相应药品，a组为空白组，表面涂抹去离子水；b组为阴性对照组，表面涂抹5mg/ml的l-tyr溶液；c组为阳性对照组，表面涂抹5mg/ml的熊果苷溶液；d组为多肽样品组，表面涂抹实施例1中制备的具有金属离子螯合能力的多肽样品溶液(注：b、c、d所涂抹的样品浓度相同，均为5mg/ml)，观察经过48h后土豆片的褐变情况。根据土豆褐变的程度判断其对酪氨酸酶的抑制作用。实验结果如图2所示，结果表明，具有离子螯合能力的多肽组分能够明显抑制土豆的褐变情况，根据对土豆褐变情况的观察，多肽样品对酪氨酸酶的抑制效果优于阳性对照组熊果苷。
[0056]
实施例1步骤3所得多肽对酪氨酸酶活性的抑制作用
[0057]
将实施例1中的20μg多肽样品或标准品熊果苷分别与酪氨酸酶及底物酪氨酸充分混匀后，立即测定其在10s时在475nm下的吸光度，记为a1，之后迅速将其放入37℃水浴3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为a2。计算δa＝a2-a1。根据计算酪氨酸酶酶活(u/ml)＝δa
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109÷
v样
÷
t
[0058]
ε：多巴色素的摩尔消光系数；
[0059]
d：比色皿光径，单位:cm
[0060]
v反总：反应总体积，单位：ml
[0061]
v样：加入的样本体积，单位:ml
[0062]
t：反应时间，单位:min
[0063]
实验结果如图3所示，本发明制备出的具有金属离子螯合能力的多肽对酪氨酸酶具有明显的抑制作用。与同浓度的阳性对照熊果苷相比，具有金属离子螯合能力的多肽样品对酪氨酸酶的抑制作用更强。随后，选取了不同浓度的样品溶液进行酪氨酸酶活性测定，浓度分别为2mg/ml和5mg/ml，结果表明，随着样品浓度的增高，其对酪氨酸酶的抑制作用增强。
[0064]
实施例1步骤3所得多肽作用于小鼠黑素瘤b16f10细胞
[0065]
b16-f10细胞经传代后，大多以两级形态常见。
[0066]
空白组：只加入细胞培养液，经显微镜观察，细胞生长状态较好，形态上无明显变化。
[0067]
对照组：加入已经过滤除菌后浓度为50μg/ml的熊果苷溶液。
[0068]
实验组：加入已经过滤除菌后浓度分别为20和50μg/ml的实施例1中的多肽样品的溶液。
[0069]
经显微镜观察，当不同浓度α-arbutin及多肽样品加入时，细胞形态会出现不同程度变化，随着给药浓度的增加，细胞分布开始变得稀疏，不再形成密集的网状结构，细胞出现明显变形，实验组及对照组均明显抑制了细胞的生长，且实验组抑制细胞生长的效果更为明显。同时，实验结果也表明b16-f10细胞对样品具有浓度依赖性。实验结果如图4所示。
[0070]
对比例3
[0071]
直接检测从青岛益和兴食品有限公司购买的罗非鱼鳞多肽粉对酪氨酸酶活性的抑制作用，检测方法与“实施例1步骤3所得多肽对酪氨酸酶活性的抑制作用”中的检测方法相同，空白组未添加多肽。实验结果如图5所示，酶活性测定结果表明，未经处理的多肽粉对酪氨酸酶活性不具有抑制作用，相反，会激发酪氨酸酶的活性。
[0072]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。